Survivin和COX-2在膀胱移行細胞癌中的表達

1/1Survivin和COX-2在膀胱移行細胞癌中的表達臨床醫(yī)學(xué)論文-Survivin和COX-2在膀胱移行細胞癌中的表達【摘要】目的探討Survivin和COX-2在人膀胱移行細胞癌(BTCC)中的表達及其臨床意義。

方法采用S-P免疫組化技術(shù)分別觀察40例BTCC和10例正常膀胱組織標本中Survivin和COX-2的表達，分析其表達水平與BTCC臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。

結(jié)果Survivin和COX-2基因在BTCC中的表達與在正常膀胱黏膜比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P＜0.01)。

不同臨床分期和病理分級間Survivin和COX-2表達的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。

結(jié)論Survivin和COX-2的高表達是BTCC預(yù)后不良的指征，有望成為BTCC預(yù)后不良的獨立性指標。

【關(guān)鍵詞】移行膀胱癌；Survivin；COX-2Abstract:ObjectiveToexploretheexpressionofSurvivinandCOX-2inhumanbladdertransitionalcellcarcinoma(BTCC)andthebiologicalsignificance.MethodsImmunohistochemicalS-PmethodandRT-PCR、westernplotwasusedtodetecttheexpressionofSurvivinandCOX-2in40caseswithBTCCand10controlswithnormalbladdermucosa.ResultsTheexpressionoftheSurvivinandCOX-2inhumanBTCCwashigherthanthatinnormalbladdermucosa(P＜0.01).TherewassignificantdifferenceintheexpressionofSurvivinandCOX-2amongdifferentclinicalstages(P＜0.05).ThesignificantdifferenceintheexpressionofSurvivinandCOX-2amongthedifferentpathologicalgradeswasfound(P＜0.05orP＜0.01).ConclusionThehighexpressionofSurvivinandCOX-2couldberegardedasanindependentindicationforevaluatingtheprognosisinBTCC.Keywords:bladderneoplasms；survivin；COX-2膀胱移行細胞癌(BTCC)的浸潤和轉(zhuǎn)移進程復(fù)雜，與多種癌基因和抑癌基因的表達、調(diào)控以及細胞凋亡有關(guān)。

Survivin基因是近年來發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制基因；COX-2基因是與抑制腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因，它們對多種腫瘤的轉(zhuǎn)移有調(diào)控作用。

本研究應(yīng)用SP免疫組化方法和RT-PCR檢測了40例膀胱癌和10例正常膀胱組織標本的Survivin和COX-2的表達，探討其表達與BTCC臨床分期、病理分級的相互關(guān)系，為臨床正確估計預(yù)后和治療提供依據(jù)。

1材料與方法1．1研究對象寧夏醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科2006年1月2006年12月電切和開放手術(shù)治療的BTCC患者40例，其中男20例，女20例，年齡31～80歲，平均62歲。

經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切(TURBt)20例，膀胱部分切除10例，膀胱全切10例。

病理分級按WHO法，其中G1級15例，G2級15例，G3級10例；腫瘤分期按UICCTNM標準，其中T1期12例，T2期15例，T3期13例。

組織學(xué)分類：

40例均為BTCC。

從10例行開放手術(shù)的前列腺增生(BPH)患者取膀胱組織標本作對照。

1．2染色方法所有標本均經(jīng)10%的多聚甲醛固定、石蠟包埋并進行連續(xù)超薄切片，分別作蘇木精2伊紅(HE)染色、免疫組織化學(xué)SP染色。

所有標本均由兩位病理學(xué)專家確診。

所有一抗均購自Maixin公司，SP試劑盒由福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司提供。

所有操作嚴格按試劑盒說明進行。

石蠟切片脫蠟，水化后行免疫組織化學(xué)染色。

抗體工作濃度Survivin為1∶100，COX-2為1∶200，最后用二氨基聯(lián)苯氨(DAB)染色，蘇木精復(fù)染。

以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照，已知陽性標本作為陽性對照，陽性標本顯色后，立即全部終止反應(yīng)。

1.3結(jié)果判斷Survivin、COX-2陽性表達為胞漿成棕黃色。

在切片陽性細胞區(qū)隨機挑選10個高倍視野共計數(shù)1000個腫瘤細胞，按照文獻［1］方法，在高倍鏡下對染色作①如下評分：

染色深淺：

無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3②分；染色細胞計數(shù)：

沒有細胞染色為0分，1%～10%為1分，11%～33%為2分，34%～66%為3分，＞66%為4分。

兩項結(jié)果相加＜2分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～5分為中度陽性(6)，6～7分為強陽性(7)。

1.4RT-PCR檢測Survivin、COX-2mRNA的表達分別收集培養(yǎng)的各組細胞，按Trizol試劑盒說明書提取總RNA，取1g總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再取20L反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行PCR循環(huán)。

