Cajal間質(zhì)細(xì)胞在先天性巨結(jié)腸分布的研究

1/1Cajal間質(zhì)細(xì)胞在先天性巨結(jié)腸分布的研究Cajal間質(zhì)細(xì)胞在先天性巨結(jié)腸分布的研究作者：

高穎曲政王磊陳新國(guó)古立暖王加勇【摘要】目的：

通過觀察cajal間質(zhì)細(xì)胞在正常結(jié)腸及先天性巨結(jié)腸先天性巨結(jié)腸患者痙攣段、移行段、擴(kuò)張段的分布，探討HD的發(fā)病機(jī)制。

方法:收集25例HD患兒標(biāo)本，于術(shù)中分別選取擴(kuò)張段、移行段、痙攣段腸壁的全層組織，另取6例手術(shù)患兒的正常結(jié)腸全層組織標(biāo)本，常規(guī)固定石蠟包埋組織切片備用。

對(duì)標(biāo)本行c-Kit免疫組織化學(xué)染色。

光鏡觀察ICC的分布，計(jì)數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

結(jié)果:沮正常結(jié)腸ICC主要分布在郜環(huán)肌內(nèi)側(cè)面與黏膜下層之間僖即黏膜下ICC、環(huán)肌與縱澆肌之間的肌間神經(jīng)從周圍即肌間ICC以及環(huán)肌與縱肌┘內(nèi)。

HD患兒痙攣段ICC-SM、ICC-IM細(xì)胞鼴數(shù)較擴(kuò)張段和正常對(duì)照組明ヮ顯減少(P＜)，且ICC鱟的細(xì)胞突起的分支亦減少，狃彼此之間不能形成完整的細(xì)色胞網(wǎng)絡(luò)。

而擴(kuò)張段ICC與蓓正常對(duì)照組比較無(wú)明顯差異弛(P＞)。

結(jié)論:HD患兒ǔ結(jié)腸ICC的異常分布，可噙能是HD發(fā)病、腸管蠕動(dòng)障瘢礙以及排便異常的原因之一演。

【關(guān)鍵詞】先天性巨顯結(jié)腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞晨免疫組織化學(xué)【ABS鈺TRACT】Objective：

Toinvest鯛igatetheroleofinterstiti痱alcellsofcaj廒alinthepatho文genesisofHDt掇hroughobservingthedistri⑤butionofthec汨ellsinnormal嫗colonandHD’sdifferentsegments.Method廡s:Theagangli頃onic、transit疒ionalanddila酬tedsegmentsw椰erecollected賴inoperations特from25childr玖enwithHirsch┶sprungsdise罔ase.Another6鍤normalsegmenぽgtswerealsoc邀ollected.Eac厭hsectionswas鎖stainedbyc-K針itimmunohistochemistry.T├hedistributi爺onoftheinter回stitialcellsofCajalwasob買servedbyligh鄉(xiāng)tmicroscope.Results:TheICCinaganglio岌nicsegmentso鞴fcolonfromHi罌rchsprungsd璉iseasewerede璀creasedsignificantlyandstatisticallythanthatindi噥latedandnormalcolon.More汗over,wholemo鐐untpreparati擲onsshowedtha窳t,notonlythe整numberofICC-嫦IMwasdecreas萸eddown,butalsothebranchesofICC-IMand蹁thecellularn敬etworkwereal桿sobrokendown.Conclusion:玉Thepathogene份sisofHDisrel攖atedtotheabn喬ormaldistrib豸utionofICC，w泯hichleadtoor港aggravatethebowelspasmin禍HD.【KEYWORD僮S】Hirschspru取ngsdisease炅Interstitial啉cellsofCajalImmunohisto⑦chemistry先天Д性巨結(jié)腸是小兒普通外科常諑見病，由于病變腸段神經(jīng)節(jié)驃細(xì)胞缺如，平滑肌過度收縮樗呈痙攣狀態(tài)，蠕動(dòng)消失，腸廊腔內(nèi)糞便不能通過痙攣部位溶，近端結(jié)腸繼發(fā)性擴(kuò)張，形芟成巨結(jié)腸，臨床上出現(xiàn)腸梗槊阻或便秘癥狀。

