NY-T548-2015豬傳染性胃腸炎診斷技術(shù)

1/1NY_T548-2015豬傳染性胃腸炎診斷技術(shù)ICS11..220B41B41中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)TNY/T5482015豬傳染性胃腸炎診斷技術(shù)Diagnostictechniquesfortransmissiblettiti2015-05-21發(fā)布2015-08-01實(shí)施中華人民共和國農(nóng)業(yè)部發(fā)布刖本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.12009給出的規(guī)則起草。

本標(biāo)準(zhǔn)代替NY/T5482002《豬傳染性胃腸炎診斷技術(shù)》。

本標(biāo)準(zhǔn)與NY/T5482002相比，病原檢測部分增加了RT-PCR檢測方法。

本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國農(nóng)業(yè)部提出。

本標(biāo)準(zhǔn)由全國動物防疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(SAC/TC181)歸口。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人:馮力、陳建飛、時洪艷、張鑫本標(biāo)準(zhǔn)的歷次版本發(fā)布情況為：

NY/T5482002。

豬傳染性胃腸炎診斷技術(shù)1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬傳染性胃腸炎的病原學(xué)檢測和血清學(xué)檢測。

病原學(xué)檢測包括病毒分離鑒定、直接免疫熒光法、雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和反轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。

血清學(xué)檢測包括血清中和試驗(yàn)和間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于對豬傳染性胃腸炎的診斷、產(chǎn)地檢疫及流行病學(xué)調(diào)查等。

2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。

凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。

GB/T66度接觸傳染性的腸道疾病，以嘔吐、水樣腹瀉、脫水和10日齡以內(nèi)仔豬的高死亡率為主要特征。

4縮略語下列縮略語適用于本文件。

CPE:cytopathiceffect細(xì)胞病變作用。

DIA：

directImmunofluorescenceassay直接免疫突光法。

ELISA：

enzyme-linkedimmunosorbentassay酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。

PBS:phosphatebufferedsaline憐酸鹽緩沖液。

PRCV:porcinerespiratorycoronavirus豬呼吸道冠狀病毒。

TGE：

transmissiblegastroenteritis豬傳染性胃腸炎。

RT-PCR：

reversetranscription-polymerasechainreaction反轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。

5臨床診斷5.1流行特點(diǎn)TGE的發(fā)生和流行有暴發(fā)流行、地方流行和周期性地方流行3種形式。

若感染了TGEV的變異株P(guān)RCV，則會出現(xiàn)不同的流行模式，從而使TGEV的流行更加復(fù)雜化。

本病一年四季均可發(fā)生，一般多發(fā)生在冬季和春季，有時也發(fā)生于夏季、秋季。

各種年齡的豬均可感染，尤其是1〇日齡以內(nèi)的哺乳仔豬，發(fā)病率和死亡率可高達(dá)1〇〇%。

病豬、帶毒豬和隱性感染豬是本病的主要傳染源。

病毒通過糞一口途徑、氣溶膠或感染母豬的乳汁進(jìn)行傳播。

5.2臨床癥狀本病的潛伏期較短，通常為18h至3d。

感染發(fā)生后，傳播迅速，2d～3d可波及整個豬群。

臨床表現(xiàn)因豬齡大小而異，新生仔豬的典型癥狀是嘔吐、水樣腹瀉、脫水、體重迅速下降，導(dǎo)致新生仔豬高發(fā)病率和高死亡率。

腹瀉嚴(yán)重的仔豬，常出現(xiàn)未消化的乳凝塊。

糞便腥臭，病程短，癥狀出現(xiàn)后2d～7d死亡。

泌乳母豬發(fā)病，則一過性體溫升高、嘔吐、腹瀉、厭食、無乳或泌乳量急劇減少，小豬得不到足夠乳汁，進(jìn)一步加劇病情，營養(yǎng)嚴(yán)重失調(diào)，增加了小豬的病死率。

3周齡仔豬、生長期豬和出欄期豬感染時僅表現(xiàn)厭食，腹瀉程度較輕，持續(xù)期相對較短，偶爾伴有嘔吐，極少發(fā)生死亡。

.5.3病理變化TGEV引起的腹瀉，盡管癥狀很嚴(yán)重，但是病理變化較輕微。

肉眼可見的病理變化常局限于消化道，特別是胃和小腸。

胃膨脹，胃內(nèi)充滿凝乳塊，胃黏膜充血或出血，胃大彎部黏膜淤血。

小腸壁弛緩、膨滿，腸壁菲薄呈半透明。

小腸內(nèi)容物呈黃色、透明泡沫狀的液體，含有凝乳塊。

空腸黏膜可見腸絨毛萎縮，哺乳仔豬腸系膜淋巴管的乳糜管消失。

組織學(xué)變化主要以空腸為主，從胃至直腸呈廣范圍的滲出性卡他性炎癥變化。

其特征是腸絨毛萎縮變短，回腸變化稍輕微。

小腸變化有較明顯的年齡特征，新生豬變化嚴(yán)重。

電子顯微鏡觀察，可見小腸上皮細(xì)胞的微絨毛、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及其他細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的成分變性。

