柱層析心得體會

柱層析心得

常說的過柱子應(yīng)該叫柱層析分離，也叫柱色譜。我們常用的是以硅膠或氧化鋁作固定相的吸附柱。由于柱分離的經(jīng)驗成分太多，所以下面我就幾年來過柱的體會寫些心得，希望能有所幫助。

1．吸附劑

常用的吸附劑有氧化鋁、硅膠、氧化鎂、碳酸鈣和活性炭等：吸附劑一般要經(jīng)過純化和活性處理，顆粒大小應(yīng)當(dāng)均勻。對吸附劑來說粒子小、表面積大，吸附能力就高，但是顆粒小時，溶劑的流速就太慢，因此應(yīng)根據(jù)實際分離需要而定。供柱色譜使用的氧化鋁有酸性、中性和堿性3種。酸性氧化鋁是用1％鹽酸浸泡后，用蒸餾水洗至氧化鋁的懸浮液pH為4，用于分離酸性物質(zhì)；中性氧化鋁的pH約為7．5，用于分離中性物質(zhì)；堿性氧化鋁的pH約為10，用于胺或其它堿性化合物的分離。

因硅膠略帶酸性，只能用于對酸不敏感的化合物的分離。常用300-400目的柱硅膠或H硅膠。若化合物的Rf值相差較大，則可考慮使用２00-３00目硅膠以加快層析速度。

另：因吸附劑的比表面較大，天氣潮濕時或長期放置中吸附的水分會對分離效果產(chǎn)生極大的影響（相當(dāng)于大大增加了固定相的極性導(dǎo)致樣品分不開），因此應(yīng)將吸附劑放入９０～１００度烘箱內(nèi)烘２小時后，取出在干燥器中冷卻后再使用。使用的硅膠，不用時一定要密封，防止吸潮。TLC所用的硅膠板一定要保存在干燥器里面，或使用前在紅外烘箱里干燥一段時間。

2．溶質(zhì)的結(jié)構(gòu)與吸附能力的關(guān)系

化合物的吸附性與它們的極性成正比，化合物分子中含有極性較大的基團(tuán)時，吸附性也較強，氧化鋁對各種化合物的吸附性按以下次序遞減：

酸和堿>醇、胺、硫醇>酯、醛、酮>芳香族化合物>鹵代物、醚>烯>飽和烴

3．柱子可以分為：加壓，常壓，減壓。

壓力可以增加淋洗劑的流動速度，減少產(chǎn)品收集的時間，但是會減低柱子的塔板數(shù)。所以其他條件相同的時候，常壓柱是效率最高的，但是時間也最長，比如天然化合物的分離，一個柱子幾個月也是有的。

加壓柱是一種比較好的方法，與常壓柱類似，只不過外加壓力使淋洗劑走的快些。壓力的提供可以是壓縮空氣，雙連球是常用的手動加壓的方法。特別是在容易分解的樣品的分離中適用。壓力不可過大，不然溶劑走的太快就會減低分離效果。個人覺得加壓柱在普通的有機化合物的分離中是比較適用的。

體會：過柱時是否加壓要具體分析，通常情況下直徑比較粗的柱子用常壓即可，因其橫截面積的緣故淋洗劑的流速已足夠快。通?？刂浦酉露艘后w流速大約在0.5~1滴每秒的范圍比較合適。

減壓柱能夠減少硅膠的使用量，感覺能夠節(jié)省一半甚至更多，但是由于大量的空氣通過硅膠會使溶劑揮發(fā)（有時在柱子外面有水汽凝結(jié)），以及有些比較易分解的東西可能得不到，而且還必須同時使用水泵抽氣（很大的噪音，而且時間長）。一般不推薦使用。

4.柱子的尺寸

從理論上講應(yīng)該是粗長的好。柱子長了，相應(yīng)的塔板數(shù)就高。柱子粗了，上樣后樣品的原點就?。ǚ从吃谥由暇褪菢悠穼颖容^薄），這樣相對的減小了分離的難度。試想如果柱子十厘米，而樣品就有二厘米，那么分離的難度可想而知，恐怕要用很低極性的溶劑慢慢沖了。而如果樣品層只有0.5厘米，那么各組分就比較容易得到完全分離了。當(dāng)然采用粗大的柱子要犧牲比較多的硅膠和溶劑了，不過這些成本相對于產(chǎn)品來說也許就不算什么了。

