dsRNA阻斷大鼠骨髓源性神經(jīng)干細胞Hes5表達的實驗研究

本文由探生科技技術(shù)人員提供，如果您想了解更多關(guān)于抗體的信息，可以訪問Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊的抗體專家查找相關(guān)資料,希望對您有幫助！dsRNA阻斷大鼠骨髓源性神經(jīng)干細胞Hes5表達的實驗研究摘要：目的

觀察外源性短雙鏈RNA(dsRNA)在轉(zhuǎn)錄后水平即mRNA水平降低基因表達的效率，并對其影響因素進行初步探討。方法

將體外分離培養(yǎng)的大鼠骨髓基質(zhì)細胞，通過由本實驗室配制的特殊培養(yǎng)基誘導(dǎo)成神經(jīng)干細胞，應(yīng)用人工合成的dsRNA于不同濃度轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細胞，Westernbloting檢測dsRNA是否能阻斷轉(zhuǎn)錄因子Hes5的表達，0.5%錐蟲藍法測定各濃度組中培養(yǎng)細胞活力。結(jié)果

200~300nmol/L濃度的dsRNA能特異有效地阻斷Hes5的表達，而50~200nmol/L濃度的dsRNA有利于干細胞存活。結(jié)論

dsRNA能在神經(jīng)干細胞內(nèi)啟動RNA干擾作用，適宜濃度的dsRNA能在特異有效地阻斷內(nèi)源性基因的表達的同時，最大限度地保持細胞活力。關(guān)鍵詞：雙鏈RNA；Hes5；神經(jīng)干細胞，骨髓源性；RNA干涉；免疫印跡

Blockingwithdouble-strandedRNAoftheexpressionofHes5inratbonemarrow-derivedneuralstemcells

WANGHai-yan1；XURu-xiang1；JIANGXiao-dan1；LUOShen-qiu2

1InstituteofNeuromedicineofPLA,ZhujiangHospital,FirstMilitaryMedicalUniversity,Guangzhou510282,China;2DepartmentofCellularBiology,FirstMilitaryMedicalUniversity,Guangzhou510515,China

Abstract:Objective

Toexaminetheefficiencyofexogenoussmalldouble-strandedRNA(dsRNA)inknockingdownthegeneexpressionatthepost-transcriptionlevel,andinvestigatethefactorsthatmayinfluencethetransfection.Method

ThebonemarrowstromalcellsofSDratwereseparatedandculturedinvitro,followedbyinductionofthecellstoevolveintoneuralstemcellsusingspecialculturemediumpreparedbyourlaboratory.SyntheticdsRNAwasthentransferredintothecellsatvariedconcentrations,andtheresultswereanalyzedbyWesternblotting.Results

Theconcentrationsrangingfrom200to300nmol/LwereoptimalforspecificallyblockingtheexpressionofHes5,whereasthesuitableconcentrationsforthecellsurvivalwerebetween50and200nmol/L.Conclusion

dsRNAiscapableoftriggeringRNAinterferenceinneuralstemcells,andatappropriateconcentration,itmayspecificallyandeffectivelyknockdownendogenousgeneexpressionwithoutsacrificingtheviabilityofthecells.

Keywords:double-strandedRNA;hairyandenhancerofsplit;neuralstemcell,bonemarrow-derived;RNAinterference;Westernblotting

收稿日期：2003-07-11

基金項目：國家自然科學(xué)基金(3027049)；軍隊及廣東省科技廳“十五”重大項目(01z054)

ThestudyissupportedbyNationalNaturalScienceFoundationofChina(3027049),andisakeyprojectoftheTenthFive-yearPlanofthePLAandScienceandTechnologyCommissionofGuangdongProvince

作者簡介：王海燕(1972-)，女，第一軍醫(yī)大學(xué)在讀碩士研究生，電話E-mail:haiyanwang838@

RNA干涉(RNAinterference,RNAi)是一種轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默，作為關(guān)閉特定基因功能的新技術(shù)，為研究特定基因功能提供了一種快速、簡便的方法，其特點是當外源性短雙鏈RNA(double-strandedRNA,dsRNA)進入細胞后，能高效的降解同源的mRNA，從而抑制相應(yīng)基因的表達。盡管RNAi在非哺乳動物細胞和部分哺乳動物細胞系如Hela、HEK293和P19中能有效發(fā)揮作用，RNAi在骨髓源性神經(jīng)干細胞內(nèi)是否能有效短暫地降解目的基因在蛋白水平的表達，目前還不清楚。為此，本實驗通過體外分離培養(yǎng)SD大鼠骨髓基質(zhì)細胞，經(jīng)本實驗室配制的特殊培養(yǎng)基誘導(dǎo)成神經(jīng)干細胞，然后應(yīng)用人工合成的dsRNA轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細胞，觀察dsRNA是否能阻斷Hes5(hairyandenhancerofsplit)——一個特定表達于神經(jīng)干細胞的Notch信號通路下游基因的表達，并對其相應(yīng)的機制進行初步探討。

