波生坦對大鼠頸動脈再狹窄的影響及其病理機制-0

1/1波生坦對大鼠頸動脈再狹窄的影響及其病理機制波生坦對大鼠頸動脈再狹窄的影響及其病理機制DOC格式論文，方便您的復(fù)制修改刪減波生坦對大鼠頸動脈再狹窄的影響及其病理機制（作者:___________單位:___________郵編:___________）作者：

吳桂平張彥紅付鑫李穎曲曉婷王滌非DOC格式論文，方便您的復(fù)制修改刪減生。

【關(guān)鍵詞】波生坦；再狹窄；動脈成形術(shù)；血管平滑肌細胞；大鼠【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheeffectandpathogeneticstudyofBosentanoncarotidarteryrestenosisinrat.Methods65Wistarratsweredividedrandomlyinto3groups:sham,injuryandBosentangroups.Theballooncatheterinjurywasperformedonleftcommoncarotidarteryofratbyimitatingtheprocessofpercutaneoustranscoronaryangioplasty(PTCA)ininjuryandBosentangroups.100mgkg-1d-1BosentanwasadministratedintragastriclytoratsofBosentangroup(from1daytobeingkilled).Theprocessofneointimalandmediahyperplasiawasobservedandactinandproliferationcellnuclearantigen(PCNA)expressionsweredetermined.ResultsArterialneointimahyperplasiareachedsummitat28daysininjurygroupandat14daysinBosentangroup.NeointimalandmediaareaofBostentanatdifferenttime(14th,28th,45thday)weresignificantlydecreasedcomparedwithinjurygroup(P＜0.001).ThepositiverateofPCNAincreasedstatisticallyinBosentangroupthanthatofinjurygroupat14thday(P＜0.01).ThepositiveratofactincellincreasedsignificantlyinBosentangroupcomparedwithinjuredgroup(P＜0.01)at14thday.ConclusionsBosentancaneffectivelypreventarteryrestenosisbyinhibitingneointimalhyperplasiaandreducingDOC格式論文，方便您的復(fù)制修改刪減theproliferation,migration,transconformationofvascularsmoothmusclecells.【Keywords】Bosentan;Restenosis;Angioplasty;Vascularsmoothmusclecell;Rat經(jīng)皮冠狀動脈介入治療冠心病血管重建治療的術(shù)后再狹窄發(fā)生率仍較高，從而影響了治療效果，因而探尋再狹窄的防治成為當前冠心病防治研究的熱點。

再狹窄的形成是一個復(fù)雜的病理生理過程，其主要的機制為擴張動脈血管腔炎癥反應(yīng)，血管內(nèi)皮損傷誘發(fā)的血管重構(gòu)和血管平滑肌細胞的過度增殖與遷移〔1〕。

內(nèi)皮素（ET）是由內(nèi)皮細胞合成，具有強大的縮血管和促進血管平滑肌細胞的作用。

波生坦是一種非肽類非選擇性內(nèi)皮素受體阻斷劑。

關(guān)于波生坦對大鼠頸動脈再狹窄的影響的研究國內(nèi)外尚無報道。

本試驗通過觀察波生坦對大鼠頸動脈再狹窄的影響并研究其病理機制，為冠狀動脈成形術(shù)術(shù)后再狹窄的防治提供新的思路。

1材料與方法1.1實驗動物健康雄性Wistar大鼠65只，體重330～460g，購自中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物室。

1.2實驗試劑、藥品與器材①波生坦(商品名：

全可利片）：

購自愛克泰隆藥品公司。

②2F經(jīng)皮冠狀動脈成形術(shù)（PTCA）球囊導(dǎo)管（1.5mm20mm），購自Cordis公司。

③抗增殖細胞核抗原（PCNA）單抗（福建邁新）。

④DOC格式論文，方便您的復(fù)制修改刪減抗平滑肌肌動蛋白（SMA）單抗（上海長島生物公司）。

⑤免疫組化SP試劑盒（福建邁新）。

⑥伊文氏藍。

⑦DAB顯色試劑盒（北京中科生物技術(shù)有限公司）。

1.3分組、藥物干預(yù)與模型制備健康雄性Wistar大鼠65只，隨機分為假手術(shù)組15只，損傷組25只，波生坦組25只，波生坦組大鼠自術(shù)前1天直至處死予波生坦100mgkg-1d-1灌胃，假手術(shù)組和損傷組給予等量蒸餾水灌胃直至處死。

