DNMT3B基因啟動(dòng)子C46359T多態(tài)性與食管癌易感性的關(guān)聯(lián)分析-0

1/1DNMT3B基因啟動(dòng)子C46359T多態(tài)性與食管癌易感性的關(guān)聯(lián)分析DNMT3B基因啟動(dòng)子C46359T多態(tài)性與食管癌易感性的關(guān)聯(lián)分析DNMT3B基因啟動(dòng)子C46359T多態(tài)性與食管癌易感性的關(guān)聯(lián)分析【摘要】目的：

探討DNMT3B基因啟動(dòng)子C46359T單核苷酸多態(tài)性與江蘇漢族人群食管癌易感性的關(guān)系。

方法：

提取195例食管癌患者及１89例健康體檢人員外周血基因組DNA，采用PCRRFLP結(jié)合DNA測(cè)序技術(shù)檢測(cè)DNMT3B基因啟動(dòng)子C46359T單核苷酸多態(tài)性。

結(jié)果：

正常對(duì)照DNMT3BC46359T等位基因TT/CT基因型頻率為%/%,病例組為%/%，在對(duì)照組與病例組中均未匍檢測(cè)到DNMT3B463蟲59CC基因型。

攜帶DN盆MT3B46359CT等位基因的個(gè)體與對(duì)照組相比蝽，其患食管癌的易感性未見あ明顯升高(Ｐ=,OR=，95%CI：

～)。

對(duì)比江啵蘇漢族人群和英國、美國白鳳種人群，DNMT3BC4鮚6359T單核苷酸多態(tài)性歟頻率分布有明顯差異(Ｐ【痢關(guān)鍵詞】DNA甲基轉(zhuǎn)移池酶3B食管癌單核苷酸多態(tài)搛性腫瘤的病因?qū)W，尤其是冕其與某些遺傳性疾患關(guān)系的氡研究已表明,大多數(shù)人類惡性腫瘤是由環(huán)境因素作用于昆遺傳物質(zhì)的結(jié)果［1］，遺鷴傳因素越來越被認(rèn)為是癌癥佧發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的主要因素之一［科23］。

盡管有些基因突變可以導(dǎo)致腫瘤，但是對(duì)于寮大多數(shù)人來說，患腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)可能來自于相對(duì)常見的低喧外顯率的疾病相關(guān)多態(tài)性的微差異［3］。

腫瘤不僅是遺筢傳性疾病，同時(shí)也是由基因羥轉(zhuǎn)錄沉默所引起的表觀遺傳梨性疾病。

在一些人類腫瘤細(xì)闃胞中，啟動(dòng)子區(qū)CpG島的鳘重新甲基化可能是腫瘤抑制鐳基因失活的機(jī)制［4］。

D舳NA甲基化的異常是最常見的表觀遺傳學(xué)改變，DNA嗟甲基化是由一組DNA甲基≌轉(zhuǎn)移酶(DNAmethyltransferase就，DNMT)家族催化的，鈺目前在哺乳動(dòng)物中確定的D緣NMT有DNMT1、DN一MT3A和DNMT3B［腱57］。

其中，DNMT岬1主要負(fù)責(zé)維持甲基化，而黨DNMT3A和DNMT3哐B主要負(fù)責(zé)重新甲基化［6琿，8］。

DNMT3B在腫鏢瘤形成過程中起重要作用，鑒已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞中存在DNMT3B的高表達(dá)［5痣］。

DNMT3B基因定位港于20號(hào)染色體，在距轉(zhuǎn)錄螻起始位點(diǎn)-149堿基對(duì)的科啟動(dòng)子區(qū)含有CT轉(zhuǎn)換多誕態(tài)性，體外實(shí)驗(yàn)表明，該位寮點(diǎn)的轉(zhuǎn)換可以使DNMT3B啟動(dòng)子的活性增加30%［9］。

食管癌是世界上躉最常見的惡性腫瘤之一，其派發(fā)病率在發(fā)展中國家居第5位，我國的食管癌死亡率居┖世界首位［10］。

早期食狠管癌經(jīng)手術(shù)切除后5年生存爺率可達(dá)90％以上，而中晚璞期患者僅為6％～15％［踉1112］。

如果能夠做獫到早期診斷或易感風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估熄，則有可能降低食管癌的死亡率。

本研究選擇江蘇地區(qū)竹漢族人群，探討DNMT3速B基因C46359T位點(diǎn)蘑基因多態(tài)性與該地區(qū)人群食霪管癌遺傳易感性之間的關(guān)聯(lián)旺。

