PCR的基本步驟及注意

/DNA聚合酶（DNApolymeraseI）最早于1955年發(fā)現(xiàn)，而較具有實(shí)驗(yàn)價(jià)值與實(shí)用性的KlenowfragmentofE.Coli則是于70年代的初期由Dr.H.Klenow所發(fā)現(xiàn)，但由于此酶不耐高溫，高溫能使之變性,因此不符合使用高溫變性的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)?，F(xiàn)今所使用的酶(簡(jiǎn)稱Taqpolymerase),則是于1976年從溫泉中的細(xì)菌（Thermusaquaticus）分離出來(lái)的。它的特性就在于能耐高溫，是一個(gè)很理想的酶，但它被廣泛運(yùn)用則于80年代之后。PCR最初的原始雛形概念是類似基因修復(fù)復(fù)制，它是于1971年由Dr.KjellKleppe提出。他發(fā)表了第一個(gè)單純且短暫性基因復(fù)制（類似PCR前兩個(gè)周期反應(yīng)）的實(shí)驗(yàn)。而現(xiàn)今所發(fā)展出來(lái)的PCR則于1983由Dr.KaryB.Mullis發(fā)展出的，Dr.Mullis當(dāng)年服務(wù)于PE公司，因此PE公司在PCR界有著特殊的地位。Dr.Mullis并于1985年與Saiki等人正式發(fā)表了第一篇相關(guān)的論文。此后，PCR的運(yùn)用一日千里，相關(guān)的論文發(fā)表質(zhì)量可以說(shuō)是令眾多其它研究方法難望其項(xiàng)背。隨后PCR技術(shù)在生物科研和臨床應(yīng)用中得以廣泛應(yīng)用，成為分子生物學(xué)研究的最重要技術(shù)。Mullis也因此獲得了1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。PCR原理DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時(shí)也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過(guò)溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，加入設(shè)計(jì)引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。但是，DNA聚合酶在高溫時(shí)會(huì)失活，因此，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶，不僅操作煩瑣，而且價(jià)格昂貴，制約了PCR技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合酶--Taq酶對(duì)于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個(gè)循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡(jiǎn)捷、同時(shí)也大大降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用，并逐步應(yīng)用于臨床。PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基互補(bǔ)配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過(guò)程就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。編輯本段[PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件]1.標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系10×擴(kuò)增緩沖液 10μl 4種dNTP混合物 200μl 引物 10～100μl 模板DNA 0.1～2μg TaqDNA聚合酶 2.5μl Mg2+ 1.5mmol/L 加雙或三蒸水 100μl PCR反應(yīng)五要素：參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即:引物(PCR引物為DNA片段，細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的引物為一段RNA鏈)、酶、dNTP、模板和緩沖液（其中需要Mg2+)。引物有多種設(shè)計(jì)方法，與PCR在實(shí)驗(yàn)中的目的決定。但基本原則相同PCR所用的酶主要有兩種來(lái)源：Taq和Pfu。分別來(lái)自兩種不同的噬熱菌。其中Taq擴(kuò)增效率高但易發(fā)生錯(cuò)配。Pfu擴(kuò)增效率弱但有糾錯(cuò)功能。所以實(shí)際使用時(shí)根據(jù)需要必須做不同的選擇模板即擴(kuò)增用的DNA，可以是任何來(lái)源，但有兩個(gè)原則，第一純度必須較高，第二濃度不能太高以免抑制緩沖液的成分最為復(fù)雜，除水外一般包括四個(gè)有效成分：緩沖體系，一般使用HEPES或MOPS緩沖體系；一價(jià)陽(yáng)離子，一般采用鉀離子，但在特殊情況下也可使用銨根離子；二價(jià)陽(yáng)離子，即鎂離子，根據(jù)反應(yīng)體系確定，除特殊情況外不需調(diào)整；輔助成分，常見(jiàn)的有DMSO、甘油等，主要用來(lái)保持酶的活性和幫助DNA接觸纏繞結(jié)構(gòu)2、PCR引物設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)中有兩條引物，即5′端引物和3′引物。設(shè)計(jì)引物時(shí)以一條DNA單鏈為基準(zhǔn)（常以信息鏈為基準(zhǔn)），5′端引物與位于待擴(kuò)增片段5′端上游的一小段DNA序列相同；3′端引物與位于待擴(kuò)增片段3′端的一小段DNA序列互補(bǔ)。引物設(shè)計(jì)的基本原則①引物長(zhǎng)度：15-30bp，常用為20bp左右。②引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。③引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補(bǔ)序列。④兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其是避免3′端的互補(bǔ)重疊。⑤引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不要超過(guò)70%，引物3′末端連續(xù)8個(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。⑥引物3‘端的堿基，特別是最末與倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，最佳選擇是G和C。⑦引物的5′端可以修飾。如附加限制酶位點(diǎn)，引入突變位點(diǎn)，用生物素、熒光物質(zhì)、地高辛標(biāo)記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。