在細(xì)胞質(zhì)空泡內(nèi)有病毒粒子存在。

6實(shí)驗(yàn)室診斷6.1儀器、材料與試劑6實(shí)驗(yàn)室診斷6.1儀器、材料與試劑除特別說明以外，本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑均為分析純，水為符合GB/T6682規(guī)定的滅菌雙蒸水或超純水。

倒置顯微鏡、冷凍離心機(jī)、微孔濾膜、濾器、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、蓋玻片、溫箱、熒光顯微鏡、冷凍切片機(jī)、載玻片、滴管、定量加液器、微量吸液器及配套吸頭、96孔或40孔聚乙烯微量反應(yīng)板、單通道、8通道微量吸液器及配套吸頭、二氧化碳培養(yǎng)箱、微量振蕩器及小培養(yǎng)瓶、酶標(biāo)檢測儀等。

仔豬腎原代細(xì)胞或PK15、ST細(xì)胞系。

熒光抗體(FA)，豬抗TGE-IgG及豬抗TGE-IgG-HRP，病毒抗原和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清、陽性血清，抗原和酶標(biāo)抗體。

磷酸鹽緩沖液(PBS)、細(xì)胞培養(yǎng)液、病毒培養(yǎng)液、HEPES液、0.1%伊文斯藍(lán)原液、磷酸鹽緩沖甘油、吸液、包被稀釋液、樣品稀釋液、酶標(biāo)抗體稀釋液、底物溶液、終止液(配制方法見附錄A)。

6.2病毒分離鑒定6.2.6.2病毒分離鑒定6.2.1病料處理將采集的小段空腸剪碎及腸內(nèi)容物或糞便用含10〇〇〇IU/mL青霉素、10000(ug/mL鏈霉素的磷酸鹽緩沖液(PBS)(見A.1)制成5倍懸液，在4C條件下3000r/min離心30min,取上清液，經(jīng)0?22pm微孔濾膜過濾，分裝，一20C保存?zhèn)溆谩?/p>

6.2.2接種及觀察將過濾液(病毒培養(yǎng)液的10%)接種細(xì)胞單層上，37C吸附1h后補(bǔ)加病毒培養(yǎng)液，逐日觀察細(xì)胞病變(CPE)，連續(xù)3d～4d，按CPE變化情況可盲傳2代～3代。

.6.2.3病毒鑒定CPE變化的特點(diǎn):細(xì)胞顆粒增多，圓縮，呈小堆狀或葡萄串樣均勻分布，細(xì)胞破損，脫落。

對不同細(xì)胞培養(yǎng)物，CPE可能有些差異。

分離病毒用細(xì)胞瓶中加蓋玻片培養(yǎng)，收毒時取出蓋玻片(包括接毒與不接毒對照片)用直接熒光法做鑒定。

鑒定方法和結(jié)果判定見6.3。

6.3直接免疫熒光法6.3.1樣品組織樣本:從急性病例采取空腸（中段)或腸系膜淋巴結(jié)。

6.3.2操作方法6.3.2.6.3.2操作方法6.3.2.1標(biāo)本片的制備將組織樣本制成4fxm?7冰凍切片。

或?qū)⒔M織樣本制成涂片:腸系膜淋巴結(jié)用橫斷面涂抹片；空腸則刮取黏膜面做壓片。

標(biāo)本片制好后，風(fēng)干。

于丙酮中固定15min。

再置于PBS中浸泡10min～15min,風(fēng)干。

細(xì)胞培養(yǎng)蓋玻片:將分離毒細(xì)胞培養(yǎng)24h～48h的蓋玻片及陽性、陰性對照片在PBS中沖洗3次，風(fēng)干。

于丙酮中固定15min，再置于PBS中浸泡10min～15min，風(fēng)干。

6.3.2.2染色用0.02%伊文思藍(lán)溶液（見A.5)將FA稀釋至工作濃度（1:8以上合格）。

4000r/min離心10min，取上清液滴于標(biāo)本上，37C恒溫恒濕染色30min，取出后用PBS沖洗3次，依次為3min、4min和5min，風(fēng)干。

