AG490在膀胱癌中的抗癌效應(yīng)及其機制

1/1AG490在膀胱癌中的抗癌效應(yīng)及其機制AG490在膀胱癌中的抗癌效應(yīng)及其機制作者：

姚林方，葉章群，陳志強，劉冠琳，孔德波，楊為民【摘要】目的觀察JAK2激酶抑制劑AG490對膀胱癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并探討其抗癌機制。

方法應(yīng)用不同劑量AG490處理膀胱癌細(xì)胞系BIU87，臺盼藍排斥試驗檢測細(xì)胞活力，噻唑藍比色試驗檢測細(xì)胞增殖，克隆形成試驗進一步檢測膀胱癌細(xì)胞系干細(xì)胞對藥物的敏感性，Hoechst33258/PI熒光雙染檢測細(xì)胞凋亡特征，流式細(xì)胞儀檢測營細(xì)胞周期和凋亡，West吹ernblot檢測pJ膃AK2、STAT3、p刊STAT3、CyclinD1、bclxL蛋白表沮達水平；并建立膀胱癌荷瘤≌模型，觀察AG490體內(nèi)钷抗腫瘤作用。

結(jié)果AG490明顯抑制膀胱癌細(xì)胞增殖散和干細(xì)胞克隆形成，使細(xì)胞還周期阻滯，促進膀胱癌細(xì)胞肫凋亡；并可使pJAK2蕓、STAT3、pSTA超T3、CyclinD1、┿bclxL蛋白表達水平明顯下降。

裸鼠移植瘤在AミG490的作用下明顯縮小。

結(jié)論AG490通過阻斷STAT3信號通路，抑制镥膀胱癌細(xì)胞的增殖，促進其х調(diào)亡。

【關(guān)鍵詞】膀胱灑癌；AG490；信號通路；抗癌效應(yīng)TheMec慷hanismofAnti︼cancerEffectsofJanusKinaseInhibitorA穗G490inHumanB間ladderCancer龜Abstract：

ObjectiveToi茁nvestigatetheanticancere冱ffectsofJanu徘sKinasesele怊ctiveinhibit來orAG490inhumanbladderTh綢ebladdercanc巹ercelllineBI良U87wastreat菩edwithAG490i胄ndifferentdo泖ses.Thecellvitalityandproliferationw羸eredetectedb糴yTrypanBlues迤tainingrejec蒲tion,cellcou徘ntingandMTTa怊ssay.Drugsen繽sitivityofbl仰addercancers詁temcellstoAGⅩ490wasdetect枵edbyclonefor黹mationcounti伽ngassay.Fluorescencedyes妹tuffHoechst3ⅷ3258andPIdou訣blestaining驏assaywasused蜊toinvestigatethecellapoptosischaract鋰eristics.Flo褪wcytometrywa鑌sappliedtoan括alyzethecellcycleandapop憔tosis.Theexpressionsofph晾osphorylatio說nspecificJA趄K2(pJAK2),S肅TAT3,phosphorylationspe擂cificSTAT3(pSTAT3),Cycl均inD1andbclx━LweremeasuredbywesternA睽G490couldrem輇arkablyinhibittheprolifeСrationofbladdercancercel綏lsandtheform晌ationofthetumorstemcellc澡lones,blockt憬hecellcycle,炅facilitatetheapoptosisofbladdercance莫rcells,andre痔sultinlessex蹄pressionofpJAK2,STAT3,p癱STAT3,CyclinD1andbclA班G490showedst╃rongabilitie苑sofinhibitin尹gtheprolifer敦ationofbladd叻ercancercell芫sandinducingthEirapoptos筋isthroughblo室ckingtheSTAT緒3signalingpathway.Keywo砜rds：

Bladderc粟ancer；AG490；黻Signalingpat岢hway；Anticancereffects0＊引言膀胱癌是我國泌尿系最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率居泌尿系腫瘤首位，至今殖仍無特異的抗癌藥物。

信號儇轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(S芭ignaltransdu餃cerandactiva洶toroftranscr蕓iption3，STAT醣3)信號通路是當(dāng)前細(xì)胞因嗪子研究領(lǐng)域的熱點，該通路鈕異?；罨c細(xì)胞異常增殖和郄惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。

而STAT3信號通路的異?；罨髟从贘AK2激酶的異常激噻活[1]。

研究發(fā)現(xiàn)JAK鍬2激酶抑制劑AG490可猾特異性阻斷STAT3信號攉通路，抑制腫瘤細(xì)胞生長，備在白血病治療方面顯示良好⒈的抗腫瘤效應(yīng)[2]。

我們利用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和體陶內(nèi)移植瘤模型，觀察了AGВ490對膀胱癌細(xì)胞增殖和鄴凋亡的影響，了解AG49韓0在膀胱癌中的抗癌效應(yīng)，骸并進一步探討其抗癌機制。

鈕1材料與方法材料少膀胱癌細(xì)胞系BIU8腴7購自武漢大學(xué)中國典型培武養(yǎng)物保藏中心，用含10%悒胎牛血清的完全RPMIト1640培養(yǎng)液，在37℃邈、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)醴。