v引物設(shè)計(jì)軟件PrimerPremier5.0（自動(dòng)搜索）*vOligo6（引物評(píng)價(jià)）vVectorNTISuitvDNAsisvOmigavDNAstarvPrimer3（在線服務(wù)）3、模板的制備PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。模板的取材主要依據(jù)PCR的擴(kuò)增對(duì)象，可以是病原體標(biāo)本如病毒、細(xì)菌、真菌等。也可以是病理生理標(biāo)本如細(xì)胞、血液、羊水細(xì)胞等。法醫(yī)學(xué)標(biāo)本有血斑、精斑、毛發(fā)等。標(biāo)本處理的基本要求是除去雜質(zhì)，并部分純化標(biāo)本中的核酸。多數(shù)樣品需要經(jīng)過(guò)SDS和蛋白酶K處理。難以破碎的細(xì)菌，可用溶菌酶加EDTA處理。所得到的粗制DNA，經(jīng)酚、氯仿抽提純化，再用乙醇沉淀后用作PCR反應(yīng)模板。4、PCR反應(yīng)條件的控制①PCR反應(yīng)的緩沖液提供合適的酸堿度與某些離子②鎂離子濃度總量應(yīng)比dNTPs的濃度高，常用1.5mmol/L③底物濃度dNTP以等摩爾濃度配制，20～200umol/L④TaqDNA聚合酶2.5U（100ul）⑤引物濃度一般為0.1～0.5umol/L⑥反應(yīng)溫度和循環(huán)次數(shù)變性溫度和時(shí)間95℃，30s退火溫度和時(shí)間低于引物Tm值5℃左右，一般在45～55℃延伸溫度和時(shí)間72℃，1min/kb（10kb內(nèi)）Tm值=4(G+C)＋2(A+T)循環(huán)次數(shù):一般為25～30次。循環(huán)數(shù)決定PCR擴(kuò)增的產(chǎn)量。模板初始濃度低，可增加循環(huán)數(shù)以便達(dá)到有效的擴(kuò)增量。但循環(huán)數(shù)并不是可以無(wú)限增加的。一般循環(huán)數(shù)為30個(gè)左右，循環(huán)數(shù)超過(guò)30個(gè)以后，DNA聚合酶活性逐漸達(dá)到飽和，產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加，出現(xiàn)了所謂的“平臺(tái)期”。編輯本段［PCR步驟］標(biāo)準(zhǔn)的PCR過(guò)程分為三步：1.DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA2.退火（25℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。每一循環(huán)經(jīng)過(guò)變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍?，F(xiàn)在有些PCR因?yàn)閿U(kuò)增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時(shí)間內(nèi)復(fù)制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時(shí)在60℃-65℃間進(jìn)行，以減少一次升降溫過(guò)程，提高了反應(yīng)速度。PCR檢測(cè)PCR反應(yīng)擴(kuò)增出了高的拷貝數(shù)，下一步檢測(cè)就成了關(guān)鍵。熒光素（溴化乙錠，EB）染色凝膠電泳是最常用的檢測(cè)手段。電泳法檢測(cè)特異性是不太高的，因此引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判。但因?yàn)槠浜?jiǎn)捷易行，成為了主流檢測(cè)方法。近年來(lái)以熒光探針為代表的檢測(cè)方法，有逐漸取代電泳法的趨勢(shì)。PCR反應(yīng)特點(diǎn)特異性強(qiáng)PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；②堿基配對(duì)原則；③TaqDNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性；④靶基因的特異性與保守性。其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合與引物鏈的延伸是遵循堿基配對(duì)原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性與TaqDNA聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合(復(fù)性)可以在較高的溫度下進(jìn)行，結(jié)合的特異性大大增加，被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過(guò)選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。靈敏度高PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12)量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克(μg=-6)水平。能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞；在病毒的檢測(cè)中，PCR的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU(空斑形成單位)；在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌。簡(jiǎn)便、快速PCR反應(yīng)用耐高溫的TaqDNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴(kuò)增液和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在2～4小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無(wú)放射性污染、易推廣。對(duì)標(biāo)本的純度要求低不需要分離病毒或細(xì)菌與培養(yǎng)細(xì)胞，DNA粗制品與RNA均可作為擴(kuò)增模板?？芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等DNA擴(kuò)增檢測(cè)。PCR的循環(huán)參數(shù)1、預(yù)變性（Initialdenaturation）．模板DNA完全變性與PCR酶的完全激活對(duì)PCR能否成功至關(guān)重要，建議加熱時(shí)間參考試劑說(shuō)明書(shū)，一般未修飾的Taq酶激活時(shí)間為兩分鐘。2、循環(huán)中的變性步驟循環(huán)中一般95℃，30秒足以使各種靶DNA序列完全變性，可能的情況下可縮短該步驟時(shí)間變性時(shí)間過(guò)長(zhǎng)損害酶活性，過(guò)短靶序列變性不徹底，易造成擴(kuò)增失敗。3、引物退火（Primerannealing）退火溫度需要從多方面去決定，一般根據(jù)引物的Tm值為參考，根據(jù)擴(kuò)增的長(zhǎng)度適當(dāng)下調(diào)作為退火溫度。然后在此次實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上做出預(yù)估。退火溫度對(duì)PCR的特異性有較大影響。4、引物延伸引物延伸一般在72℃進(jìn)行（Taq酶最適