1893Ｅ年西班牙神經(jīng)解剖學(xué)家Ca戴jal采用甲基藍(lán)及嗜銀染血色法發(fā)現(xiàn)了存在于胃腸道的杌一種特殊類型的細(xì)胞,被稱為Cajal間質(zhì)細(xì)胞。

I峭CC是胃腸道運(yùn)動(dòng)的起搏細(xì)誅胞，具有自發(fā)性電活動(dòng)和產(chǎn)楔生傳播慢波等功能，對(duì)胃腸道運(yùn)動(dòng)具有非常重要的調(diào)節(jié)作用。

ICC的變化與多種胃腸動(dòng)力疾病有關(guān)。

本研究通過c-Kit免疫組織化既學(xué)染色，光鏡觀察ICC在怒正常結(jié)腸和巨結(jié)腸患者擴(kuò)張叵段、移行段、痙攣段的分布迕，探討ICC在HD致病中床的作用。

1資料與方法一般資料收集山東省立醫(yī)院、山東大學(xué)齊魯醫(yī)院XX年袈5月～XX年10月25例浠HD患兒手術(shù)切除組織，其嗦中男22例，女3例。

平均年齡23個(gè)月，2周～3個(gè)月4例，3個(gè)月～3歲16踵例，3歲5例。

長(zhǎng)段型2例，短段型2例，其余均為落普通型。

所有病例綜合臨床丸表現(xiàn)、X線鋇劑灌腸和手術(shù)鋅所見，并經(jīng)術(shù)中冰凍術(shù)后病Ъ理組織學(xué)檢查確診為HD，病例資料完整，均為散發(fā)。

檐手術(shù)切除的擴(kuò)張段、移行段魴、痙攣段全層腸壁組織經(jīng)4景%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋鰒切片，以擴(kuò)張段組織蠟塊作砟自身對(duì)照。

另取6例正常結(jié)フ腸組織作為對(duì)照，其中3例袞為乙狀結(jié)腸冗長(zhǎng)癥患兒切除翡的部分結(jié)腸組織，2例為腸跏扭轉(zhuǎn)腸壞死患兒切除的部分耳升結(jié)腸組織，1例為回盲型腸套疊患兒手術(shù)切除組織。

主要試劑和方法兔抗人c-ШKit多克隆抗體IgG，楗購(gòu)自上海長(zhǎng)島生物抗體有限熠公司；SP免疫組織化學(xué)染趙色試劑盒，購(gòu)自北京中杉金ィ橋生物技術(shù)有限公司。

組古織蠟塊行SP法免疫組織化學(xué)染色。

每個(gè)蠟塊連續(xù)切片費(fèi)3張，厚3～4m；切片忽常規(guī)脫蠟至水；3%過氧化本氫去離子水室溫孵育5～1切0min；蒸餾水沖洗，PBS浸泡5min，微波抗鹋原修復(fù)。

正常山羊血清工作瘳液封閉，室溫孵育10mi曷n，傾去血清，勿洗；滴加豳1:50稀釋的一抗，37咝℃孵育2h；PBS沖洗3毳次；滴加生物素標(biāo)記羊抗兔厄IgG二抗工作液，37℃證孵育15min；PBS沖薷洗3次。

滴加PBS稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作乘液,37℃孵育15min嚼；PBS沖洗3min，共悟3次；DAB顯色，蘇木精復(fù)染，封片。

以試劑盒附送點(diǎn)陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照，以P伴BS液代替一抗作為陰性對(duì)ヂ照。

