Trizol法提取RNA實(shí)驗(yàn)步驟及原理新手詳細(xì)注釋版

/Trizol法使用步驟一、分離純化的基本原理研究基因的表達(dá)和調(diào)控時(shí)常常要從組織和細(xì)胞中分離和純化RNA。RNA質(zhì)量的高低常常影響cDNA庫(kù)，RT-PCR和NorthernBlot等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的成敗。Trizol是一種新型總RNA抽提試劑，內(nèi)含異硫氰酸胍等物質(zhì)，能迅速破碎細(xì)胞，抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶。二、用戶需自備的試劑和材料無(wú)水乙醇、氯仿、Glycogen（可能需要）、1.5mlEppendorf管（RNase-free）、Tips（RNase-free）三、準(zhǔn)備工作RNase酶非常穩(wěn)定，是導(dǎo)致RNA降解最主要的物質(zhì)。它在一些極端的條件可以暫時(shí)失活，但限制因素去除后有迅速?gòu)?fù)性。用常規(guī)的高溫高壓蒸氣滅菌方法和蛋白抑制劑都不能是RNase完全失活。它廣泛存在于人的皮膚上，因此，在與RNA制備有關(guān)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)，必須戴手套。RNase的又一污染源是取液器，根據(jù)取液器制造商的要求對(duì)取液器進(jìn)行處理。一般情況下采用用DEPC(焦炭酸二磷脂，一種RNase抑制劑)配制的70%乙醇擦洗取液器的內(nèi)部和外部，基本達(dá)到要求。取RNase-free的物品時(shí)必須戴手套。1、料制品的處理盡可能使用無(wú)菌，一次性塑料制品，已標(biāo)明RNase-Free的塑料制品，如沒(méi)有開(kāi)封使用過(guò)通常沒(méi)有必要再次處理。對(duì)于國(guó)產(chǎn)塑料制品，原則上都必須處理方可使用。處理步驟如下：1）在玻璃燒杯中注入去離子水，加入DEPC使DEPC的終濃度為0.1%。注意：DEPC為劇毒物，活性很強(qiáng)，小心在通風(fēng)柜中使用。2）處理的塑料制品放入一個(gè)可以高溫滅菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。3）在通風(fēng)柜中室溫處理過(guò)夜。4）將DEPC水溶液小心倒到廢液瓶中，用鋁箔封住含已DEPC水處理過(guò)的塑料制品的燒杯，高溫高壓蒸氣滅菌至少30分鐘。5）烘箱用合適的溫度烘拷至干燥。置于干凈處備用。2、璃玻和金屬物品250°C烘烤3四、從組織中提取總RNA1)液氮研磨：組織塊直接放入研缽中，加入少量液氮，迅速研磨，待組織變軟，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg組織/mlTrizol加入Trizol，轉(zhuǎn)入離心管進(jìn)行第2步操作。（液氮既能使各種組織成分不易被破壞或降解,又能使組織變硬,脆性增加易于磨碎。終止細(xì)胞內(nèi)外一切生物反應(yīng)，防止RNA酶的降解反應(yīng)）2)勻漿：組織樣品按50-100mg/mlTrizol加入Trizol。另外，組織體積不能超過(guò)Trizol體積的10%，否則勻漿效果會(huì)不好，用電動(dòng)勻漿器充分勻漿約需1-2分鐘。五、從細(xì)胞中提取總RNA1)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞：不須消化，可直接用Trizol進(jìn)行消化、裂解，Trizol體積按10cm2/ml比例加入。2)懸浮細(xì)胞可直接收集、裂解，每1mlTrizol可裂解5×106動(dòng)物、植物或酵母細(xì)胞，或107細(xì)菌細(xì)胞。六、操作步驟1、細(xì)胞或組織加Trizol后，室溫放置5min，使其充分裂解。注：此時(shí)可放入-70℃長(zhǎng)期保持。2、12,000rpm離心5min，棄沉淀。3、按200ul氯仿/mlTrizol加入氯仿，振蕩混勻后室溫放置15min。注：禁用漩渦振蕩器，以免基因組DNA斷裂。（氯仿為有機(jī)溶劑，有效的使有機(jī)相和無(wú)機(jī)相迅速分離。有機(jī)相中主要是酚和蛋白結(jié)合，從而使得蛋白和RNA脫離，RNA進(jìn)入水相）4、4℃12,000g離心15min。5、吸取上層水相，至另一離心管中。注：千萬(wàn)不要吸取中間界面；若同時(shí)提取DNA和蛋白質(zhì)，則保留下層酚相存于4℃冰箱,若只提RNA，則棄下層酚相。