氰基N芐苯乙烯鈳胺(AG490)購自美國菇Calbiochem公司瞠。

胰蛋白酶、噻唑藍(MT業(yè)T)、二甲基亞砜(DMSO)、雙苯并咪唑染料(Hoechst33258)靈和碘化丙啶(PI)均購自肋美國SIGMA公司。

An荼nexinⅤFITC凋惶亡檢測試劑盒購自晶美生物ヵ工程有限公司。

Westernblot采用一抗和堿御性磷酸酶標(biāo)記的二抗。

BA輝LB/c裸小鼠(nu/n妞u)購自中科院上海實驗動詠物中心，均為雄性，4～6韋周齡，體重18～22g。

方法臺盼藍排斥試葵驗細(xì)胞經(jīng)不同濃度AG翳490處理24、48和7糙2h后，制成單個細(xì)胞懸液ｒ，取9滴細(xì)胞懸液移入小試管中，加1滴%臺盼藍溶液の混勻，在3min內(nèi)用血球計數(shù)板分別計數(shù)活細(xì)胞和死辭細(xì)胞數(shù)，活細(xì)胞率(%)=疴活細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞總數(shù)訶+死細(xì)胞總數(shù))100%MTT法細(xì)胞接種傈于96孔板中，貼壁后無血ㄗ清培養(yǎng)24h，使細(xì)胞同步化。

按上述方法處理細(xì)胞，分別培養(yǎng)24、48和72h后，每孔加入MTT溶液舅20l，繼續(xù)孵育4h，掛終止培養(yǎng)，吸盡孔內(nèi)上清。

每孔加入150lDMS轉(zhuǎn)O，振蕩10min，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定570劁nm波長處光吸收值。

細(xì)胞刳抑制率=100%。

戕克隆形成試驗制備單個璧細(xì)胞懸液，作梯度倍數(shù)稀釋逸，按每皿300個細(xì)胞接種地于培養(yǎng)皿中，細(xì)胞同步化和豎AG490處理同前，更換榧完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2周后＞，用PBS浸洗2次，甲醇磣固定后，加適量姬姆薩染色纊，浸洗干燥，計數(shù)克隆數(shù)。

做50個細(xì)胞以上的集落算一灤個克隆，克隆形成率=克隆唄數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)100%啜Hoechst332鄲58/PI熒光雙染在際6孔板中鋪板爬片，細(xì)胞同煥步化和AG490處理同前悄，加入Hoechst33鎖258100l，37℃襯避光反應(yīng)10min。

繼續(xù)鉀加入PI100l，4℃避光反應(yīng)20min。

4%乖多聚甲醛固定細(xì)胞10min后，置于熒光顯微鏡下觀濠察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及胞核的變販化，每張玻片隨機選擇10仙個視野并計數(shù)，區(qū)分出壞死滔、凋亡和活細(xì)胞，并計算出簍凋亡率、壞死率及存活率。

攆細(xì)胞周期檢測細(xì)胞接芒種于6孔板，細(xì)胞處理同上是，收集細(xì)胞，PBS洗滌，￥70%冰乙醇固定，PI染色，應(yīng)用FACSort流臠式細(xì)胞儀進行檢測，數(shù)據(jù)用橘美國BD公司CellQu花est細(xì)胞周期分析軟件進鈞行儲存及分析。

細(xì)胞凋亡檢測用4℃預(yù)冷的P暄BS洗細(xì)胞2次，用250啪l結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，戒使其濃度為1106/m睜l。

取100l的細(xì)胞懸尹液于5ml流式管中，加入銠5lAnnexinⅤ苫FITC和10lPI溶覡液，混勻后于室溫避光孵育縮15min，再加入400びlPBS，上流式細(xì)胞儀逐檢測。

Western仄blot法參照美國Sa楠ntaCruz公司提供的蚓方法提取蛋白。

以Brad┼ford法作蛋白定量后，罨取50g蛋白經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，粽電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，3坌7℃封閉1h后，分別加入倘1∶1000稀釋的一抗p痂JAK2、STAT3、pSTAT3、CyclinD1、bclxL后巷4℃過夜，加入堿性磷酸酶值標(biāo)記的二抗檢測雜交蛋白。

膊體內(nèi)移植瘤抑制試驗制備細(xì)胞懸液接種于裸鼠背部，每個部位注射(含5熬106個活細(xì)胞)，當(dāng)瘤塊婧成形，直徑達～時，即將動鏤物隨機分組，對照組腹腔注︷射生理鹽水，實驗組腹腔注翠射AG490。

AG490每5mg用1mlDMSO+19mlddH2O充分溶解，每次腹腔注射10m精g/kg體重。

以上兩組均蝣隔日注射1次，4天測腫瘤辮體積1次，用藥21天頸椎參脫位處死裸鼠，完整剝離瘤體，分別稱量瘤重。

計算瘤諉體積=長寬2，單位c入m3，抑瘤率(%)=(1用藥組平均瘤重/陰性對馘照組平均瘤重)100%統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)以檣s表示，組間比較采用兩樣蜉本均數(shù)的t檢驗，應(yīng)用統(tǒng)計徭軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析。