參照Clowes〔2〕方法將損傷組與波生坦組實驗大鼠禁食8h后，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，尾靜脈注射肝素100U/kg，沿中線切開頸部皮膚，在頸前三角區(qū)暴露左頸總動脈、頸內(nèi)及頸外動脈，輕輕分離頸外動脈，結(jié)扎頸外動脈遠段，用絲線暫時阻斷頸總動脈近心端血流，自頸外動脈血管壁剪一V形小切口，置入導(dǎo)絲并插至近膈肌水平，沿導(dǎo)絲送入PTCA球囊導(dǎo)管至頸總動脈約3cm，肝素鹽水充盈球囊，予152kPa壓力擴張30s，緩慢回抽球囊至頸動脈分叉處，重復(fù)3次剝脫內(nèi)膜，結(jié)扎頸外動脈近段，查看頸總動脈及頸內(nèi)動脈搏動良好后縫合皮下組織與皮膚。

術(shù)后常規(guī)肌注青霉素40萬U/d，共3d，預(yù)防感染。

假手術(shù)組僅暴露分離左頸總，頸內(nèi)，頸外動脈，隨即縫合皮下組織及皮膚，喂食普通飼料，自由飲水。

1.4取材術(shù)后1、7、14、28、45d分批取材，首先經(jīng)尾靜脈注射5%伊文氏藍生理鹽水標記無內(nèi)膜覆蓋血管。

30min后用4%多聚甲醛以13.3kPa進行灌注固定，解剖并游離左右側(cè)頸總動脈，切取左側(cè)頸DOC格式論文，方便您的復(fù)制修改刪減總動脈中段藍染區(qū)，共同行低溫石蠟垂直定向包埋，并以5m厚度切片，常規(guī)HE染色。

1.5免疫組織化學(xué)法標記定量平滑肌細胞（VSMC）的增殖分別以抗SMA,抗PCNA抗體進行免疫組化染色標記VSMC，增殖細胞，采用SP法進行免疫組織化法染色。

1.6動脈壁內(nèi)膜、中膜面積的測量按照組織學(xué)劃分，內(nèi)膜彈力膜以內(nèi)為血管內(nèi)膜，內(nèi)外彈力膜之間為中膜。

在5物鏡下將完整的血管橫切面HE染色圖像攝入計算圖像分析系統(tǒng)中（江蘇捷達圖像分析軟件），分別測量血管內(nèi)膜面積，隨機選取動脈藍染段3個切面分析，取平均值。

同時采用計算機圖像分析系統(tǒng)測定內(nèi)膜、中膜細胞總數(shù)及PCNA染色陽性細胞數(shù)，計算14d內(nèi)膜、中膜增殖細胞陽性率。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理采用統(tǒng)計學(xué)軟件包SPSS11.0，數(shù)據(jù)以xs表示。

組間比較采用t檢驗，自身前后比較采用對照t檢驗。

2結(jié)果2.1一般狀況65只大鼠分別因術(shù)中呼吸驟停死亡2例，術(shù)后出血死亡1例，插入球囊致動脈斷裂未完成造模2例，60只大鼠成功建模，假手術(shù)組15只，損傷組22只，波生坦組23只。

2.2術(shù)后動脈壁動態(tài)增生的觀測及內(nèi)膜面積比較DOC格式論文，方便您的復(fù)制修改刪減光鏡下，術(shù)后1d，正常大鼠頸動脈內(nèi)膜為單層內(nèi)皮細胞，中膜為環(huán)形排列波浪狀彈性膜和平滑肌細胞組成，球囊損傷后1d動脈內(nèi)膜剝脫，球囊損傷后7d可見新生內(nèi)膜形成，中膜亦有所增厚，術(shù)后14d損傷組內(nèi)膜繼續(xù)增厚，至28d內(nèi)膜增生達高峰，此后內(nèi)膜有縮小趨勢，但差異不顯著，中膜變化不明顯，而波生坦組術(shù)后14d內(nèi)膜增生達高峰值，波生坦組增生內(nèi)膜面積在術(shù)后14、28、45d與損傷組比較，差異顯著（P0.01），見表1，圖1。