1

材料和方法

1.1

實驗動物與材料

6月齡健康成體SD大鼠，體質(zhì)量130g，由第一軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。神經(jīng)干細胞培養(yǎng)液由本實驗室配制(專利申請中)。細胞分離液(CSM)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、L-谷胺酰胺、胰蛋白酶、腦源性神經(jīng)生長因子(BDNF)均購自Sigma公司。胎牛血清購于杭州四季青生物材料研究所。細胞裂解液、生物素化羊抗小鼠IgG及鏈酶親和素-生物素-過氧化酶復(fù)合物購自上海申能博彩生物科技有限公司。Hes5抗體及Nestin抗體購自chemicon公司，Hes5基因的dsRNA設(shè)計后交德國proligo公司合成，HRP標記的兔抗大鼠IgG、生物素化羊抗小鼠IgG、鏈酶親和素-生物素-過氧化酶復(fù)合物及化學(xué)發(fā)光檢測試劑購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2

骨髓基質(zhì)細胞的分離及培養(yǎng)成神經(jīng)干細胞

將大鼠處死后取出股骨，用注射器吸取1.5mlPBS和1.5ml肝素鈉鹽水(125U/ml)，從骨的一端緩慢地沖洗骨髓腔。將所得的細胞懸液進行密度梯度離心，取單核細胞層(云霧狀層)，按1×106密度種植于含b-FGF20ng/ml和10%FBS的特制培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，3d后半量換液。換液前用0.01mol/L的PBS輕輕沖洗培養(yǎng)細胞的表面，以去除未貼壁細胞。以后每隔3d換液1次，去除大部分雜質(zhì)細胞。約20~22d可見島嶼狀細胞團，隨機挑選3培養(yǎng)孔作Nestin鑒定，剩余培養(yǎng)孔細胞團用0.01mol/LPBS洗2遍，吸管輕柔吹打，制成單細胞懸液。特制培養(yǎng)基和10%FBS重懸細胞，按1×105/ml隨機分為7組接種于2板12孔培養(yǎng)板中。每組重復(fù)3孔繼續(xù)培養(yǎng)18~24h后，當細胞大概30%~50%融合時進行轉(zhuǎn)染。

1.3

siRNA(smallinterfereRNA)的制備

從GenBank上搜尋大鼠Hes5的cDNA序列，根據(jù)以下原則在編碼區(qū)挑選合適的靶堿基對：(1)最適宜長度為21~23個堿基對，GC比例盡可能的接近50%；(2)避免連續(xù)3個或3個以上的鳥嘌呤；(3)最好選擇由2個腺嘌呤開始的序列；(4)標記正義鏈3'端；(5)確信所選擇的序列與其他的基因不具有同源性。以下為Hes5的dsRNA序列，正義鏈：5'-GAGCCUG-CACCAGGACUAC-3'，反義鏈：5'-GUAGUCCUGUGCAGGCUC-3'，確信無誤后將目的序列提交德國pro-ligo公司制作。成品為正義鏈和反義鏈混合在一起的粉劑，用時將其溶解為終濃度20μmol/L的溶液。

1.4

細胞轉(zhuǎn)染

上述細胞繼續(xù)培養(yǎng)達到30%~50%融合時進行轉(zhuǎn)染。分別取1.25、2.50、3.75、5.00、6.25、7.50μl的dsRNA原液加入到Opti-MEM溶液中使其終溶液為90μl，而終濃度分別為50、100、150、200、250、300nmol/L(A液)。取2μlOligofectamineTM轉(zhuǎn)染液加入到8μlOpti-MEM溶液中使其總?cè)芤簽?0μl(B液)。將A、B溶液室溫靜置5~10min，然后將A、B溶液輕柔混勻，室溫孵育15~20min。Opti-MEM溶液洗細胞1次，12孔培養(yǎng)板每孔加400μlOpti-MEM溶液。將100μlA、B混合液再輕柔混勻，加入12孔培養(yǎng)板，每3孔為一個濃度組。37℃、5%CO2孵箱孵育4h后，加入3倍于正常濃度血清，各濃度組分別于轉(zhuǎn)染后48h提取蛋白檢測。

1.5

細胞免疫化學(xué)