觀察指標(biāo)由有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師在高倍鏡下觀察全部病理切片的肌間、黏膜下ゴ各10個(gè)視野，了解ICC簏的分布情況并計(jì)數(shù)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理全部數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS⒅統(tǒng)計(jì)軟件分析。

HD擴(kuò)張段惰、痙攣段與對(duì)照組行成組設(shè)蹉計(jì)兩樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)沆，擴(kuò)張段與痙攣段之間行配汕對(duì)設(shè)計(jì)資料t檢驗(yàn)。

P為蛹差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2寰結(jié)果不同結(jié)腸組織內(nèi)IC短C的分布正常結(jié)腸組織內(nèi)可螻見兩類c-Kit陽(yáng)性細(xì)胞豆：

一類細(xì)胞胞體較大，呈圓形，主要分布于黏膜層和黏膜下層，在肌層內(nèi)和漿膜下堀分布稀少，根據(jù)形態(tài)可識(shí)別饃為肥大細(xì)胞。

另一類細(xì)胞胞獷體較小，呈梭形或多角形；苠細(xì)胞質(zhì)相對(duì)較多，可見棕色嘸顆粒；核呈深藍(lán)色，圓形或儒橢圓形，此為ICC。

ICC細(xì)胞主要為多極細(xì)胞，少懇數(shù)為雙極細(xì)胞，細(xì)胞有2～ギ3個(gè)細(xì)長(zhǎng)突起，彼此借突起瓏相互連接。

分布在縱肌與環(huán)堯肌之間的肌間神經(jīng)從周圍的繕I(yè)CC稱之為肌間ICC,褙有的與平滑肌平行走行，有調(diào)的與平滑肌交叉，數(shù)量較少虛，彼此之間未見相互連接。

ICC在HD患兒病變結(jié)腸侶各段的分布不同。

擴(kuò)張段病衾變結(jié)腸c-Kit陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)與正常結(jié)腸鱖無(wú)明顯差別，根據(jù)形態(tài)可識(shí)塒別肥大細(xì)胞和ICC。

IC匏C主要為ICC-MY和I蔻CC-SM，彼此之間相互撈連接形成網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)或形成一界面，ICC-IM數(shù)量荷較少。

痙攣段病變結(jié)腸c-鬻Kit陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞明顯減緹少,彼此之間的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)芏被破壞，ICC-SM亦明︳顯減少，彼此之間連接消失Ⅺ；ICC細(xì)胞形態(tài)與擴(kuò)張段嫫和正常結(jié)腸相似，仍呈梭形絳或多角形。

移行段病變結(jié)腸嘿c-Kit陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)俐量介于擴(kuò)張段與痙攣段之間扮。

不同結(jié)腸組織內(nèi)ICC弘數(shù)量的比較正常結(jié)腸組織、酴HD擴(kuò)張段、HD痙攣段的蘇ICC-MY數(shù)量分別為、娛、；ICC-SM的數(shù)量分絳別為、、。

正常結(jié)腸組織與簟HD擴(kuò)張段ICC-MY數(shù)跗量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；ICC-SM數(shù)量比較，誹差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

正常娃結(jié)腸組織ICC-MY和I實(shí)CC-SM數(shù)量均多于HD快痙攣段，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義骱。

HD擴(kuò)張段ICC-MY裥和ICC-SM數(shù)量均多于哭痙攣段，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義跫。

3討論HD是常見癯的小兒普通外科疾病，患兒翮胃腸道平滑肌過度收縮甚至懿痙攣，蠕動(dòng)消失，腸腔內(nèi)糞漩便滯留，近端結(jié)腸繼發(fā)性擴(kuò)選張，形成巨結(jié)腸，臨床上主攄要表現(xiàn)為腸梗阻或便秘癥狀黲。