6.3.2.3封固滴加磷酸鹽緩沖甘油(見A.6)，用蓋玻片封固。

盡快做熒光顯微鏡檢查。

如當(dāng)日檢查不完則將熒光片置于4C冰箱中，不超過48h內(nèi)檢查。

6.3.3結(jié)果判定被檢標(biāo)本的細(xì)胞結(jié)構(gòu)應(yīng)完整清晰，并在陽性、陰性對照均成立時判定。

細(xì)胞核暗黑色、胞漿呈蘋果綠色判為陽性;所有細(xì)胞槳中無特異性熒光判定為陰性。

按熒光強(qiáng)度劃為4級：

a)++++:胞漿內(nèi)可見閃亮蘋果綠色熒光；b)+++:胞漿內(nèi)為明亮的蘋果綠色熒光；c)++:胞漿內(nèi)呈一般蘋果綠色突光；d)+:胞漿內(nèi)可見微弱熒光，但清晰可見。

凡出現(xiàn)a)～d)不同強(qiáng)度熒光者均判定為陽性。

當(dāng)無特異性熒光，細(xì)胞漿被伊文斯藍(lán)染成紅色，胞核黑紅色者判為陰性。

6.4雙抗體夾心ELISA6.4.6.4.1材料準(zhǔn)備6.4.1.11材料準(zhǔn)備6.4.1.1洗液、包被稀釋液、樣品稀釋液、酶標(biāo)抗體稀釋液、底物溶液、終止液配制方法見附錄A。

6.4.1.2待檢樣品:取發(fā)病仔豬異便或仔豬腸內(nèi)容物，用濃鹽水1:5稀釋，3000r/min離心20min，取上清液，分裝，一20C保存?zhèn)溆谩?/p>

6.4.2操作方法6.4.2.6.4.2操作方法6.4.2.1沖洗包被板向各孔注人洗液(見A.7)，浸泡3min,甩干，再注人洗液，重復(fù)3次。

甩去孔內(nèi)殘液，4.3結(jié)果判定用酶標(biāo)測試儀在波長492nm下，測定吸光度(OD)值。

陽性抗原對照兩孔平均OD值0.8(參考值），陰性抗原對照兩孔平均OD值0.2為正常反應(yīng)。

按以下兩個條件判定結(jié)果:P/N(被檢抗原OD值/標(biāo)準(zhǔn)陰性抗原OD值)值2,且被檢抗原兩孔平均OD值0.2判為陽性;否則為陰性。

如其中一個條件稍低于判定標(biāo)準(zhǔn)，可復(fù)檢一次，最后仍按照兩個條件判定結(jié)果。

6.5RT-PCR6.5.1儀器、材料與試劑PCR擴(kuò)增儀、1.5mL離心管、0?2mLPCR反應(yīng)管、電熱恒溫水槽、臺式高速低溫離心機(jī)、電泳儀、微量移液器及配套吸頭、微波爐、紫外凝膠成像儀、冰箱。

TRIzol試劑、核糖核酸酶(RNase)抑制劑(40U/juL)、反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)(20011/juLKdNTPs混合物（各10mM)、無RNasedH20、Emeral-dAmp?PCRMasterMix(2X)、DL2000DNAMarker、10X或6XDNA上樣緩沖液、PBS(配制方法見附錄A)、TAE電泳緩沖液(配制方法見附錄B)、三氯甲烷、異丙醇、三羥甲基氨基甲烷(Tris堿）、瓊脂糖、乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)、冰乙酸、氯化鈉、溴化乙錠、滅菌雙蒸水。

6.5.2引物6.5.2.1反轉(zhuǎn)錄引物(F2)TTAGTTCAAACAAGGAGT-3,；引物貯存濃度為l(Vm〇l/L，使用時終濃度為500pmol/L。

6.5.2.2PCR反應(yīng)引物F1(上游引物）：

5’-ATATGCAGTAGAAGACAAT_3’;F2(下游引物）：

5TTAGTTCAAACAAGGAGT-3‘。

引物It存濃度為1〇卜mol/L，使用時終濃度為20pmol/L。

6.5.3樣品制備將小腸內(nèi)容物或糞便與滅菌PBS按1:5的重量體積比制成懸液，在渦旋混合器上混勻后4C5000r/nrni離心10min，取上清液于無RNA酶的滅菌離心管中，備用。