現(xiàn)在見到的柱子徑高比一般在1：5～10，書中寫硅膠量是樣品量的30～40倍，若需要時可增至100倍，具體選擇要具體分析。如果所需組分和雜質(zhì)分的比較開（是指在所需組分Rf在0.2～0.4，雜質(zhì)相差0.1以上），就可以少用硅膠，用小柱子（例如200毫克的樣品，用2cm×20cm的柱子）；如果相差不到0.1，就要加大柱子，我覺得可以增加柱子的長度，也可以減小淋洗劑的極性等等。

細(xì)長柱子可以增加塔板數(shù)，但是也會增加過柱的時間使樣品在固定相中擴(kuò)散影響分離效果。

5．溶劑

溶劑的選擇是重要的一環(huán)，通常根據(jù)被分離物中各種成分的極性、溶解度和吸附劑的活性等來考慮先將要分離的樣品溶于一定體積的溶劑中，選用的溶劑極性應(yīng)低，體積要小。如有的樣品在極性低的溶劑中溶解度很小，則可加入少量極性較大的溶劑，使溶液體積不致太大。樣品的展開首先使用極性較小的溶劑，使最容易脫附的組分分離。然后加入不同比例的極性溶劑配成的洗脫劑，將極性較大的化合物白色譜柱中洗脫下來。常用洗脫劑的極性按如下次序遞增：

己烷和石油醚<環(huán)己烷<四氯化碳<三氯乙烯<二硫化碳<甲苯<苯<二氯甲烷<氯仿<**<乙酸乙酯<丙酮<丙醇<乙醇<甲醇<水<吡啶<乙酸

常選用石油醚，乙酸乙酯。正己烷價格比較高。使用**、二氯甲烷等沸點較低的溶劑時，它和硅膠的吸附是一個放熱過程，特別是夏天的時候經(jīng)常會在柱子里產(chǎn)生氣泡，天氣冷的時候會好一些。由于硅膠中的活性羥基，用甲醇可能會洗下來一些硅膠中的東西，所以產(chǎn)品如果想過元素分析的話要留神，應(yīng)該經(jīng)過后繼處理，比如說重結(jié)晶等。

展開劑的比例要靠嘗試.一般根據(jù)文獻(xiàn)中報道的該類化合物用什么樣的展開劑，就首先嘗試使用該類展開劑，然后不斷嘗試比例，直到找到一個分離效果好的展開劑。很多時候,展開劑的選擇要靠自己不斷變換展開劑的組成來達(dá)到最佳效果。

體會：１）過柱的淋洗劑極性通常要比過板時極性要小。一般為了得到更好的分離，通常是要把樣品的Rf值調(diào)到0.2-0.3之間，不過，許多情況下，如果接受瓶小一些，即使Rf值在0.5，0.6。

２）盡量避免使用毒性較大的溶劑，如氯仿，可考慮用石油醚與乙酸乙酯調(diào)配。

３）當(dāng)混合溶劑作為淋洗劑時，要考慮所用溶劑的沸點差異在使用過程中揮發(fā)程度不一樣而造成的極性改變。

４）對于Rf值接近的化合物分離，可嘗試極性相近但由不同溶劑組成的混合體系作為淋洗劑可能會產(chǎn)生意想不到的效果。例如石油醚:乙酸乙酯＝５０:１與石油醚:二氯甲烷＝５:１的極性相近（僅是例子，具體比例有些忘了）的極性差不多，但是后者的分離效果可能優(yōu)于前者。

6．裝柱

柱子下面的活塞一定不要涂潤滑劑，會被淋洗劑帶到產(chǎn)品中的，可以采用四氟節(jié)門的。裝柱可采用濕法和干法兩種，二者各有優(yōu)劣。無論采用哪種方法裝柱，硅膠（固定相）的上表面一定要平整，并且都不要有裂縫或氣泡，雖然產(chǎn)生的氣泡在加壓的情況下不易察覺，但是，一旦撤去壓力，如在上樣、加溶劑等操作的時候，氣泡就會釋放出來，嚴(yán)重時，整個柱子變花，導(dǎo)致柱子開裂，樣品不可能平整地通過，當(dāng)然也就談不上分離了。

