高中生物同步備課系列【備學(xué)案】3.2.1 基因工程的基本操作程序 導(dǎo)學(xué)案（教師版）-人教2019版選擇性必修3

第3章基因工程第2節(jié)基因工程的基本操作程序（第1課時(shí)）導(dǎo)學(xué)案【生命觀念】闡明基因工程的原理和基本操作程序?！究茖W(xué)思維】針對(duì)人類(lèi)生產(chǎn)或生活中的某一需求，選取適當(dāng)?shù)幕蚬こ痰募夹g(shù)和方法，嘗試設(shè)計(jì)獲得某一轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的方案?！窘虒W(xué)重點(diǎn)】1.基因工程基本操作程序的四個(gè)步驟。2.DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定?！窘虒W(xué)難點(diǎn)】1.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因。2.DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定。一、目的基因的篩選和獲取目的基因：在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等的基因就是目的基因，根據(jù)不同的需要，目的基因是不同的，主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因。目前被廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲(chóng)基因、植物抗病基因（抗病毒、抗細(xì)菌）、人胰島素基因、人干擾素基因等。1.篩選合適的目的基因（1）方法：從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中篩選。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，以及序列數(shù)據(jù)庫(kù)（如GenBank）、序列比對(duì)工具（如BLAST）等的應(yīng)用，越來(lái)越多的基因的結(jié)構(gòu)和功能為人們所知，為科學(xué)家找到合適的目的基因提供更多機(jī)會(huì)和可能。（2）實(shí)例：蘇云金桿菌制成的生物殺蟲(chóng)劑廣泛用于防治棉花蟲(chóng)害；蘇云金桿菌的殺蟲(chóng)作用與Bt基因有關(guān)；科學(xué)家不僅掌握了Bt基因的序列信息，對(duì)Bt基因的表達(dá)產(chǎn)物-Bt抗蟲(chóng)蛋白也有較為深入的了解。因此，篩選Bt基因作為培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉的目的基因。2.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因（1）PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫(xiě)。它是一項(xiàng)根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。（2）DNA體內(nèi)復(fù)制的條件參與的組分在DNA復(fù)制中的作用解旋酶打開(kāi)DNA雙鏈DNA母鏈提供DNA復(fù)制的模板4種脫氧核苷酸合成DNA子鏈的原料DNA聚合酶催化合成DNA子鏈引物使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開(kāi)始連接脫氧核苷酸引物：一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸。體內(nèi)復(fù)制的引物為RNA單鏈。（3）DNA體外復(fù)制（PCR）的條件參與的組分在DNA復(fù)制中的作用90℃以上高溫打開(kāi)DNA雙鏈（變性）DNA母鏈提供DNA復(fù)制的模板*4種脫氧核苷酸合成DNA子鏈的原料耐高溫的DNA聚合酶催化合成DNA子鏈引物使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開(kāi)始連接脫氧核苷酸緩沖液（含Mg2+)激活真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶注意：體外復(fù)制的引物一般為DNA單鏈。（4）擴(kuò)增的過(guò)程①變性：當(dāng)溫度上升到90℃以上時(shí)，雙鏈DNA解聚為單鏈；②復(fù)性：當(dāng)溫度下降到50℃左右時(shí)，兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合；③延伸：當(dāng)溫度上升到72℃左右時(shí)，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈。如此重復(fù)循環(huán)多次，由于延伸后得到的產(chǎn)物又可以作為下一個(gè)循環(huán)的模板，因而每一次循環(huán)后目的基因的量可以增加一倍，即成指數(shù)形式擴(kuò)增（約為2n，其中n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）?！舅伎肌坑肞CR可以擴(kuò)增mRNA嗎？mRNA不可以直接擴(kuò)增，需要將它逆轉(zhuǎn)錄成cDNA再進(jìn)行擴(kuò)增。由mRNA逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA的過(guò)程是：第一步，逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補(bǔ)的DNA鏈，形成RNA-DNA雜交分子；第二步，核酸酶H降解RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈，使之變成單鏈DNA；第三步，單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補(bǔ)的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子，即cDNA。3.獲取目的基因的其他方法（1）構(gòu)建基因文庫(kù)來(lái)獲取目的基因：將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱(chēng)為基因文庫(kù)。①基因組文庫(kù)：含有一種生物的全部基因。提取某種生物的全部DNA→用適當(dāng)?shù)南拗泼该盖幸欢ù笮〉腄NA片段→將DNA片段與載體連接形成基因表達(dá)載體→導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存→基因組文庫(kù)。