Survivin引物序列：

上游5-ACAACCAAACCTCACACTACTG-3，下游5-ATAGATCCCATTACAGACAGCG-3。

COX-2引物序列：

上游5-GGATTTTTATTTAAGAGGAGTAGGT-3，下游5-CTACCAAAATTTTTATTATAATCCC-3。

Survivin產(chǎn)物長度439bp，COX-2產(chǎn)物長度468bp，94℃變性1min，60℃復(fù)性30s，72℃延伸40s，共35個循環(huán)，末次循環(huán)72℃延伸10min。

GAPDH引物序列：

上游5-TCACCATCTTCCAGGAGCGAG-3，下游5-TGTCGCTGTTGAAGTCAGAG-3，產(chǎn)物長度648bp，94℃變性1min，55℃復(fù)性30s，72℃延伸40s，共30個循環(huán)，末次循環(huán)72℃延伸10min。

反應(yīng)結(jié)束后取反應(yīng)產(chǎn)物5L進行20g/L瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，UVP型凝膠圖像分析系統(tǒng)做圖，以各組目的基因與GAPDH基因灰度的比值代表Survivin、COX-2mRNA的表達量。

1.5數(shù)據(jù)分析各樣本測定值以平均值標準差表示，以統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS11.0進行分析，采用Fisher確切概率法檢驗分析Survivin和COX-2在膀胱癌組及正常組織中表達的關(guān)系；采用RC列聯(lián)表擴檢驗分析BTCC組織中survivin和COX-2的表達與其臨床病理特征之間的關(guān)系；采用Pearosn相關(guān)性檢驗分析BTCC組織中Survivin和COX-2表達之間的相關(guān)性。

以a=0.05作為統(tǒng)計學(xué)檢驗的顯著性水準。

2結(jié)果2.1BTCC及對照膀胱組織中Survivin、COX-2蛋白表達對照膀胱組織中Survivin、COX-2均無陽性表達，在BTCC中Survivin為胞漿和胞核成棕黃色(圖1，見封4)，COX-2為細胞胞漿和胞膜染成棕黃色(圖2，見封4)。

Survivin、COX-2在40例BTCC組織中陽性表達分別為29例(72.5%)、26例(65.0%)，在10例正常膀胱組織中為0例，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

在不同臨床分期中Survivin、COX-2表達差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；在不同病理分級中陽性表達差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)，見表1。

表1Survivin、COX-2在BTCC中的表達（略）2.2Survivin、COX-2mRNA表達以各組目的基因與GAPDH基因灰度的比值代表SurvivinmRNA的表達量。

BTCC組織內(nèi)Survivin、COX-2mRNA表達均顯著增加，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

表2BTCC組織Survivin、COX-2表達量（略）3討論Survivin是新近發(fā)現(xiàn)的一種細胞凋亡抑制蛋白，它具有抑制細胞凋亡與調(diào)節(jié)細胞周期兩種功能，在大多數(shù)惡性腫瘤中都有表達，而在除胚胎期外的正常組織中不表達［2］。

Survivin可抑制Caspase級聯(lián)反應(yīng)下游的Caspase3、7，發(fā)揮其抗凋亡作用［3］，其用于BTCC的診斷已引起了廣泛關(guān)注。

本研究發(fā)現(xiàn)，在40例BTCC中，Survivin的陽性表達率為72.5%，且與腫瘤的病理分級呈正相關(guān)，這與Gazzaniga等［4］研究結(jié)果一致。

COX-2是一種膜結(jié)合的分子量為71ku的糖蛋白，具有環(huán)氧合酶和過氧化物合成酶的雙重功能［5］。

COX-2在正常組織中不表達或極微量表達，但在腫瘤組織中表達量顯著提高，提示與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。

COX-2參與腫瘤發(fā)生的機制不明，可能與促進腫瘤血管生成和抑制機體免疫反應(yīng)等有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，COX-2在BTCC組織中強陽性表達，并且與腫瘤的分級、分期相關(guān)。

提示COX-2的過表達不僅促進BTCC的發(fā)生，并且可能加強了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，本研究結(jié)果與Lim等［6］的發(fā)現(xiàn)相符。

Peng等［7］和Cornetta等［8］在對喉鱗癌和甲狀腺癌的研究中也發(fā)現(xiàn)COX-2mRNA和COX-2蛋白呈高表達。

Gallo等［9］的研究表明，在頭頸部腫瘤中COX-2的表達與腫瘤血管的生成有關(guān)，同時通過Cox多元回歸分析發(fā)現(xiàn)，COX-2蛋白的過表達是最有意義的預(yù)后因子。

BTCC的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)是一個多步驟、多因素相互作用的復(fù)雜過程，單一的分子指標是無法進行精確預(yù)測的，各種指標中均無足夠的特異性，采用多個指標進行聯(lián)合檢測是今后的研究方向。

在我們研究的2種基因中，其在染色體上的定位各不相同，Survivin為凋亡抑制蛋白，COX-2屬原癌基因，2個基因在BTCC中表達增強，也說明膀胱腫瘤的發(fā)生是一個多基因突變的結(jié)果。

總之，COX-2和Survivin各自高表達或兩者共同高表達均是BTCC預(yù)后不良的指征，有望成為BTCC預(yù)后不良的判斷指標。

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