醫(yī)學免疫透射比濁實驗

醫(yī)學免疫透射比濁實驗第二次試驗logo【實驗目的】

通過本實驗了解透射比濁法的基本原理。掌握半自動或全自動生化分析儀的使用。當光線通過一個渾濁介質溶液時，由于溶液中存在混濁顆粒，光線被吸收一部分，吸收的多少與混濁顆粒的量成正比，這種測定光吸收量的方法稱為透射比濁法。這一方法早于1959年Schultre和Schuick等報道應用于血漿蛋白與其抗體結合后形成復合物，導致濁度的改變，再進行透射比濁測定，一般采用抗體對抗原定量的透射比濁法，稱為免疫透射比濁法?？乖c特異性抗體在一定條件下才能形成復合物①對抗體的要求，作為體液或組織中蛋白質種類很多，若要快速特異檢測，要求有單價特異抗體才能與抗原形成復合物。某一種蛋白質，有其特異抗體才能與該抗原結合，形成免疫復合物進行定量，若抗體不純混雜有另一種或兩種少量的抗體，這種免疫復合物就不是單一復合物而是大雜燴，結果偏高；②抗原抗體比例適當，因免疫復合物形成有三個階段，第一階段是復合物形成抗原抗體復合物；第二階段是初步形成抗原抗體復合物，此階段是復合物交聯(lián)成大的網(wǎng)格狀結構；第三階段是復合物聚合產生絮狀沉淀。只有在抗原與抗體等價時即無過剩抗體，此時，復合物的結合與解離處于平衡狀態(tài)，其混濁程度達高峰。在抗體過量時，隨抗原量的增加而復合物形成也增加，其測定只能在反應曲線的左側進行（見圖1）；③一般要求溶液中有非離子性親水多聚體促進免疫復合物的形成，如聚二乙醇6000等。溶液pH為6.5～8.0之間為宜。載脂蛋白有形成兩性螺旋片（amphipathichelix）的特性，對脂質（特別是磷脂）有高度親和力，與脂質結合后有時會掩蓋抗原位點或構象改變，可以部分或完全喪失對抗血清的特異反應。為此，載脂蛋白檢測過程中有必要先暴露抗原位點，所用試劑有表面活性劑，尿素，鹽酸胍和吐溫等解離蛋白劑，或用四甲基尿脫脂或有機溶劑脫脂等暴露抗原決定簇等方法，血清脂蛋白顆粒中的載脂蛋白，能在短時間內形成抗原抗體復合物進行定量；④抗原不能過量，因為抗原過量，抗原抗體復合物形成不但不增加，反而會減少，光散射或光吸收減少，檢測結果反而偏低。實驗原理：

免疫比濁實驗：在一定量的抗體中分別加入遞增量的抗原，經一定時間后形成可溶性免疫復合物，在PEG作用下可自液相析出，形成微粒，使檢樣濁度發(fā)生變化，用濁度計測量反應液體的濁度，復合物形成越多濁度越高，繪制標準曲線，根據(jù)濁度推算樣品的抗原含量?！緦嶒灢牧稀垦蚩谷薎gG、IgA、IgM抗血清及標準Ig參考血清抗原：待測人血清參考血清抗體：羊抗人IgG、IgA、IgM血清PEG-NaF稀釋液1ml刻度吸管、微量加液器、小試管、水浴箱、半或全自動生化分析儀等管號測IgG抗體空白管1.PEG-NaF稀釋液（ml）1.01.02抗血清（ul）（效價1:100）12.5——3待測血清（ul）1.01.0混勻，37℃水浴30min，340mm波長以抗體空白管調零，按終點法讀取各管光密度管號測IgM抗體空白管1.PEG-NaF稀釋液（ml）1.01.02.抗血清（ul）（效價1:100）12.5——3.待測血清（ul）10.010.04.標準曲線繪制

將標準Ig參考血清稀釋成5個不同濃度的標準管，按上述操作步驟進行，測定各管吸光度，以光密度對濃度進行回歸處理，作標準曲線。由測定管A值再計算出待測血清中的免疫球蛋白的含量?！居嬎恪垦逖a體lgG含量(g/L)=