醫(yī)藥衛(wèi)生行業(yè)微生物知識學(xué)習(xí)培訓(xùn)課件（控制菌、微生物檢驗、消毒、滅菌、微生物污染藥品的途徑）

醫(yī)藥

工業(yè)微生物知識目錄微生物概況與藥品生產(chǎn)相關(guān)的幾類微生物幾種控制菌微生物污染藥品的途徑消毒、滅菌工藝驗證、設(shè)備驗證環(huán)境檢測微生物檢驗醫(yī)藥衛(wèi)生行業(yè)微生物知識學(xué)習(xí)培訓(xùn)課件3什么是微生物？一切肉眼看不見或看不清楚的微小生物的總稱(一般個體<0.1mm)。是一些個體微小、構(gòu)造簡單的低等生物。微生物概況原核細(xì)胞型：細(xì)菌放線菌支原體衣原體立克次氏體螺旋體等真核細(xì)胞型：霉菌酵母菌非細(xì)胞型：病毒

噬菌體

分類4微生物特性種類多分布廣個體小面積大生長旺繁殖快吸收多轉(zhuǎn)化快適應(yīng)強異變異5微生物特性

種類多

分布廣無處不在無孔不入高溫高壓酸性堿性已知10萬種，占總量的20%，開發(fā)利用的僅占1%1g肥沃土壤含20億個微生物，1g貧瘠土壤含3~5億個空氣8000~3500個/m3賀慶瑞6個體小

比表面積大桿菌的寬度是0.5微米，因此80個桿菌“肩并肩”地排列成橫隊，也只有一根頭發(fā)絲的寬度物體的表面積和體積之比稱為比表面積。大腸桿菌的比表面積是人的30萬倍微生物特性

比表面積大，代謝速率非?？欤话慵?xì)菌20min就能繁殖一代賀慶瑞7微生物特性

吸收多

轉(zhuǎn)化快凡是動植物能利用的營養(yǎng)，微生物都能利用，大量的動植物不能利用的物質(zhì)，甚至劇毒的物質(zhì)，微生物照樣可以視為美味佳肴大腸桿菌在合適條件下，每小時可以消耗相當(dāng)于自身重量2000倍的糖，而人體則需要40年之久笑嘻嘻8適應(yīng)強、易變異適應(yīng)強

易變異多數(shù)細(xì)菌能耐0～－196℃的低溫；在海洋深處的某些硫細(xì)菌可在250～300℃的高溫條件下正常生長一些嗜鹽細(xì)菌甚至能在飽和鹽水中正常生活；產(chǎn)芽孢細(xì)菌和真菌孢子在干燥條件下能保藏幾十年、幾百年青霉素生產(chǎn)菌的發(fā)酵水平由每毫升20單位上升到近10萬單位xxx9與藥品生產(chǎn)相關(guān)的幾類微生物

細(xì)菌xxx細(xì)菌XXX11細(xì)菌定義及分類細(xì)菌是一類細(xì)胞細(xì)而短、結(jié)構(gòu)簡單、以二等分裂方式繁殖的原核微生物，分布廣泛。細(xì)菌有三種基本形態(tài)：球菌、桿菌、螺旋菌。球菌：單球菌雙球菌

鏈球菌

四聯(lián)球菌八疊球菌葡萄球菌等

分裂繁殖后，一般不會呈單個存在（CFU）XXX12細(xì)菌

細(xì)菌繁殖二分分裂繁殖是細(xì)菌最普遍、最主要的繁殖方式。在分裂前先延長菌體，染色體復(fù)制為二，然后垂直于長軸分裂，細(xì)胞赤道附近的細(xì)胞質(zhì)膜凹陷生長，直至形成橫隔膜，同時形成橫隔壁，這樣便產(chǎn)生兩個子細(xì)胞。

XXX細(xì)菌

細(xì)菌繁殖

細(xì)菌細(xì)胞分裂的電鏡超薄切片圖

桿菌二分裂過程模式圖XXX14細(xì)菌

G+、G-G+細(xì)菌

細(xì)胞壁厚，主要成分是肽聚糖，占細(xì)胞干重的50%~80%.革蘭氏染色呈紫色細(xì)菌G-細(xì)菌

細(xì)胞壁薄，主要成分是LPS(脂多糖:脂質(zhì)和多糖的復(fù)合物），有致熱作用，是細(xì)菌內(nèi)毒素有效成分。

革蘭氏染色呈紅色XXX脂質(zhì)15細(xì)菌

G+、G-G+細(xì)胞壁顯微結(jié)構(gòu)G-細(xì)胞壁顯微結(jié)構(gòu)G+染色圖G-染色圖XXX16細(xì)菌

細(xì)菌內(nèi)毒素

①水的污染：制備操作不當(dāng)