取培養(yǎng)10~12d的鼠骨髓基質(zhì)干細胞(以可見細胞團為準)，采用SABC法進行免疫細胞化學(xué)檢測。一抗為Nestin(鼠多抗，1∶200)，反應(yīng)120min(37℃)；二抗為生物素化羊抗小鼠IgG，室溫孵育30min；三抗為鏈親和酶素-生物素-過氧化酶復(fù)合物，室溫孵育10min。DAB染液顯色5~15min，著棕色細胞為染色陽性細胞。同樣的實驗重復(fù)3次，光鏡下觀察拍照。

1.6

Westernblotting檢測Hes5表達

收集幼鼠(14.5天齡SD大鼠)腦組織提取物、培養(yǎng)25d待轉(zhuǎn)染細胞及不同濃度dsRNA轉(zhuǎn)染4h細胞，用0.01mol/LPBS清洗3遍后，按常規(guī)方法提取蛋白，15%SDS分離蛋白質(zhì)。分離后的蛋白按常規(guī)方法轉(zhuǎn)膜、封閉，加入鼠抗Hes5一抗，4℃孵育12h，TTBS洗膜后加入HRP標記的羊抗大鼠抗體檢測Hes5的表達，陽性條帶以化學(xué)發(fā)光法顯示在X膠片上。實驗重復(fù)3次。

1.7

錐蟲藍法檢測培養(yǎng)細胞活力

用0.5%錐蟲藍按常規(guī)方法進行，每培養(yǎng)孔計數(shù)5次，每濃度組重復(fù)3次。Star統(tǒng)計軟件對以上實驗結(jié)果作統(tǒng)計分析。

2

結(jié)果

2.1

骨髓基質(zhì)細胞的體外培養(yǎng)及形成神經(jīng)干細胞

剛接種的細胞種類較多，大部分細胞呈圓形，包括造血干細胞及分化程度不同的其他各系細胞、MSCs等。細胞接種后24h內(nèi)見少數(shù)細胞開始貼壁生長，而大部分仍浮在溶液中的細胞呈圓形和橢圓形，細胞分裂，增殖旺盛，可見伸出小芽的細胞。48~72h后骨髓基質(zhì)細胞大部分貼壁，5d后半量換液去除部分懸浮細胞，可見細胞增殖減慢。10d后培養(yǎng)孔細胞分為2層，下層為梭形細胞鋪滿瓶底，上層為各種形態(tài)的半懸浮細胞，體外培養(yǎng)20~22d左右可見梭形細胞層上由大圓細胞形成的島嶼狀細胞團(圖1)。進行免疫細胞化學(xué)鑒定該細胞團表達Nestin(圖2)，免疫印跡檢測表明該細胞團蛋白提取物與胚鼠腦組織提取物在Mr25000處有Hes5的表達，但是與胚鼠腦組織提取物相比，骨髓源性的神經(jīng)干細胞Hes5的表達量稍弱一些(圖3)。

圖1骨髓基質(zhì)細胞體外培養(yǎng)20~22d后形成的島嶼狀細胞團(原放大倍數(shù)：×400)

Fig.1Ratbonemarrowstromalcells(BMSCs)formingisland-likecellmassat20to22daysofinvitroculture(Originalmagnification:×400)

圖2島嶼狀細胞團為Nestin陽性細胞(原放大倍數(shù)：×400)

Fig.2Island-likecellmassexpressingnestin,aspecificantigenofneuronalstemcells(Originalmagnification:×400)

圖3

Westernblot檢測細胞團有較強的Hes5蛋白表達

Fig.3WesternblotanalysisshowingstrongHes5expression

Lane1:Proteinmarker;Lane2:Substancedistilledfromthebraintissueof14-day-oldrats;Lane3:BMSCproteinextract

2.2

適宜濃度的dsRNA能特異有效地阻斷Hes5的表達。

免疫印跡結(jié)果提示50、100、150nmol/L濃度的dsRNA轉(zhuǎn)染細胞后仍可見Hes5(Mr25000)的表達，50及100nmol/L濃度組Hes5蛋白的表達相似，而150nmol/L濃度稍弱。表明50及100nmol/L濃度的dsRNA不能阻斷內(nèi)源性的Hes5的表達，而150nmol/L濃度可部分抑制Hes5的表達；200、250、300nmol/L轉(zhuǎn)染組則無Hes5蛋白的表達(圖4)。說明200nmol/L及以上濃度的dsRNA能在神經(jīng)干細胞內(nèi)啟動RNAi作用，從而特異有效阻斷Hes5的表達。

圖4不同濃度dsRNA特異性阻斷Hes5表達情況

Fig.4

InhibitionofHes5expressionwithdsRNAofdifferentconcentrations

Lane1:Proteinmarker;Lane2:50nmol/L;Lane3:100nmol/L;Lane4:150nmol/L;Lane5:200nmol/L;Lane6:250nmol/L;Lane7:300nmol/L