鑌2結(jié)果臺盼藍陽排斥試驗和MTT實驗結(jié)果閎見圖1、2。

隨著AG49ぉ0藥物濃度增大和作用時間換的延長，BIU87細(xì)胞仿活力不斷下降，AG490對細(xì)胞的抑制率不斷增加，細(xì)胞增殖明顯受到抑制，而鏨相應(yīng)空白對照組變化不明顯衷，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

作用72h后，不同濃度(25崳、50、100mol/澶L)的AG490對BIU賢87細(xì)胞的抑制率分別為塹%、%、%。

克隆形成恁試驗進一步檢測膀胱癌細(xì)胞虜系干細(xì)胞對藥物的敏感性，爹見表1。

可見隨著AG49⒋0藥物濃度的不斷增大，B荔IU87干細(xì)胞克隆數(shù)明丕顯減少，克隆形成率從%降至%。

不同濃度(25、5頎0、100mol/L)筱的AG490對BIU8銖7細(xì)胞克隆形成的抑制率分艨別為%、%、%。

表1A枷G490對BIU87干互細(xì)胞克隆形成的影響與空弳白對照組比較，*P與空白轄對照組比較，*P流式細(xì)胞凋亡檢測發(fā)現(xiàn)AG490眚明顯促進BIU87細(xì)胞的早期凋亡，見表4。

10鏘0mol/LAG490坭作用72h后，細(xì)胞早期凋影亡率由%增加至%，具有顯肼著性差異。

表4流式細(xì)胞分析檢測細(xì)胞早期凋亡與舵空白對照組比較，*P膀竿胱癌細(xì)胞接種于裸鼠皮下1謀周后，可見背部成形的瘤塊耦，移植成功率為100%。

げAG490組與陰性對照組琨比較，其腫瘤生長速度顯著煲減慢，見圖4。

用藥21天助后處死所有裸鼠，測抑瘤率個為%。

3討論STAT3信號通路是調(diào)控細(xì)胞增搶殖、分化及凋亡的重要的細(xì)憨胞內(nèi)信號通路。

JAK2作蕞為上游激酶活化后募集胞漿倍中的STAT3單體，使無活性的STAT3分子酪氨孟酸磷酸化而形成有活性的二嗬聚體，轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核，結(jié)合幡DNA，導(dǎo)致特定靶基因的釘開啟[3]。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，該通路持續(xù)激活可導(dǎo)致季細(xì)胞異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化，嚷參與了人類惡性腫瘤的發(fā)生迢、發(fā)展和演進[4]。

越來讀越多的腫瘤細(xì)胞系和人類癌骷組織表達異常活化的STA楷T3蛋白[5]。

阻斷該通ュ路成為腫瘤治療的新靶點[訓(xùn)6]。

目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)AG醯490是該通路的特異性阻鍬斷劑。

AG490即富氰基N芐苯乙烯胺，是盜一種人工合成的苯亞甲基丙二腈的脂類衍生物，分子式為C17H14N2O3，分子量為，結(jié)構(gòu)類似酪氨酸趙，可以和受體酪氨酸激酶競爭結(jié)合位點，是JAK2激溝酶抑制劑，可特異性阻斷S棰TAT3信號通路[7]。

目前，AG490作為抗腫苓瘤藥物已用于臨床治療白血髓病，特別是對JAK2異常剴活化導(dǎo)致的前B急性淋巴細(xì)膛胞白血病具有很好的治療作篙用，同時毒副作用很小[2寶]。

在本實驗中，我們應(yīng)钚用AG490作用于膀胱癌⒛BIU87細(xì)胞后，細(xì)胞鏡增殖速度明顯減慢，顯著抑菌制了膀胱癌細(xì)胞系干細(xì)胞的共克隆形成能力，細(xì)胞周期被樂阻滯于G1/S期，明顯促客進膀胱癌細(xì)胞凋亡，顯著抑搜制裸鼠移植瘤生長，抑瘤率惜高達%；并可使JAK2活嘜化蛋白pJAK2和ST槧AT3蛋白及其活化蛋白p刨STAT3表達與活性明隆顯下降，有效阻斷了STA⒓T3信號通路的激活，最終鄆使靶基因細(xì)胞周期關(guān)鍵粒調(diào)控基因cyclinD1俚和凋亡抑制基因BclxL的蛋白表達水平明顯下降顰。

由此可見，AG490通嗚過阻斷STAT3信號通路鐒，抑制細(xì)胞周期關(guān)鍵調(diào)控基系因cyclinD1的表達汐，明顯抑制膀胱癌細(xì)胞的增⑷殖，阻斷凋亡抑制基因bc蔞lxL的表達，促進膀胱砬癌細(xì)胞的調(diào)亡，但其具體作新用機制有待進一步研究。

總克之，AG490通過阻斷S筘TAT3信號通路發(fā)揮抗癌陣作用，有望成為膀胱癌治療縉的新型藥物。

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