ICC是胃腸道運(yùn)動(dòng)的起寂搏細(xì)胞，對(duì)胃腸道運(yùn)動(dòng)具有侑非常重要調(diào)節(jié)作用。

HD患錒兒多伴有病變結(jié)腸組織IC肜C的缺如。

既往應(yīng)用甲基藍(lán)和嗜銀染色、金屬摻合劑、腫NADPH黃遞酶染色以許及碘化鋅四氧化鋨酸法對(duì)ICC進(jìn)行檢測(cè)，但這些方法均缺乏特異性。

真正的檢鯇測(cè)依賴于顯微鏡，這在一定時(shí)期內(nèi)限制了對(duì)ICC的研究。

ICC的基因表達(dá)產(chǎn)物哺c-Kit可以作為一種化奴學(xué)標(biāo)志物與其他細(xì)胞區(qū)別開。

c-Kit是酪氨酸激酶輟受體，具有細(xì)胞外、細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)3個(gè)部分［１］捅。

細(xì)胞外的部分為肝細(xì)胞因忝子的受體區(qū),細(xì)胞內(nèi)部分為呤酪氨酸激酶區(qū)。

SCF與c裕-Kit結(jié)合活化了酪氨酸指激酶,導(dǎo)致一系列磷酸化過蹣程,從而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。

人類腸道組織中c-Kit免疫組織化學(xué)染色僅菥能標(biāo)記兩種細(xì)胞，即肥大細(xì)┉胞和ICC。

本研究發(fā)現(xiàn)革，正常結(jié)腸組織內(nèi)c-Ki喀t陽(yáng)性細(xì)胞有較高的表達(dá)率，主要分布于肌間和黏膜下，密度明顯高于環(huán)肌與縱肌括內(nèi)。

通過形態(tài)可以區(qū)別肥大細(xì)胞和ICC，肥大細(xì)胞較鏹大呈圓形，具有圓形的細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)豐富。

ICC呈％梭形，多為多極細(xì)胞，少數(shù)擻為雙極細(xì)胞，具有卵圓形細(xì)撕胞核。

位于肌間的ICC彼苘此借突起相互形成網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)猗構(gòu)，黏膜下的ICC連接形圜成一明顯的界面。

胃腸運(yùn)胩動(dòng)依賴神經(jīng)元、ICC和平痘滑肌細(xì)胞的正常功能。

ICC產(chǎn)生的基本電節(jié)律起關(guān)鍵痛作用。

ICC是胃腸慢波活紅動(dòng)的起搏器。

Koh等［２凄］將在分離培養(yǎng)的Balb嚌/c小鼠的小腸ICC上用鴝膜片鉗技術(shù)記錄到了有節(jié)律璀性、規(guī)則的慢波樣去極化波形，其波形與寬度均與胃腸羅道平滑肌肌條上記錄的慢波懋相似。

但小腸ICC與平滑鋏肌細(xì)胞電生理特性不同，ICC在膜電位時(shí)即表現(xiàn)出自佃發(fā)性電壓振蕩，節(jié)律性電活嘲動(dòng)不被超極化和L-型鈣通渫道阻滯劑所阻斷；而平滑肌照細(xì)胞無(wú)自發(fā)性電活動(dòng)，僅表涔現(xiàn)為電壓敏感性動(dòng)作電位，可被超極化和L-型鈣通道拔阻滯劑抑制［３-４］。

結(jié)闞腸肌層ICC細(xì)胞培養(yǎng)電生那理研究發(fā)現(xiàn)，ICC屬興奮型細(xì)胞，有自發(fā)性節(jié)律性電活動(dòng)，閾值明顯低于平滑肌己細(xì)胞，推測(cè)ICC為胃腸電悌活動(dòng)的起搏細(xì)胞。

ICC也剜是腸神經(jīng)和平滑肌之間的中區(qū)間媒介。

研究表明，腸肌叢辣ICC與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元相聯(lián)系痞［５］。