2.3

低濃度的dsRNA有利于干細胞細胞存活

轉(zhuǎn)染對照組及50~200nmol/L濃度轉(zhuǎn)染組細胞均能正常生長，但形態(tài)存在明顯差異。50~100nmol/L轉(zhuǎn)染組形態(tài)無顯著變化，轉(zhuǎn)染48h后仍以大圓細胞為主，細胞活力好。150nmol/L組可見部分細胞分化，200nmol/L轉(zhuǎn)染組細胞則大部分分化，可見部分細胞老化及死亡。而250nmol/L高濃度轉(zhuǎn)染組有少部分細胞分化，大部分細胞胞膜不完整，細胞內(nèi)有黑色顆粒及空泡。300nmol/L組細胞于轉(zhuǎn)染后24h大部分凋亡。0.5%錐蟲藍法檢測培養(yǎng)細胞活力及統(tǒng)計結(jié)果表明，各濃度組之間存在顯著差異，濃度與細胞活力呈負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.9。這些結(jié)果提示，雖然高濃度dsRNA能更有效地阻斷內(nèi)源性Hes5蛋白的表達，但是高濃度對細胞毒性也不可低估，低濃度的dsR-NA則更有利于細胞存活(圖5)。

圖5不同濃度的dsRNA轉(zhuǎn)染BMSCs48h后細胞存活率

Fig.5SurvivalrateoftheBMSCs48haftertransfectionwithdsRNAofdifferentconcentrations

3

討論

Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是發(fā)育期間一條重要的通路，研究表明它在大量的組織和器官包括神經(jīng)組織的發(fā)育中發(fā)揮重要作用，調(diào)控著組織類型及形態(tài)的發(fā)生[1][2][3][4][5]。轉(zhuǎn)錄因子Hes5特異性表達在神經(jīng)干細胞中，是Notch信號在細胞內(nèi)重要的下游靶轉(zhuǎn)錄因子。它是否表達在骨髓源性神經(jīng)干細胞發(fā)育過程中，究竟有什么作用？

Timmons等[6]在1998年首次提出“dsRNA介導(dǎo)的RNAi”具有高效性和特異性，隨后的研究發(fā)現(xiàn)，在各種生物，如果蠅、擬南芥菜、及小鼠等[7][8]均存在dsRNA介導(dǎo)的RNAi現(xiàn)象，表明RNAi可能是生物普遍存在的轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)基因表達的方式。進一步研究發(fā)現(xiàn)體外合成長鏈dsRNA在植物和低等生物中能發(fā)揮特異的RNAi作用，但應(yīng)用于哺乳動物細胞中卻出現(xiàn)明顯的非特異性反應(yīng)[9][10]，包括引起細胞的非特異性基因降解，甚至整個細胞蛋白質(zhì)合成停止而導(dǎo)致細胞死亡。2001年5月，Elbashir等[10]首先報道了以體外合成的siRNA轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞造成特異性基因抑制的結(jié)果，293細胞鏈和Hela細胞鏈被轉(zhuǎn)染特異性dsRNA后，靶mRNA所表達的蛋白質(zhì)的量比轉(zhuǎn)染前降低了90%，但卻并未發(fā)現(xiàn)非特異性基因抑制及細胞死亡。而后的多項研究進一步證實，體外合成的dsRNA不論在低等生物如線蟲，還是在高等生物如人、鼠的細胞中，均能發(fā)揮其強大、特異的基因抑制功能[11][12]，這一點對于體外轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因和細胞的內(nèi)生基因同樣有效。并且，體外合成dsRNA觸發(fā)RNAi所需的有效濃度很低。

盡管這樣，Timmons卻發(fā)現(xiàn)RNAi似乎對神經(jīng)干細胞無作用[13]，而Paul等[14]則認為高濃度(15μg/ml)的dsRNA在線蟲神經(jīng)元培養(yǎng)過程中，無論是增殖或者分化期都能有效的降解目的基因。說明dsRNA對于神經(jīng)細胞來說是一種很弱的基因沉默工具，且高濃度的dsRNA引入大多哺乳動物中，會引發(fā)強烈的細胞毒性，即引起PKR反應(yīng)導(dǎo)致mRNA大范圍的轉(zhuǎn)錄停止。最近幾個研究團體設(shè)計了一個替代方法，即通過轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA使神經(jīng)元內(nèi)源性的表達dsRNA，但是收效甚微。考慮主要是由于分裂后的原代培養(yǎng)神經(jīng)元轉(zhuǎn)染效率低，且轉(zhuǎn)染本身對神經(jīng)元就是一個細胞毒性作用所