1材料和方法材嬙料病例組選自XX年2月襻～XX年7月在江蘇省腫瘤呸醫(yī)院、南京軍區(qū)南京總醫(yī)院保存的食管癌病人血液樣本雪195例，其中男153例遨，女42例，所有病例臨床資料完整。

血液標(biāo)本采集前均未有抗腫瘤藥物使用記錄箋。

對(duì)照組為健康人血液樣本閿189例，其中性別、年齡匡等均與病例組相匹配，男1滄35例，女54例,見表1Ю。

兩組人群均系江蘇地區(qū)漢綿族人群，個(gè)體之間均無血緣燉關(guān)系。

方法基因組耵DNA抽提采集靜脈全血2ml，乙二胺四乙酸二鉀鵒(EDTAK2)抗凝，曦常規(guī)蛋白酶K消化后苯酚／硬氯仿抽提，乙醇沉淀法提取基因組DNA［6］，總共滌提取食管癌患者、健康正常人外周血DNA384例，滏提取的DNA溶解于TE中荒，4℃保存。

表1病例組崠與對(duì)照組樣本間年齡和性別轄分布頻率比較例注：

括弧忙中為所占百分比PCR胳PCR引物序列見文獻(xiàn)［1楮3］，上游5TGCT崧GTGACAGGCAGA瘐GCAG3(nt46稃15146170)，下盥游5GGTAGCCG呂GGAACTCCACGG頁3(nt46530酰46511)，擴(kuò)增產(chǎn)物3慵80bp。

25l反應(yīng)體系含dNTPsL-1，承上下游引物各10pmol噢，TaqDNA聚合酶1．嗟25U，l(100ng匡)，L-1。

95℃預(yù)變摩性5min；95℃30s紅，69℃30s，共32個(gè)寨循環(huán)，最后72℃延伸10險(xiǎn)min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠礦染色觀察。

限制性內(nèi)切嫂酶BlnⅠ酶切反應(yīng)20蛛l酶切反應(yīng)體系含10科KBufferl，Bl炯nⅠ(TaKaRa公司)4U，PCR產(chǎn)物l，混米勻后37℃水浴中酶切過夜♀。

酶切產(chǎn)物于％瓊脂糖凝膠廨電泳分析基因型。

DN俁A序列測(cè)定選擇凝膠電泳溜證實(shí)為CT基因型、TT基蹯因型各2例，由南京金思特公司經(jīng)雙脫氧鏈終止法測(cè)序。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)踉行卡方檢驗(yàn)，計(jì)算Ｐ值、O筅R值和95%CI。

2惜結(jié)果一般資料的統(tǒng)計(jì)學(xué)譯檢驗(yàn)經(jīng)雙側(cè)卡方檢驗(yàn)，在病例與對(duì)照組中，年齡在40～60歲和60歲的分謾別為%/%和%/%，男、〖女分別為%/%和%/%，蟮均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表1。

DNMT3B啟動(dòng)子C根46359TPCR產(chǎn)物分鼗析PCR產(chǎn)物為380b鏵p的片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定,結(jié)果見圖1。

經(jīng)限凋制性內(nèi)切酶BlnⅠ酶切后，當(dāng)nt46359處為T洄時(shí)，BlnⅠ可將PCR產(chǎn)津物切為207bp和173庥bp兩個(gè)片段；當(dāng)nt46359處為C時(shí)，BlnⅠ滄不能將PCR產(chǎn)物切開，只櫬有1個(gè)380bp的片段；淄當(dāng)nt46359處為CT時(shí)，為380bp、207耵bp和173bp3個(gè)片段燥，見圖2。

為證實(shí)酶切結(jié)果驁，將凝膠電泳證實(shí)為CT基因型、TT基因型各2例P殊CR產(chǎn)物送至測(cè)序公司進(jìn)行克測(cè)序，其中箭頭所示為DN狄MT3B啟動(dòng)子C4635沾9T多態(tài)性位點(diǎn)，見圖3。

醮DNMT3BC46359T等位基因頻率在病例湘組和對(duì)照組中的分布經(jīng)Ha凼rdyWEinberg杈遺傳平衡吻合度檢驗(yàn)，病例弭和對(duì)照組的基因型分布符合遺傳平衡定律。

結(jié)果顯示，脈正常對(duì)照中DNMT3BC洙46359T等位基因TT鯇/CT基因型頻率為%/%,T的頻率為%，C的頻率臘為%；病例組中TT/CT胼基因型頻率為%/%,T頻率為%，C的頻率為%。

經(jīng)2檢驗(yàn)，DNMT3BC遲46359T等位基因TT呷/CT基因型頻率在正常人群和食管癌患者中分布差異飼沒有顯著性(P=)，對(duì)照組與病例組中均未檢測(cè)到D紈NMT3B46359CC累基因型。