濕法裝柱：關(guān)閉柱子下端活塞，把硅膠用適量的溶劑拌成半透明狀的均勻稀糊（更像是湯），此時應(yīng)充分?jǐn)嚢?，仔?xì)觀察沒有氣泡后，以玻璃棒引流倒入事先裝有少量溶劑的空柱子中，然后打開活塞讓溶劑流出，硅膠自然沉降。注意：１）裝柱溶劑極性不大于過柱淋洗劑；２）倒入硅膠稀糊應(yīng)有耐心防止液體流擊出氣泡留于柱內(nèi)；３）過程中若已產(chǎn)生氣泡，則可趁著硅膠尚未完全沉降時用長玻棒攪動溶劑液面下的有氣泡處的硅膠可將其趕跑。待硅膠至所需高度后另加溶劑加壓走柱，注意硅膠柱上方應(yīng)時刻保留有一段溶劑！本法最大的優(yōu)點是一般柱子裝的比較結(jié)實，沒有氣泡。缺點是所須溶劑體積較大（當(dāng)然裝柱時用溶劑可以重復(fù)使用），耗時長。一般說來濕法裝柱較干法緊密均勻，建議初學(xué)者采用。

干法裝柱：是直接往柱子里填入硅膠，然后再輕輕敲打柱子兩側(cè)，至硅膠界面不再下降為止，然后再填入硅膠至合適高度，再用水泵在柱子下端直接抽，當(dāng)硅膠不再下落時，保持水泵抽氣狀態(tài)下，從柱子上倒入溶劑，注意倒入的溶劑流量必須大于水泵抽氣流量以保證柱子上方時刻保留一段溶劑！待溶劑前沿走到活塞時關(guān)閉活塞，注意此時因柱內(nèi)負(fù)壓溶劑仍在飛快往下走千萬別讓柱子干了！撤走水泵，待柱內(nèi)液面不再下降，此時柱子的下半部分是均勻的而上半部分可以看見有氣泡，打開活塞，倒入足夠的溶劑后從上端用剪去緩沖球的雙連球（即直接鼓氣）加壓，可將上半部分壓均勻無氣泡。若想柱子裝得緊密些，可用淋洗劑多走幾次柱子。本法的優(yōu)點是裝柱較方便，速度快，特別是裝體積較大的柱子特別能顯示時間優(yōu)勢（當(dāng)然大柱子因為溶劑走得太快容易抽干所以對技術(shù)的熟練程度要求更高些）。最大的缺陷在于抽氣時，由于溶劑和硅膠之間的吸附放熱（可以用手摸柱子明顯感覺到），不太適合低沸點的淋洗劑如**，二氯甲烷（易產(chǎn)生氣泡）。解決的辦法是：第一、硅膠一定要壓結(jié)實；第二、一定要用較多的溶劑“走柱子”，一定要到柱子的下端不再發(fā)燙，恢復(fù)到室溫后再撤去壓力。

不論用濕法或干法裝柱，若最后裝好時硅膠表面不平整，可用干凈玻棒將最上面約１厘米的硅膠重新?lián)v松，待其自然降落后，再加點溶劑壓緊即可。

７．上樣

樣品上樣分濕法、干法兩種。上樣的基本要求是使樣品以盡可能小的厚度上到柱子上，采用哪種方法應(yīng)根據(jù)樣品的實際情況而定，無論哪種都要求樣品中不含大于淋洗劑極性的溶劑。

濕法上樣：適合濕法的樣品應(yīng)該是粘度不大均勻液體樣品或者在小極性溶劑（極性不大于淋洗劑）中溶解度非常好的固體樣品（保證上樣過程中不會析出）。用于溶解樣品的溶劑體積應(yīng)越少越好。打開活塞，控制柱子上方溶劑恰好流干時關(guān)閉活塞，即用滴管吸取樣品，沿柱子內(nèi)壁于硅膠面上方0.5cm以內(nèi)距離均勻地加樣，待樣品布滿硅膠面后打開活塞，繼續(xù)加樣。加樣的速度以柱子不出現(xiàn)氣泡為限。待所有樣品上完后，用盡可能少的溶劑洗劑樣品瓶，待樣品在硅膠上恰好走干后依上樣法將溶液加到硅膠上。（若樣品量比較大則可省去該步）。另取干凈滴管從上樣處上方沿柱子內(nèi)壁淋洗，確定所有樣品開始在柱子中展開后可加入大量溶劑開始過柱。若擔(dān)心上樣及加溶劑過程中會將柱子表面弄破可考慮在上樣前先在柱子上加一層石英砂。過程中時刻保持柱子不要干出氣泡或裂紋！