制備的樣品在4C保存時不應(yīng)超過24h，長期保存應(yīng)分裝成小管，置于一70C以下，避免反復(fù)凍融。

6.5.4病毒總RNA提取取6.5.3制備的待檢樣品上清300yL于無RNA酶的滅菌離心管(1.5mL)中，加入500FLRNA提取液(TRIzolReagent)，充分混勻，室溫靜置10min;加人500三氯甲烷，充分混勻，室溫靜置10min,4：

C12000r/min離心10min,取上清(500juL)于新的離心管(1.5mL)中，加人1.0mL異丙醇，充分混勻，一2〇C靜置30min,4C12000r/min離心10min。

小心棄上清，倒置于吸水紙上，室溫自然風(fēng)干。

加入20斗無1§1：

2〇溶解沉淀，瞬時離心，進(jìn)行cDNA合成或置一70C以下長期保存。

若條件允許，病毒總RNA還可用病毒RNA提取試劑盒提取。

6.5.5cDNA合成反應(yīng)在20斗體系中進(jìn)行。

取6.5.4制備的總RNA12.5pL于無RNA酶的滅菌離心管(1.5mL)中，加人1fxL反轉(zhuǎn)錄引物(F2)混勻，70C保溫10min后迅速在冰上冷卻2mm，瞬時離心使模板RNA/4引物混合液聚集于管底；然后，依次加人4)ixL5XM-MLV緩沖液、ljuLdNTPs混合物（各10mM)、0?5pLRNase抑制劑、1.OpL反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV混勻，42C保溫1h;最后，7〇C保溫15min后冰上冷卻，得到cDNA溶液，立即使用或置于一20C保存。

6.5.6PCR反應(yīng)6.5.6.1反應(yīng)體系(25(iL)2XEmeraldAmp?PCR12.5p.LFI0.05juLF20.05卩L模板(CDNA)2|LtL無菌雙蒸水加至25卩LPCR反應(yīng)時，要設(shè)立陽性對照和空白對照。

陽性對照模板為豬傳染性胃腸炎病毒ORF3基因重組質(zhì)粒，空白對照模板為提取的總RNA。

6.5.6.2PCR反應(yīng)程序94C預(yù)變性5min,然后30個循環(huán)（98C變性10s、55C退火3〇S、72C延伸84s)，最后72C延伸7min，4C保存。

6.5.7電泳6.5.7.1制膠1%瓊脂糖凝膠板的制備:將1g瓊脂糖放人1〇〇mL1XTAE電泳緩沖液中，微波爐加熱融化。

待溫度降至60C左右時，加人10mg/mL溴化乙錠(EB)5#，均勻鋪板，厚度為3mm～5mm。

6.5.7.2加樣PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5斤擴(kuò)增產(chǎn)物（包括被檢樣品、陽性對照、空白對照）、5DL2000DNAMarker進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

6.5.7.3電泳條件150V電泳10min?15min。

6.5.7.4凝膠成像儀觀察反應(yīng)產(chǎn)物電泳結(jié)束后，用凝膠成像儀觀察檢測結(jié)果、拍照、記錄試驗(yàn)結(jié)果。

6.5.8結(jié)果判定在同一塊凝膠板上電泳后，當(dāng)DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、各組對照同時成立時，被檢樣品電泳道出現(xiàn)一條1400bP的條帶，判為陽性(+);被檢樣品電泳道沒有出現(xiàn)大小為1400bp的條帶，判為陰性（一）。

結(jié)果判定見附錄C。

6.6血清中和試驗(yàn)6.6.1指示病毒指示病毒毒價測定后立即小量分裝，置于一30C凍存，避免反復(fù)凍融，使用劑量為500TCID5。

～1000TCID50。

6.6.2樣品被檢血清，同一動物的健康血清(或病初)血清和康復(fù)3周后血清(雙份），被單份血清也可以進(jìn)行檢測，被檢樣品需56C滅活30min。

6.6.3溶液配制稀釋液、細(xì)胞培養(yǎng)液、病毒培養(yǎng)液、HEPES液，配制方法見附錄A。

6.6.4操作方法6.6.4.1常量法用稀釋液倍比稀釋血清，與稀釋至工作濃度的指示毒等量混合，置于37C感作1h(中間搖動2次）。

選擇長滿單層的細(xì)胞瓶，每份樣品接4個培養(yǎng)瓶，再置于37C吸附lh(中間搖動2次）。

取出后，加病毒培養(yǎng)液，置于37C溫箱培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞病變（CPE)72h～96h最終判定。