②部分基因文庫(kù)：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫(kù)。提取某種生物的某器官或特定發(fā)育時(shí)期的mRNA→在反（逆）轉(zhuǎn)錄酶作用下形成單鏈互補(bǔ)DNA→在DNA聚合酶作用下形成雙鏈DNA片段→與載體連接形成基因表達(dá)載體→導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存→cDNA文庫(kù)。基因組DNA文庫(kù)與cDNA文庫(kù)的比較：文庫(kù)類(lèi)型cDNA文庫(kù)基因組文庫(kù)文庫(kù)大小小大基因中啟動(dòng)子（具有啟動(dòng)作用的DNA片段）無(wú)有基因中內(nèi)含子（位于編碼蛋白質(zhì)序列的非編碼DNA片段）無(wú)有基因多少某種生物的部分基因某種生物的全部基因物種間的基因交流可以部分基因可以（2）利用化學(xué)方法人工合成①需要儀器：DNA合成儀。②適用目的基因類(lèi)型：要獲取的基因比較小，核苷酸序列又已知；③不需要模板。二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心）1.操作目的：讓目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代，同時(shí)，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。2.基因表達(dá)載體的構(gòu)成（1）啟動(dòng)子：一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的上游（首端），緊挨轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)，是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終表達(dá)出人類(lèi)需要的蛋白質(zhì)。有時(shí)為滿足應(yīng)用需要，會(huì)在載體中人工構(gòu)建誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。誘導(dǎo)物存在時(shí)，可激活或抑制目的基因的表達(dá)。（2）終止子：一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的下游（尾端），標(biāo)志著轉(zhuǎn)錄的停止。（3）標(biāo)記基因①作用：便于重組DNA分子的篩選。②常見(jiàn)類(lèi)型：抗生素抗性基因、熒光蛋白基因等。（4）目的基因：如Bt基因。（5）復(fù)制原點(diǎn)作用：使能完成自主復(fù)制。3.基因表達(dá)載體的構(gòu)建【思考】將生物的所有DNA直接導(dǎo)入受體細(xì)胞不是更簡(jiǎn)便嗎？如果這么做，效果會(huì)怎樣？有人采用總DNA注射法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，即將一個(gè)生物的總DNA提取出來(lái)，通過(guò)注射或花粉管通道法導(dǎo)入受體植物，沒(méi)有進(jìn)行基因表達(dá)載體的構(gòu)建。這種方法針對(duì)性差，完全靠運(yùn)氣，也無(wú)法確定哪些基因?qū)肓耸荏w植物。三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞（1）花粉管通道法（受體細(xì)胞：受精卵）①用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；②在植物受粉后的一定時(shí)間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入胚囊。（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法①轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程。此處“轉(zhuǎn)化”與肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中的“轉(zhuǎn)化”含義相同，實(shí)質(zhì)都是基因重組。②特點(diǎn)：a.能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物，而對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有侵染能力。b.農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有Ti質(zhì)粒，當(dāng)它侵染植物細(xì)胞后，能將Ti質(zhì)粒上的T-DNA（可轉(zhuǎn)移的DNA）轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞，并且將其整合到該細(xì)胞的染色體DNA上。③實(shí)驗(yàn)思路（過(guò)程）：將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA中，通過(guò)農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化作用，就可以使目的基因進(jìn)入植物細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上，使目的基因能夠維持穩(wěn)定和表達(dá)。④具體轉(zhuǎn)化方法：a.可以將新鮮的從葉片上取下的圓形小片與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，然后篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并再生成植株。b.可以將花序直接浸沒(méi)在含有農(nóng)桿菌的溶液中一段時(shí)間，然后培養(yǎng)植株并獲得種子，再進(jìn)行篩選、鑒定等。2.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞——顯微注射法（1）受體細(xì)胞：受精卵。因?yàn)槭芫讶菀妆憩F(xiàn)出全能性。（2）過(guò)程：構(gòu)建基因表達(dá)載體并提純→利用顯微注射將基因表達(dá)載體注入動(dòng)物的受精卵中→早期胚胎培養(yǎng)→胚胎移植→獲得具有新性狀的動(dòng)物。3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞——Ca2+處理法（1）受