很多樣品在上柱前是粘乎乎的，一般沒關(guān)系，仍可用濕法?？墒怯械纳蠘雍笤诠枘z上又會析出，這時候建議采用干法上樣。

干法上樣：干法就是把待分離的樣品用少量低沸點大極性溶劑溶解后，在加入少量硅膠，拌勻后再旋去溶劑，注意必須在油泵上完全抽干大極性溶劑！如此得到的粉末再小心加到柱子的頂層，注意保留足夠的溶劑使加入的干粉恰好能被覆蓋以防柱子開裂（溶劑太多也不好，相當(dāng)于增加了上樣厚度）。此時加入的干粉層中可能會有大量的氣泡，但由于是松的，可以用玻棒稍做攪拌以除去氣泡，同樣要保持硅膠表面的平整。

有些樣品溶解性差，能溶解的溶劑又不能上柱（比如DMF,DMSO等，會隨著溶劑一起顯色是一個很長的脫尾，這些溶劑雖溶解性好，但是沸點太高不易除去應(yīng)避免），這時就必須用干法上柱了。

用于吸附上樣的硅膠要求：１）樣品和硅膠的量比例問題：應(yīng)盡可能地少用硅膠，可先按1：2嘗試，保證在旋干后固體是均勻的，不能看到有樣品顆粒析出（那說明有的樣品沒有吸附在硅膠上）。若有，則應(yīng)重新用溶劑溶解后再加入硅膠重新抽干。２）硅膠顆粒通常要比作為固定相的大，以保證能盡快脫附降低上樣厚度。

也可以在硅膠的最上層填上一小層石英砂或蓋張濾紙或加塊棉花，防止添加溶劑的時候，使得樣品層不再整齊。但我的感覺是如果小心上樣，添加溶劑，可以什么都不用。

8.樣品的收集

用硅膠作固定相過柱子的原理是一個吸附與解吸的平衡。所以如果樣品與硅膠的吸附比較強的話，就不容易流出。這樣就會發(fā)生，后面的點先出，而前面的點后出。這時可以采用氧化鋁作固定相。

另外，收集的試管大小要以樣品量而定，特別是小量樣品，如果用大試管，可能一根就收到了三個樣品。如果都用小試管那工作量又太大。層析技術(shù)

一．層析法的基本原理：層析過程是基于樣品組分在互不相溶的兩“相”溶劑之間的分配系數(shù)之差（分配層析），組分對吸附劑吸附能力不同（吸附層析），和寓子交換，分子的大?。ㄅ抛鑼游觯┒蛛x。通常又將一般的以流動相為氣體的稱為氣相層析，流動相為液體的稱為液相層析。

一、吸附層析法（AdsorptionChromatography）吸附劑、溶劑與被分離物性質(zhì)的關(guān)系：液一固吸附層析是運用較多的一種方法，特別適用于很多中等分子量的樣品（分子量小于1，000的低揮發(fā)性樣品）的分離，尤其是脂溶性成分一一般不適用于高分子量樣品如蛋白質(zhì)、多糖或離子型親水住化合物等的分離。吸附層析的分離效果，決定于吸附劑、溶劑和被分離化合物的性質(zhì)這三個因素。1．吸附劑：常用的吸附劑有硅膠、氧化鋁、活性炭、硅酸鎂、聚酰胺、硅藻土等。

（1）硅膠：層析用硅膠為一多孔性物質(zhì)，分子中具有硅氧烷的交鏈結(jié)構(gòu)，同時在顆粒表面又有很多硅醇基。硅膠吸附作用的強弱與硅醇基的含量多少有關(guān)。硅醇基能夠通過氫鍵的形成而吸附水分，因此硅膠的吸附力隨吸著的水分增加而降低。若吸水量超過17％，吸附力極弱不能用作為吸附劑，但可作為分配層析中的支持劑。對硅膠的活化，當(dāng)硅膠加熱至100～110℃時，硅膠表面因氫鍵所吸附的水分即能被除去。當(dāng)溫度升高至500℃時，硅膠表面的硅醇基也能脫水縮臺轉(zhuǎn)變?yōu)楣柩跬殒I，從而喪失了因氫鍵吸附水分的活往，就不再有吸附劑的性質(zhì)，雖用水處理亦不能恢復(fù)其吸附活性。所以硅膠的活化不宜在較高溫度進(jìn)行（一般在170cC以上即有少量結(jié)合水失去）。

硅膠是一種酸性吸附劑，適用于中性或酸性成分的層析。同時硅膠又是一種弱酸性陽離子交換劑，其表面上的硅醇基能釋放弱酸性的氫離子，當(dāng)遇到較強的堿注化臺物，則可因離子交換反應(yīng)而吸附堿性化合物。

