重組DNA技術(shù)的基本工具課件 【知識精講精研】高二下學(xué)期生物人教版（2019）選擇性必修3+

我國是棉花的生產(chǎn)和消費(fèi)大國。棉花在種植過程中，常常會受到一些害蟲的侵襲，其中以棉鈴蟲最為常見。普通棉花轉(zhuǎn)基因抗蟲棉已知：蘇云金芽孢桿菌含有一種抗蟲基因。蘇云金桿菌轉(zhuǎn)基因抗蟲棉抗蟲基因基因工程：指按照人們的愿望,通過轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性,創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計和施工的，因此又叫作重組DNA技術(shù)?！練w納定義】工程別名：操作對象：操作水平：

工程實質(zhì)：第3章

基因工程重組DNA技術(shù)基因DNA分子水平基因重組基因工程的誕生和發(fā)展①1944年，艾弗里等人通過肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實驗證明了遺傳物質(zhì)是________，還證明了DNA可以在同種生物的不同個體之間轉(zhuǎn)移。②1953年，沃森和克里克建立了___________________模型并提出了遺傳物質(zhì)自我復(fù)制的假說。③20世紀(jì)70年代初，多種限制酶、____________酶和逆轉(zhuǎn)錄酶被相繼發(fā)現(xiàn)，為DNA的切割、連接創(chuàng)造了條件。④1973年，科學(xué)家證明________可以作為基因工程的載體，構(gòu)建___________，使外源基因在原核細(xì)胞中成功表達(dá)，并實現(xiàn)物種間的基因交流。⑤1985年，穆里斯等人發(fā)明______，為獲取目的基因提供了有效手段。DNADNA雙螺旋結(jié)構(gòu)DNA連接質(zhì)粒重組DNAPCR1.基因是什么？2.基因的功能是什么？基因通過控制蛋白質(zhì)的合成，直接或間接控制生物的性狀。轉(zhuǎn)錄DNAmRNA蛋白質(zhì)翻譯——體現(xiàn)相關(guān)的生物性狀知識回顧——基因基因通常是有遺傳效應(yīng)的DNA片段。①DNA中文全稱:

②組成元素:

③基本單位:

脫氧核糖核酸CHONP脫氧核糖核苷酸=磷酸

+

脫氧核糖

+

含氮堿基脫氧核糖含氮堿基磷酸1′4′3′2′5′ATCG脫氧核苷酸(4種)知識回顧——DNA胞嘧啶脫氧核苷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸

胸腺嘧啶脫氧核苷酸腺嘌呤脫氧核苷酸脫氧核糖A磷酸脫氧核糖G磷酸脫氧核糖T磷酸T磷酸脫氧核糖C磷酸脫氧核糖A磷酸脫氧核糖磷酸二酯鍵脫氧核苷酸如何連接成脫氧核苷酸鏈的呢？知識回顧——DNA氫鍵雙螺旋結(jié)構(gòu)知識回顧——DNADNA的結(jié)構(gòu)特點：5’3’3’5’知識回顧——DNA②

和

交替連接，排列在外側(cè)，構(gòu)成

；

排列在內(nèi)側(cè)。③兩條鏈上的堿基通過

連接成堿基對，且遵循

。①DNA是由兩條單鏈組成的，這兩條鏈按

方式盤旋成雙螺旋結(jié)構(gòu)。反向平行脫氧核糖磷酸堿基基本骨架氫鍵堿基互補(bǔ)配對原則……ATGCCGTGGAATTCC…………TACGGCACCTTAAGG……①②①磷酸二酯鍵②氫鍵簡圖：知識回顧——DNA基因工程（重組DNA技術(shù)）拼接的基礎(chǔ)1.DNA的基本組成單位相同（四種脫氧核苷酸）2.都遵循堿基互補(bǔ)配對原則3.DNA分子的空間結(jié)構(gòu)都是規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)表達(dá)的基礎(chǔ)1.基因是控制生物性狀的結(jié)構(gòu)與功能單位2.遺傳信息的傳遞都遵循中心法則3.生物界幾乎共用一套遺傳密碼1.為什么不同生物的DNA分子能拼接起來2.為什么一種生物的基因可以在另一種生物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)？3.1重組DNA技術(shù)的基本工具普通棉花(無抗蟲特性)抗蟲基因問題1：剪下來的抗蟲基因能否直接把它導(dǎo)入到棉花體內(nèi)？不可行;因為目的基因直接導(dǎo)入受體細(xì)胞后無法穩(wěn)定存在和進(jìn)行自我復(fù)制以及表達(dá)。普通棉花(無抗蟲特性)“分子縫合針”“分子運(yùn)輸車”抗蟲基因與載體DNA拼接，再導(dǎo)入重組DNA技術(shù)的基本工具分子手術(shù)刀分子縫合針分子運(yùn)輸車限制性內(nèi)切核酸酶DNA連接酶載體準(zhǔn)確切割DNA分子將DNA片段連接起來將體外重組好的DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞“分子手術(shù)刀”“分子縫合針”“分子運(yùn)輸車”01