見表2。

注：

括弧鈀中為所占百分比DNMT置3BC46359T等位基漓因頻率在中國漢族人和英國泓、美國白種人中的分布經(jīng)與咬文獻(xiàn)報(bào)道的DNMT3BC爐46359T等位基因頻率兗分別在英國和美國白種人［赳9，14］之間比較，顯示泊英國、美國白種人中TT、隍CT和CC基因型分別占%劃/%/%和%/%/35%卞，而中國漢族人TT和CT攄基因型分別為%和%，中國容漢族人DNMT3BC46359T等位基因頻率分布瑩與英、美兩國白種人存在顯纘著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表3。

轱3討論單核苷酸多態(tài)雍性主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異引起的鑿DNA序列多態(tài)性，在人群毹中的頻率大于1％,是人類ｈ可遺傳變異中最常見的一種睿，占所有已知多態(tài)性的90秣％以上［15］。

SNP與リ腫瘤等許多疾病的易感性有悃關(guān)［16］。

研究表明，位才于基因啟動(dòng)子區(qū)的SNP能蹩影響基因的表達(dá)或酶的活性式［1314］。

DNA甲侔基化在胚胎發(fā)育和印跡基因察的轉(zhuǎn)錄抑制，如X染色體的失活以及許多人類腫瘤中重⒓要基因的異常沉默中起重要錳作用［17］。

DNMT3B基因啟動(dòng)子區(qū)-149位C46359T多態(tài)性與乳恣腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、膀胱ヨ癌以及急性白血病等多種腫靈瘤易感性有關(guān)［9，14，聹1820］。

這些研究提ш示該位點(diǎn)的遺傳變異可能與多種腫瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，該圯位點(diǎn)可能作為評(píng)價(jià)人群腫瘤易感性的一個(gè)指標(biāo)。

到目前蓍為止，C46359T是否敲與食管癌易感性有關(guān)尚不清乒楚。

表3DNMT3B基宵因啟動(dòng)子區(qū)C46359T電等位基因頻率注：

括弧中為所占百分比食管癌是我國常見的一種消化道腫瘤，因其缺乏有效的早期診斷指標(biāo)，俸當(dāng)患者出現(xiàn)癥狀時(shí)往往為中尷晚期，不利于治療，且預(yù)后鉬不良。

為了給食管癌提供一熨個(gè)早期診斷指標(biāo)，我們對(duì)D捫NMT3B基因啟動(dòng)子區(qū)上屆游149位C46359T摯多態(tài)性與食管癌的易感性進(jìn)嵊行了研究。

本研究所得DN敵MT3B基因啟動(dòng)子區(qū)-1怪49位點(diǎn)基因型分布結(jié)果符绱合HardyWeinb癉erg平衡定律。

正常對(duì)照組中TT基因型為%，CT鐮基因型為%，病例組中分別宇為%和%，兩者無顯著的統(tǒng)羼計(jì)學(xué)差異(P=,OR=，燙95%CI為～)。

這說明詒至少在我們的研究中，DN巧MT3B基因啟動(dòng)子區(qū)上游瓤149位C46359T多瘕態(tài)性與食管癌易感性之間可紀(jì)能無顯著的相關(guān)性。

這有可覿能是由于在不同的細(xì)胞組織焦中DNMT3B的不同剪切ｃ子催化活性有差異［8］，仞或者是DNMT3B活性的漲抑制不能使一些細(xì)胞系中高螻甲基化的腫瘤抑制基因激活［2122］，而且在不櫧同腫瘤中，C和T所代表的疹風(fēng)險(xiǎn)因素也不同，如在肺癌珩中，DNMT3BC463哼59T的CT+TT基因型鄂所患風(fēng)險(xiǎn)幾乎是CC基因型烀的兩倍［20］；而在乳腺砉癌中，CT+CC基因型風(fēng)，險(xiǎn)率顯著高于TT基因型［9］，這說明在不同的腫瘤魯中DNMTs作用的復(fù)雜性鑷。

本研究結(jié)果還顯示中國漢堿族人的基因型分布與英國、斛美國白種人有顯著不同。

有蜓關(guān)中國人群該位點(diǎn)的研究結(jié)孿果發(fā)現(xiàn)，此CT基因型在中蹯國漢族為%［16］,北方ケ地區(qū)為%［19］，正常對(duì)扼照組中均未檢出CC基因型畎，這種分布的顯著差異的機(jī)制還沒有明確。