（2）氧化鋁：氧化鋁可能帶有堿性（因其中可混有碳酸鈉等成分），對于分離一些堿性中草藥成分，如生物堿類的分離頗為理想。但是堿性氧化鋁不宜用于醛、酮、醋、內(nèi)酯等類型的化合物分離。因為有時堿性氧化鋁可與上述成分發(fā)生次級反應(yīng)，如異構(gòu)化、氧化、消除反應(yīng)等。除去氧化鋁中絢堿性雜質(zhì)可用水洗至中性，稱為中性氧化鋁。中性氧化鋁仍屬于堿性吸附劑的范疇，本適用于酸性成分的分離。用稀硝酸或稀鹽酸處理氧化鋁，不僅可中和氧化鋁中含有的堿性雜質(zhì)，并可使氧化鋁顆粒表面帶有NO3一或CI一的陰離子，從而具有離于交換劑的性質(zhì)，適合于酸性成分的層析，這種氧化鋁稱為酸性氧化鋁。供層析用的氧化鋁，用于拄層析的，其粒度要求在100～160目之間。粒度大子100目，分離效果差：小于160目，溶濃流速大慢，易使譜帶擴(kuò)散。樣品與氧化鋁的用量比，一般在1：20～50之間層析柱的內(nèi)徑與柱長比例在1：10-20之向。在用溶劑沖洗柱時，流速不宜過快，洗脫液的流速一般以每半～1小時內(nèi)流出液體的毫升數(shù)與所用吸附劑的重量（克）相等為合適。

（3）活性炭：是使用較多的一種非極性吸附劑。一般需要先用稀鹽酸洗滌，其次用乙醇洗，再以水洗凈，于80℃干燥后即可供層析用。層析用的活性炭，最好選用顆?；钭⑻浚魹榛钚蕴考?xì)粉，則需加入適量硅藻土作為助濾劑一并裝柱，以免流速太慢。活性炭主要且于分離水溶性成分，如氨基酸、糖類及某些甙。活性炭的有為吸附作用，在水溶液中最強，在有機溶劑中則較低弱。故水的洗脫能力最弱，而有機溶劑則較強。例如以醇-水進(jìn)行洗脫時，則隨乙醇濃度的遞增而洗脫力增加。活性炭對芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物，對大分子化合物的吸附力大于小分子化合物。利用這些吸附性的差別，可將水溶性芳香族物質(zhì)與脂肪族物質(zhì)分開，單糖與多糖分開，氨基酸與多肽分開。

2．溶劑：層析過程中溶劑的選擇，對組分分離關(guān)系極大。在柱層析時所用的溶劑（單一劑或混合溶劑）習(xí)慣上稱洗脫劑，用于薄層或紙層析時常稱展開劑。洗脫劑的選擇，須根據(jù)被分離物質(zhì)與所選用的吸附劑性質(zhì)這兩者結(jié)合起來加以考慮在用極性吸附劑進(jìn)行層析時，當(dāng)被分離物質(zhì)為弱極性物質(zhì)，一般選用弱極性溶劑為洗脫劑；被分離物質(zhì)為強極性成分，則須選用極性溶劑為洗脫劑。如果對某一極性物質(zhì)用吸附性較弱的吸附劑（如以硅藻土或滑石粉代替硅膠），則洗脫劑的極性亦須相應(yīng)降低。在柱層操作時，被分離樣品在加樣時可采用于法，亦可選一適宜的溶劑將樣品溶解后加入。溶解樣品的溶劑應(yīng)選擇極性較小的，以便被分離的成分可以被吸附。然后漸增大溶劑的極性。這種極性的增大是一個十分緩慢的過程，稱為“梯度洗脫”，使吸附在層析柱上的各個成分逐個被洗脫。如果極性增大過訣（梯度太大），就不能獲得滿意的分離。溶劑的洗脫能力，有時可以用溶劑的介電常數(shù)（ε）來表示。介電常數(shù)高，洗脫能力就大。以上的洗脫順序僅適用于極性吸附劑，如硅膠、氧化鋁。對非極性吸附劑，如活性炭，則正好與上述順序相反，在水或親水住溶劑中所形成的吸附作用，較在脂溶性溶劑中為強。

3．被分離物質(zhì)的性質(zhì)：被分離的物質(zhì)與吸附劑，洗脫劑共同構(gòu)成吸附層析中的三個要素，彼此緊密相連。在指定的吸