限制性內(nèi)切核酸酶—“分子手術(shù)刀”一、限制性內(nèi)切核酸酶——“分子手術(shù)刀”1.來源：

主要從原核生物中分離純化出來簡稱限制酶2.種類：

數(shù)千種常見的有：EcoR

I

、Sma

Ⅰ

注意：限制酶不是一種酶，而是一類酶。流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)d株中分離到第一種限制酶，則分別命名為:

。

HindI用生物屬名的頭一個字母與種名的頭兩個字母，組成了3個字母的略語，以此來表示這個酶是從哪種生物中分離出來的。例如，一種限制酶是從大腸桿菌(Escherichiacoli)的R型菌株分離來的，就用字母EcoR表示；如果它是從大腸桿菌R型菌株中分離出來的第一種限制酶，則進(jìn)一步表示成EcoRI。資料卡：限制酶的命名練習(xí)：粘質(zhì)沙雷氏桿菌（Serratiamarcesens）中分離的第一種限制酶即_______；Sma

Ⅰ

HindⅡHindⅢ磷酸二酯鍵一、限制性內(nèi)切核酸酶——“分子手術(shù)刀”簡稱限制酶3.功能：

能夠識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開。（特點：專一性）“兩個特定”只能識別GAATTC序列，并在G與A之間切割只能識別CCCGGG序列，并在C與G之間切割5'5'3'3'5'5'3'3'EcoRI限制酶SmaI限制酶磷酸二酯鍵5’ATGCTACG3’5’3’21限制酶的識別序列及切割位點：

①大多數(shù)限制酶的識別序列由___個核苷酸組成，也有少數(shù)限制酶的識別序列由___個、___個或

的核苷酸組成。648其他數(shù)量②能被限制酶特異性識別的切割位點一般都是回文序列：即在切割位點，DNA一條鏈正向讀的堿基序列與另一條反向讀的堿基序列完全一致。注意：限制酶識別過程具有方向性都是從5’→3’開始讀【反饋練習(xí)】1.下面哪項不具有限制酶識別序列的特征（）A．GAATTCB．GGGGCCCCCTTAAGCCCCGGGGC．CTGCAGD．CTAAATCGACGTCGATTTAGD切割結(jié)果：

產(chǎn)生黏性末端、平末端EcoRⅠ(在G與A之間切割)中軸線黏性末端平末端SamⅠ(在G與C之間切割)黏性末端黏性末端識別序列：

GAATTC切割部位：GA之間的磷酸二酯鍵形成黏性末端（從5’往3’讀）：AATT①形成

個相同（互補(bǔ)）的黏性末端可斷開

個磷酸二酯鍵

消耗

分子水

22②形成___個游離的磷酸基團(tuán)2③產(chǎn)生___個切口12黏性末端：限制酶在它識別序列的中心軸線兩側(cè)，將DNA分子的兩條鏈分別切開時，切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個伸出的核苷酸，它們之間正好互補(bǔ)配對，這樣的切口是黏性末端。平末端：當(dāng)限制酶從識別序列的中心軸線處切開時，切開的DNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端。例：SmaⅠ只能識別CCCGGG序列，并在C和G之間切開。可斷開