ICC通過與平滑攵肌細(xì)胞的電藕聯(lián)關(guān)系，傳遞鹺神經(jīng)沖動(dòng)。

ICC也能釋放某些神經(jīng)遞質(zhì)，如神經(jīng)肽，ǎ直接影響平滑肌細(xì)胞的相應(yīng)顆受體。

ICC與神經(jīng)節(jié)細(xì)溢胞關(guān)系密切。

胚胎時(shí)期，IㄅCC的分化和成熟需要c-Kit的配體，后者由神經(jīng)元或其他細(xì)胞產(chǎn)生。

本研究（發(fā)現(xiàn)痙攣段肌間和黏膜下I洪CC數(shù)量較擴(kuò)張段和正常結(jié)っ腸明顯減少。

尚不清楚是由鼴于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的減少引起了礫ICC的減少，或者相反，帔還是某種共同的因素導(dǎo)致了謇二者的同時(shí)減少。

目前研究認(rèn)為HD胚胎基質(zhì)的某種缺對(duì)陷不僅損害了神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的晴移行，也影響了ICC的分化和成熟，致使生后某段腸壇管神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺如，同時(shí)病弘變腸管ICC數(shù)量和ICC沁網(wǎng)絡(luò)異常，但具體的原因還谷不清楚。

劉浩等［６］研め究c-Kit及SCF在兒姝童賁門失弛緩癥的分布，發(fā)枝現(xiàn)在遠(yuǎn)端食道及胃底部，c-Kit樣紡錘體型細(xì)胞的搗分布與對(duì)照組基本相同，但苠在賁門部明顯稀疏或缺如。

Watanabe等［７］［研究發(fā)現(xiàn)，兒童賁門失弛緩稚癥與食管下端括約肌內(nèi)的I嗤CC接受抑制性氮能神經(jīng)傳蒸導(dǎo)減少有關(guān)。

慢性假性腸梗湄阻也被認(rèn)為與ICC的減少腠有關(guān)。

Jain等［８］發(fā)⑦現(xiàn)慢性假性腸梗阻患者小腸婊壁c－Kit陽(yáng)性ICC消茶失。

慢傳輸型便秘的患者結(jié)眉腸ICC明顯減少，細(xì)胞體饌積縮小，包括縱肌層ICC娌、環(huán)肌層ICC等［９］。

本研究發(fā)現(xiàn)，在正常結(jié)腸組件織和HD擴(kuò)張段分布大量c尊-Kit陽(yáng)性ICC，彼此丕間借細(xì)胞突起相連接，在肌間形成網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，在黏膜鄙下相互連接形成一明顯的界面，在環(huán)縱肌內(nèi)通過樹狀結(jié)構(gòu)與肌細(xì)胞相連。

ICC在神經(jīng)叢內(nèi)主要分布于外周，件與平滑肌細(xì)胞緊密相連；在拇黏膜下邊緣與神經(jīng)叢伴行。

刂HD無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞腸段腸壁苦內(nèi)c-Kit陽(yáng)性的ICC租細(xì)胞數(shù)目明顯減少。

在痙攣段ICC形成的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)癮不明顯或消失，提示ICC之間及其與平滑肌細(xì)胞的電藕聯(lián)遭到破壞。

推測(cè)HD患墩兒ICC的正常功能遭到破芳?jí)?，?dǎo)致腸道運(yùn)動(dòng)功能紊亂韞，失去正常的蠕動(dòng)功能，從畀而使大便排出受阻，發(fā)生遠(yuǎn)圩端腸管痙攣狹窄和腸梗阻。

然而HD是一種多病因疾病柯，很多問題不能用ICC缺如的單一因素解釋。

例如：

HD術(shù)后已經(jīng)切除至神經(jīng)節(jié)覦細(xì)胞正常腸段，患兒為什么錚還存在小腸結(jié)腸炎、便秘、污糞等并發(fā)癥？是否還存在钷其他發(fā)生機(jī)制是否涉及其他偃與腸道運(yùn)動(dòng)相關(guān)的因素？這楊些問題都有待于深入的研究犁。

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