每批對照設(shè)標(biāo)準(zhǔn)陰性血清對照、陽性血清對照，病毒抗原和細(xì)胞對照各2瓶，均加工作濃度指示毒，陰性血清、陽性血清做26稀釋。

6.6.4.2微量法用稀釋液倍比稀釋血清，每個稀釋度加4孔，每孔50pL，再分別加人50juL工作濃度指示毒，經(jīng)微量振蕩器振蕩1min～2min，置于37C中和1h后，每孔加人細(xì)胞懸液100pL(l.5X105個細(xì)胞/mL～2.0X105個細(xì)胞/mL)，微量板置于37C二氧化碳培養(yǎng)箱，或用膠帶封口置37C溫箱培養(yǎng)，72h～96h判定結(jié)果，對照組設(shè)置同常量法。

6.6.5結(jié)果判定在對照系統(tǒng)成立時(病毒抗原及陰性血清對照組均出現(xiàn)CPE，陽性血清及細(xì)胞對照組均無CPE)，以能保護(hù)半數(shù)接種細(xì)胞不出現(xiàn)細(xì)胞病變的血清稀釋度作為終點(diǎn)，并以抑制細(xì)胞病變的最高血清稀釋度的倒數(shù)來表示中和抗體滴度。

發(fā)病后3周以上的康復(fù)血清滴度是健康(或病初)血清滴度的4倍，或單份血清的中和抗體滴度.1.2。

6.7.1.5加底物溶液每孔加新配制的底物溶液1〇〇yL，在37C濕盒內(nèi)反應(yīng)5min～10min。

6.7.1.6終止反應(yīng)每孔加終止液50juL。

6.7.2結(jié)果判定6.7.2.1目測法陽性對照血清孔呈鮮明的橘黃色，陰性對照血清孔無色或基本無色。

被檢血清孔凡顯色者即判抗體陽性。

6.7.2.2比色法用酶標(biāo)測試儀，在波長492nm下，測定各孔OD值。

陽性對照血清的兩孔平均OD值0.7(參考值），陰性對照血清的兩孔平均OD值0.183為正常反應(yīng)。

OD值0.2為陽性;OD值0?183時為陰性;OD值在0.183～0.2之間為疑似。

對疑似樣品可復(fù)檢一次，如仍為疑似范圍，則看P/N比值，P/N6比值2判為陽性，P/N比值2者判為陰性。

7結(jié)果判定只要實(shí)驗(yàn)室診斷中的任何一種方法的結(jié)果成立，即可判斷該病為豬傳染性胃腸炎。

附錄AA(規(guī)范性附錄)溶液的配制(規(guī)范性附錄)溶液的配制AA.10.02mo丨/LpH7.2磷酸鹽緩沖液(PBS}的配制AA.1.1〇.2mol//LL磷酸氫二鈉溶液磷酸氫二鈉(Na2HP04.12H20)71.64g，無離子水加至1000mL。

AA.1.20.2mol//LL磷酸二氫鈉溶液磷酸二氫鈉(NaH2P04?2H20)31.21g,無離子水加至1000mL。

AA.1.30.2mL/L磷酸氫二鈉溶液360mL0?2mol/L磷酸二氫鈉溶液140mL，氯化鈉38g，無離子加至5000mL。

4C保存。

AA.2細(xì)胞培養(yǎng)液的配制含10%滅活犢牛血清的1640營養(yǎng)液，加100IU/mL青霉素及100jug/mL鏈霉素，用5.6%碳酸氫鈉(NaHC03)調(diào)pH至7.2。

如需換液，則血清含量為5%。

AA.3病毒培養(yǎng)液的配制1640培養(yǎng)液中加下列成分，使最終濃度各達(dá)到：

1%HEPES，1%二甲基亞砜(DMSO)，5jug/mL～10jug/mL胰酶(原代腎細(xì)胞為)5jug/mL，100IU/mL青霉素、100jutg/mL鏈霉素，以5.6%碳酸氫鈉(NaHC03)調(diào)至pH7.2DA.4HEPES液的配制稱取0.2385gHEPES溶于100mL無離子水中，用1mol/L氫氧化鈉(NaOH)調(diào)整pH至7.0～7.2,過濾后置于4C備用。

AA.50.1%伊文斯藍(lán)原液的配制稱取伊文斯藍(lán)〇?1g溶于loomL，0.02mol/LpH7.2PBS中，4C保存。

使用時，稀釋成0?02%濃度。

AA.6磷酸鹽緩沖甘油的配制量取丙三醇90mL，0.02mol/LpH7.2PBS10mL，振蕩混合均勻即成，4C保存。

AA.7洗液的配制量取50jxL吐溫一20,加人100mL0.02mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液(見A.1)中。

AA8.8包被稀釋液的配制AA.8.10.1mol/L碳酸鈉液:稱取碳酸鈉10.6g，