個磷酸二酯鍵

①形成

個相同平末端消耗

分子水

②形成___個游離的磷酸基團(tuán)2222③產(chǎn)生___個切口1平末端CGCCGGGCGCGC5'3'3'5'CGCCGGGCGCGCBamHⅠ

；

EcoRⅠ

；HindⅢ

；BglⅡ

。1.寫出下列限制酶切割形成的黏性末端：GATCAATTAGCTGATC思考：同種限制酶切割的黏性末端一定相同嗎？不同種限制酶切出的黏性末端一定不同嗎？同種限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端相同，不同限制酶可能會形成相同的黏性末端【反饋練習(xí)】2.請判斷：以下黏性末端是由______種限制酶作用產(chǎn)生的。3做題技巧：注意觀察識別序列和切割位點①找到切割位點②補(bǔ)全序列【反饋練習(xí)】你能推測限制酶存在于原核生物中的作用是什么嗎？

原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在長期的進(jìn)化過程中形成了一套完善的防御機(jī)制，以防止外來病原物的侵害。限制酶就是細(xì)菌的一種防御性工具，當(dāng)外源DNA侵入時，會利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的。為什么限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA？通過長期的進(jìn)化，細(xì)菌中含有某種限制酶的細(xì)胞，其DNA分子中不具備這種限制酶的識別切割序列，或者通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。這樣，盡管細(xì)菌中含有某種限制酶也不會使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵。【思維拓展】G

AA

TT

CC

TT

AA

GG

AA

TT

CC

TT

AA

GG

C

TT

AA

AA

T

T

C

GGC

TT

A

A

AA

T

T

C

G用同種限制酶切割(EcoRⅠ)把兩種來源不同的DNA進(jìn)行重組，應(yīng)該怎樣處理？思考：G

C

TT

AA

AA

T

T

C

GGCTTAA

AA

TT

C

G

缺口怎么辦？02DNA連接酶

—“分子縫合針”1.作用：將兩個DNA片段連接起來，恢復(fù)被限制酶切開的磷酸二酯鍵。

（注意：不是連接氫鍵，氫鍵的形成不需要酶的催化）2.DNA連接酶的種類：二、DNA連接酶——“分子縫合針”（1）E.coliDNA連接酶來源于大腸桿菌，只連接黏性末端AGTCATTCGATATCGATC兩DNA片段要具有互補(bǔ)的黏性末端才能拼起來。（2）T4DNA連接酶來源于T4噬菌體，既能連接黏性末端，又能連接平末端（但連接平末端的效率相對較低）。*基因工程中通常形成黏性末端類型E.coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源

功能只能將具有互補(bǔ)

的DNA片段連接起來“縫合”兩種末端，但連接

的效率相對較低結(jié)果恢復(fù)被限制酶切開的兩個核苷酸之間的

。大腸桿菌T4噬菌體黏性末端平末端磷酸二酯鍵注意：DNA連接酶沒有識別序列的特異性GAGTATCDNA連接酶DNA連接酶ATAGTCCGAATTDNA連接酶：連接兩個DNA片段CAATTDNA聚合酶DNA聚合酶：以DNA的一條鏈作為模板，連接游離的脫氧核苷酸，形成磷酸二酯鍵。思考：DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？（72頁）DNA連接酶DNA聚合酶相同點作用實質(zhì)化學(xué)本質(zhì)不同點模板作用對象作用結(jié)果用途都能催化形成磷酸二酯鍵都是蛋白質(zhì) 不需要以DNA的一條鏈為模板形成完整的重組DNA分子形成DNA的一條鏈基因工程DNA復(fù)制只能催化兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵DNA連接酶與DNA聚合酶的比較只能將單個核苷酸連接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯鍵40幾種相關(guān)酶的比較：名稱作用部位作用結(jié)果限制酶

DNA連接酶DNA聚合酶DNA(水解)酶解旋酶磷酸二酯鍵堿基對之間的氫鍵將DNA切成兩個片段磷酸二酯鍵將兩個DNA片段連接為一個DNA分子磷酸二酯鍵將單個脫氧核苷酸依次連接到單鏈末端磷酸二酯鍵將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈①限制酶

②解旋酶

③DNA連接酶

④DNA聚合酶

⑤RNA聚合酶baA.切斷a處的酶為_______

B.連接a處的酶為_______C.切斷b處的酶為_______①③④②a：磷酸二酯鍵；b：氫鍵【反饋練習(xí)】【反饋練習(xí)】

如圖為DNA分子在不同酶的作用下所發(fā)生的變化，圖中依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA連接酶、解旋酶作用的正確順序是(