表1不同時間血管內(nèi)膜面積比較（略)2.3術(shù)后各組血管壁PCNA陽性細胞的變化術(shù)后7d假手術(shù)組無PCNA陽性細胞，其他兩組新生內(nèi)膜可見少量PCNA陽性細胞，而中膜可見大量PCNA陽性細胞，術(shù)后14d損傷組新生內(nèi)膜可見大量PCNA陽性細胞，而波生坦組PCNA陽性細胞較7d增加，但較損傷組明顯減少(P＜0.01)，見表2。

術(shù)后14d，兩組中膜PCNA陽性細胞減少，見表2，圖2。

與損傷組比較波生坦組PCNA陽性細胞減少有顯著差異（P0.01）。

2.3術(shù)后各血管壁平滑肌SMA表達情況假手術(shù)組血管壁平滑肌SMA幾乎無表達。

術(shù)后損傷組和波生坦組術(shù)后內(nèi)膜及中膜均呈少量陽性表達，術(shù)后14d，SMA陽性表達較前增加，28d后變化不明顯，術(shù)后14d波生坦SMA陽性表達率較損傷組增加有顯著差異（P0.01），表2，圖2。

表2術(shù)后14d各組血管PCNA和SMA表達比較(略)3討論DOC格式論文，方便您的復(fù)制修改刪減冠脈介入治療術(shù)后再狹窄的發(fā)生是復(fù)雜的病理生理過程，是血管局部損傷后所發(fā)生的一種修復(fù)反應(yīng)，其中血管內(nèi)皮損傷誘發(fā)的血管重構(gòu)和血管平滑肌細胞過度增殖和遷移是導(dǎo)致PTCA術(shù)后再狹窄的主要病理基礎(chǔ)〔2〕。

內(nèi)皮素具有強烈的縮血管作用和促進血管平滑肌增生的作用，在缺氧、應(yīng)激、動脈粥樣硬化、高血壓等病理狀態(tài)下ET1水平顯著升高〔3〕,PTCA過程中會有不同程度的內(nèi)皮剝脫與損傷，Wang等〔4〕發(fā)現(xiàn)，大鼠頸動脈球囊形成術(shù)后ET1、ET3、ETA及ETBmRNA存在時間依賴性增高。

目前已有相關(guān)研究表明PTCA術(shù)后血漿ET濃度升高，且局部升高更為明顯〔5〕，再狹窄的發(fā)生率伴隨著ET及其受體表達的增多，所以有理由認為抑制ET受體可以減少再狹窄的發(fā)生。

本實驗通過建立大鼠頸動脈球囊損傷模型，對動脈損傷后不同時期血管的增生以及波生坦對其影響進行了連續(xù)的觀察。

在術(shù)后動脈壁動態(tài)增生方面，球囊損傷后7d即可見新生內(nèi)膜增生形成，術(shù)后14d損傷組、波生坦組內(nèi)膜繼續(xù)增厚，至28d損傷組新生內(nèi)膜增生達高峰。

臨床PTCA術(shù)后患者血管再狹窄發(fā)生時間主要在術(shù)后3～6個月，4個月內(nèi)約占50%〔6〕，這一規(guī)律與在實驗中大鼠頸動脈損傷模型術(shù)后內(nèi)膜增生有著相同的趨勢，即提示應(yīng)盡早通過抑制內(nèi)膜的增生以降低再狹窄的發(fā)生發(fā)展。

波生坦組在損傷術(shù)后7、14、28及45d增生內(nèi)膜面積與損傷組比較明顯減少，且波生坦組術(shù)后14d時膜增生已達峰值，提示波生坦對損傷動脈具有明顯的抑制內(nèi)膜增生的作用。

DOC格式論文，方便您的復(fù)制修改刪減PCNA是一種與細胞增殖有關(guān)的參與DNA合成的核蛋白，是僅能在增殖細胞中合成和表達的核內(nèi)多肽鏈。