6、按0.5ml異丙醇/mlTrizol加入異丙醇（沉淀RNA）混勻，室溫放置5-10min。7、4℃12,000g離心10min，棄上清，RNA沉于管底。8、按1ml75%乙醇/mlTrizol加入75%乙醇（沉淀RNA），溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。9、4℃8,000g離心5min，盡量棄上清。10、室溫晾干或真空干燥5-10min。注：RNA樣品不要過(guò)于干燥，否則很難溶解。11、可用50ulH2O，TEbuffer或0.5%SDS溶解RNA樣品，55-60℃,5-10min。注：H2O、TE或0.5%SDS均須用DEPC（TE緩沖液由Tris和EDTA配制而成，主要用于溶解核酸，能穩(wěn)定儲(chǔ)存DNA和RNA。用于酶切反應(yīng)不能使用SDS）12、測(cè)O.D值定量RNA濃度。注：此方法提取RNAA260/A280值在1.6-1.8之間；產(chǎn)率估計(jì)：組織標(biāo)本：（ugRNA/mg組織）1-10ug，培養(yǎng)細(xì)胞（ugRNA/106Cell）：5-15ug。注：組織或細(xì)胞量過(guò)少，可酌情減少Trizol用量；組織或細(xì)胞用量過(guò)多，會(huì)引起DNA對(duì)RNA的污染；高蛋白、脂肪或多糖類(lèi)組織，肌肉組織或塊狀植物組織等，組織勻漿或液氮研磨后須4℃12,000g離心10min熱天提RNA，帶手套是必須的，手是RNase的主要來(lái)源；組織塊用液氮研磨，效果最好，若沒(méi)有液氮或電動(dòng)勻漿器，可用手動(dòng)勻漿器代替，此時(shí)組織塊不宜過(guò)大，且需先用眼科剪刀將組織堿堿剪碎，然后再充分研磨。6.1.2.1肝臟、腸道、肌肉總RNA提取方法①使用已高溫蒸汽滅菌的手術(shù)刀和鑷子從魚(yú)的腹部解剖開(kāi)，從中取出完整的肝臟、腸、肌肉等組織，置于離心管后立即放入液氮中；②組織在液氮下研磨成粉，取少量至加有1mLTrizol的1.5ml離心管中，充分混合后于4℃，12,000rpm離心15min；③取上清移至新1.5ml離心管中，加入200ul氯仿，劇烈震蕩直至呈乳白色，于4℃，12,000rpm離心15min；④取上清移至新1.5ml離心管中，加入500ul異丙醇，輕輕顛倒10次，冰上放置20mins，于4℃，12,000rpm離心15min；⑤棄上清，加入1ml75%乙醇（用DEPC水現(xiàn)配現(xiàn)用），于4℃，12000rpm離心5min，重復(fù)此步驟一次；⑥棄上清后，室溫干燥5-7mins；⑦加入適量（20-30ul）的DEPC水溶解沉淀65℃溶解，-20℃（最好-80℃）保存6.1.2.2RNA濃度測(cè)定和電泳檢測(cè)取2ul提取好的RNA溶液，于Nanodrop2000Spectrophptpmeter測(cè)定RNA濃度與A260/A280的相對(duì)吸光度，純凈RNA的A260/A280應(yīng)在1.8-2.2之間。電泳檢測(cè)：1%瓊脂糖，1×ATE緩沖液，90V電泳30min，凝膠成像系統(tǒng)觀察，分析結(jié)果。6.1.2.3肝臟、肌肉、腸道樣品cDNA的合成反應(yīng)按照TaKaRa公司的PrimeScript?RTreagentKitWithgDNAEraser（PerfectRealTime)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，合成cDNA模板。①（殘存的）基因組DNA的除去反應(yīng)，在PCR管中配置如下緩沖液。試劑用量5×gDNAEraserBuffer2.0μlgDNAEraser1.0μlTotalRNAX*ulRNaseFreedH2Oupto10μl（gDNA、genomicDNA、基因組DNA：是指有機(jī)體在單倍體狀態(tài)下的DNA全部含量，是染色體DNA，與質(zhì)粒等染色體外DNA區(qū)別。）X*：根據(jù)檢測(cè)到的RNA濃度來(lái)配置；混合均勻后，室溫放置20-30min②反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，在PCR管中配置如下緩沖液（20ulsystem），反應(yīng)液配制在冰上進(jìn)行。為了保證反應(yīng)液配制的準(zhǔn)確性，進(jìn)行各項(xiàng)反應(yīng)時(shí)，先按反應(yīng)數(shù)+1的量配制MasterMix，然后再分裝到每個(gè)反應(yīng)管中。試劑使用量5×PrimeScript?Buffer2（forRealTime）4.0ul