)A．①②③④ B．①②④③C．①④②③D．①④③②C03基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體

—“分子運(yùn)輸車”44將

送入受體細(xì)胞，在受體細(xì)胞內(nèi)對目的基因進(jìn)行大量復(fù)制。

1.作用：

三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體

——“分子運(yùn)輸車”外源基因擬核DNA質(zhì)粒大腸桿菌氨芐青霉素抗性基因目的基因插入位點復(fù)制起點大腸桿菌及質(zhì)粒結(jié)構(gòu)模式圖(1)有一個至多個

，供外源DNA片段（基因）插入其中。限制酶切割位點(2)能夠在宿主細(xì)胞中

或整合到

上，隨受體DNA同步

。自我復(fù)制受體DNA復(fù)制(3)具有特殊的

，便于重組DNA分子的

。標(biāo)記基因篩選(4)對受體細(xì)胞無害、易分離，大小合適、方便操作。標(biāo)記基因通常有：①抗生素的抗性基因，如：抗氨芐青霉素基因(ampr)、抗四環(huán)素基因(tetr)。②熒光蛋白基因，如：綠色熒光蛋白基因(GFP)、紅色熒光蛋白基因(RFP)。2.載體應(yīng)具備的條件：

知識拓展

載體上的標(biāo)記基因一般是某種抗生素的抗性基因，而受體細(xì)胞沒有抵抗該抗生素的能力。將含有某抗生素抗性基因的載體攜帶目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，抗性基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，受體細(xì)胞對該抗生素產(chǎn)生抗性。在含有該抗生素的培養(yǎng)基上，能夠生存的是被導(dǎo)入了載體的受體細(xì)胞。質(zhì)粒動、植物病毒噬菌體3.種類：質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨(dú)立于真核細(xì)胞細(xì)胞核或原核細(xì)胞擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子。47真正被用作載體的質(zhì)粒，都是天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過人工改造的。種類用途不同點

質(zhì)粒、噬菌體植物病毒動物病毒將外源基因?qū)氪竽c桿菌等受體細(xì)胞將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞將外源基因?qū)雱游锛?xì)胞它們來源不同，在大小、結(jié)構(gòu)、復(fù)制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差別思考：噬菌體或某些動植物病毒作為載體，其原理是

。病毒對宿主細(xì)胞的侵染具有一定的

性。利用病毒對宿主細(xì)胞的侵染性物種（組織）特異若用家蠶作為某基因表達(dá)載體的受體細(xì)胞，在噬菌體和昆蟲病毒兩種載體中，不選用

作為載體，其原因是

。噬菌體噬菌體的宿主細(xì)胞是細(xì)菌，而不是家蠶限制酶DNA連接酶載體①對受體細(xì)胞無害；②有一個至多個限制酶切割位點；③有特殊的標(biāo)記基因；④能自我復(fù)制或能整合到宿主DNA上。質(zhì)粒、噬菌體、動植物病毒基因工程的基本工具作為載體的條件種類：磷酸二酯鍵來源

：主要來源于原核生物特點：作用部位：具有專一性結(jié)果：形成黏性末端或平末端連接部位：磷酸二酯鍵種類：E.coliDNA連接酶、T4DNA連接酶作用：把兩條雙鏈DNA片段拼接起來

課堂小結(jié)圖甲是含有目的基因的外源DNA片段，圖乙是用于將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的質(zhì)粒（陰影部分表示抗生素抗性基因），相關(guān)限制酶的作用部位如圖所示，現(xiàn)欲培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因抗病植株，回答下列問題。1.上述操作中不宜選用SmaI，原因是SmaI會破壞

和

。2.在基因工程的操作中，不宜選用EcoRI，原因是用EcoRI切割外源DNA片段后，

。目的基因標(biāo)記基因目的基因只有一側(cè)含有黏性末端，不能插入到質(zhì)粒中練習(xí)與應(yīng)用下列操作中選用哪種限制酶切割構(gòu)建重組DNA分子？（注：AmpR表示氨芐青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因