因此，PCNA的合成及表達與細胞的增殖狀態(tài)，分化活躍程度密切相關(guān)，是反映細胞增殖功能的敏感的檢測指標〔7，8〕。

本實驗證明動脈損傷后7d新生內(nèi)膜及中膜即有PCNA陽性細胞，至術(shù)后14d新生內(nèi)膜PCNA陽性細胞進一步大量增加，但波生坦組在術(shù)后14d內(nèi)膜、中膜細胞增殖率較損傷組顯著減少，提示波生坦可在術(shù)后早期即對血管壁平滑肌細胞增殖具有抑制作用。

VSMC是一種多功能性間葉細胞，其功能主要是通過收縮和松弛來維持血管壁的張力，通過增生和細胞外基質(zhì)合成來維持血管完整性。

VSMC增殖、遷移最終導(dǎo)致新生內(nèi)膜形成。

在人體發(fā)育過程中，VSCM具有兩種表型，收縮型和合成型。

當血管壁發(fā)生損傷時VSCM即由收縮型向合成型發(fā)生逆向轉(zhuǎn)化，VSMC表型轉(zhuǎn)化是PTCA術(shù)后再狹窄，動脈粥樣硬化血管重塑的共同病理學(xué)基礎(chǔ)。

SMA是VSMC表型轉(zhuǎn)化的敏感指標，其表達減少標志著細胞由收縮型向合成增殖型轉(zhuǎn)化〔9〕，PTCA術(shù)后內(nèi)皮細胞受損，術(shù)中機械性刺激加之生長因子共同作用，動脈中膜靜止的VSMC原癌基因被激活，發(fā)生去分化，由高分化非增殖型收縮表型向低分化增殖型合成表型轉(zhuǎn)變，向血管內(nèi)膜遷移，增殖并分泌細胞外基質(zhì)，形成過度增殖的新生內(nèi)膜，導(dǎo)致管腔狹窄。

本實驗證實術(shù)后7d，損傷血管內(nèi)膜，中膜SMA均呈現(xiàn)陽性表達，術(shù)后14d損傷血管SMA陽性表達大量增加，波生坦組較損傷組表達明顯增加，提示波生坦能有效抑制平滑肌細胞由收縮型向增DOC格式論文，方便您的復(fù)制修改刪減殖型轉(zhuǎn)化，減少新生內(nèi)膜的形成。

綜上，本實驗證實波生坦通過抑制動脈粥樣新生內(nèi)膜的過度增殖，減少血管平滑肌細胞的增殖，轉(zhuǎn)型及遷移，可有效預(yù)防PTCA術(shù)后再狹窄，如果相關(guān)大規(guī)模臨床實驗最終證實該作用，將有助于提高冠脈介入術(shù)的療效。

【參考文獻】1HolvoetP,SinnaeveP.Angioassociatedmigratorycellproteinandsmoothmusclecellmigrationindevelopmentofrestenosisandatherosclerosis〔J〕.JAmCollCardiol,2008;52(4):3124.2MiyauchiT，MasakiT.Pathophysiologyofendotheliumincardiovascularsystem〔J〕.AnnuRevPhysiol，1999；61:391415.3ForresterJS，F(xiàn)ishbeinM，HelfantR,etal.Aparadigmforrestenosisbasedoncellbiology：

cluesforthedevelopmentofnewpreventivetherapies〔J〕.JAmCollCardiol，1991；17:75869.4WangX，DouglasSA，LondonC,etal.Expressionofendothelin1，endothelin3，endothelinconvertingenzyme1,andendothelinAandendothelinBreceptormRNAafterangioplastyinducedneointimalformationintherat〔J〕.CircRes，DOC格式論文，方便您的復(fù)制修改刪減1996；78(2):3228.5TaylorAJ，BobikA，RichardsM,etal.Myocardialendothelin1releaseandindicesofinflammationduringangioplastyforacutemyocardialinfarctionandstablecoronaryarterydisease〔J〕.AmHeartJ，2004；148(2):e10.6WillamDC，Holubkov，Yeh