DNMT3鏡B多態(tài)性的生物學(xué)功能，以筢及其在腫瘤發(fā)生過程中的作殍用還有待進(jìn)一步研究。

此位點(diǎn)與食管癌易感性的相關(guān)性淌還需要在其他種族中進(jìn)行研究。

【參考文獻(xiàn)】［鋨1］呂寶忠,趙壽元.腫瘤漠遺傳學(xué)[M].北京：

科學(xué)出版社，1998：

98.［2］WEBERBL,N兇ATHANSONKL.L愆owpenetrance屢genesassocia酰tedwithincreasedriskforb笙reastcancer[平J].EurJCance殪r,2000,36(10纈):11931199.［3］PONDERBA.梟Cancergenetics[J].Nature,2001,411(68爺35):336341.［4］ENGC,HERM黝A(yù)NJG,BAYLINSB.Abirdseye壢viewofglobalmethylation[J].NatGetet,蹈2000,24(2):1紊01102.［5］R躍OBERTSONKD,K們EYOMARSIK,GONZALESFA,eta壢l.Differenti灑almRNAexpres玻sionofthehum啟anDNAmethylt銘ransferase(DNMTs)1,3aand璣3bduringtheG同0/G1toSphase▲transitionin簽normalandtum窮orcells[J].NカuclEicAcidsR參es,2000,28(1牟0):21082113搿.［6］MIZUNOS平,CHIJIWAT,OK害AMURAT,etal.使Expressionof袢DNAmethyltraШnsferasesDNMT1,3A,and3Bi屏nnormalhemat㈧opoiesisandi镥nacuteandchr敘onicmyelogen機(jī)ousleukemia[亨J].Blood,200秀1,97(5):1172チ1179.［7］LI邳UK,WANGYF.En騷dogenousassa在ysofDNAmethy峋ltransferase巫s:evidencefo渤rdifferentialactivitieso藤fDNMT1,DNMT2嬈,andDNMT3inm苡ammaliancell靶sinvivo[J].M陲olCellBiol,X獯X,23(8):2709驅(qū)2719.［8］OKANOM,BELLDW,崞HABERDA,etal鱈.DNAmethyltr涯ansferasesDn仕mt3aandDnmt3氫bareessentia拄lfordenovome盒thylationand詒mammaliandev憎elopment[J].Cell,1999,99(3):247257.［9］MONTGOMER舶YKG,LIUMC,EC兜CLESDM，etal．東TheDNMT3BCT叼promoterpoly錠morphismandriskofbreastcancerinaBrit晷ishpopulatio驕n：

aeasecont芪rolstudy[J]．社BreastCancerRes，XX,6(4)：

頇390394．［10情］饒克勤，李連弟.中國惡峒性腫瘤危險(xiǎn)因素研究［M］.北京：

中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)樣出版社,XX:235248.［11］WANG鑣LD，ZHENGS，ZH咱ENGZY，etal．Primaryadenoc⌒arcinomasofl饉oweresophagu粑s，esophagogastricjunctio腚nandgastriccardia：

inspecialreference辯toChina[J]．W葜orldJGastroe靂nterol，XX，9(劇6)：

11561164鐐．［12］MORETO腚M．Diagnosisofesophagogas漣trictumors[J柁]．Endoscopy，炯XX，35(1)：

36．曉［13］SKOOGT，幔vantHOOFTFMＣ，KALLINB，eta抱l．Acommonfunctionalpolym鵯orphism(CAs波ubstitutiona螢tposition86爺3)inthepromo黜terregionoft屜hetumournecr颼osisfactoral歿pha(TNFalph甕a)geneassoci其atedwithreducedcirculati萁nglevelsofTN卡Falpha[J]．HпumMolGenet,1灸9998(8)：

1443諗1449．［14］S賢HENH,WANGL,SPITZMR,etal.碑Anovelpolymo聒rphisminhumancytosineDNA瘓methyltrans穎ferase3Bpro禱moterisassoc量iatedwithanincreasedriskぁoflungcancer垛[J].CancerRe芤s,2002,62(17割):49924995.蹶［15］COLLINS幛FS，BROOKSLD，彤CHAKRAVARTIA鯖．ADNApolymor軌phismdiscove猥ryresourcefo嘌rresearchonhumangeneticv罷ariation[J]．綺GenomeRes，19驥98,8(12)：

122拇91231.［16］易COLLINSA，LON慊JOUC，MORTONN蹙E，etal．Genet嫫icepidemiolo詔gyofsinglen槁ucleotidepol旮ymorphisms[J馨]．ProcNatlAc凰adSciUSA，199渣9，96(26)：

151卟7315177．［1朝7］JONESPA,TA返KAID.Therole鐳ofDNAmethyla蒔tioninmammal