水質(zhì)不好細(xì)菌繁殖使滅活后存在細(xì)菌裂解物

②盛水容器

生產(chǎn)裝置輸送管道污染

③

原料含菌量過高

④滅菌工藝不合格造成滅菌不徹底

①耐熱性：250℃加熱30min，

②濾過性：1~5nm之間，故能通過濾器進(jìn)入濾液中。

③具有水溶性及不揮發(fā)性

④能被強酸、強堿和氧化劑破壞①高溫破壞法

②吸附法活性炭

③酸堿氧化法

④

離子交換法

⑤反滲透法

⑥

凝膠過濾法⑦

超濾法理化

特性污染

途徑去除

方法XXX17細(xì)菌

細(xì)菌內(nèi)毒素細(xì)菌內(nèi)毒素（LPS）1,3-(β,D)-葡聚糖C因子被活化為活化C因子B因子被活化為活化B因子G因子被活化為活化G因子凝固酶原產(chǎn)生凝固酶凝固蛋白原產(chǎn)生凝固蛋白（凝膠）革蘭氏陰性菌死亡真菌等代謝產(chǎn)生XXX18細(xì)菌

細(xì)菌內(nèi)毒素G+和芽孢的關(guān)系、芽孢特性

耐熱性強XXX19細(xì)菌

細(xì)菌內(nèi)毒素G+和芽孢的關(guān)系、芽孢特性芽孢桿菌XXX20細(xì)菌

細(xì)菌的菌落單個或少數(shù)細(xì)菌細(xì)胞生長繁殖后，會形成以母細(xì)胞為中心的一堆肉眼可見、有一定形態(tài)構(gòu)造的子細(xì)胞集團(tuán)，這就是菌落。

細(xì)菌的菌落特征因種而異?？勺鳛殍b定細(xì)菌種的依據(jù)。細(xì)菌含有莢膜，形成的菌落濕潤、光滑、具有光澤，黏液狀，呈光滑性菌落。不含莢膜的細(xì)菌形成的菌落干燥。CFUCFU（Colony-FormingUnits)菌落形成單位，對應(yīng)的是一種計數(shù)方法。例如

100CFU/ml,指的是美1ml這種液體中含的微生物可以形成100個菌落，但是并不是說明每1ml液體中含有100個菌。XXX21細(xì)菌

細(xì)菌的菌落

粘質(zhì)沙雷氏菌

沙門氏菌銅綠假單孢菌

弗氏志賀氏粘質(zhì)沙雷氏菌XXX22放線菌

鏈霉菌的一般形態(tài)和構(gòu)造放線菌顯微鏡照片XXX23放線菌

放線菌的菌落特征A：諾爾斯氏鏈霉菌；B：皮疽諾卡氏菌；C：酒紅指孢囊菌；D：游動放線菌；E：小單胞菌；F：皺雙孢馬杜拉放線菌產(chǎn)抗菌素的放線菌的菌落特征

A：卡特利鏈霉菌；B：弗氏鏈霉菌；C：吸水鏈霉菌金淚亞種；D：卡那霉素鏈霉菌；E：除蟲鏈霉菌；F：生磺酸鏈霉菌XXX24酵母菌

酵母菌是一類單細(xì)胞、呈球形或卵圓形的真菌。自然界中分布較廣，主要生長在含糖量比較豐富的偏酸性環(huán)境中。細(xì)胞壁25~70nm，重量約占細(xì)胞干重的25%，主要成分是葡聚糖、甘露聚糖、蛋白質(zhì)及幾丁質(zhì)。不同于細(xì)胞細(xì)胞壁，也不同于植物細(xì)胞壁。使用不同消毒劑XXX25霉菌

外層：甘露聚糖內(nèi)層：葡聚糖

中間層：蛋白質(zhì)

細(xì)胞壁電子顯微鏡下結(jié)構(gòu)示意圖XXX26霉菌青霉是種真菌，屬于子囊菌。有的能產(chǎn)生青霉素

產(chǎn)生無性孢子。根霉（Rhizopus)是種真菌，屬于接合菌。能產(chǎn)生無性孢子菌絲體的直徑約12um黑的是孢子囊XXX27霉菌

各種曲霉的菌落XXX28幾種控制菌本公司需要控制的集中控制菌XXX29大腸埃希菌XXX大腸

埃希菌廣泛存在于環(huán)境中，如水中，人畜的腸道、糞便中，所以把大腸埃希菌作為藥品有沒有受到污染的一種指標(biāo)菌幾乎所有的原輔料都需要檢測大腸埃希菌，若檢測出大腸埃希菌，說明藥品很有可能已經(jīng)被污染。30金黃色葡萄球菌XXX金黃色

葡萄球菌金黃色葡萄球菌在自然界中無處不在，空氣、水、灰塵及人和動物的排泄物中都可找到。可引起局部化膿感染

局部用劑會控制金黃色葡萄球菌，例如吉百芙。用于生產(chǎn)吉百芙的原輔料均要檢測金黃色葡萄球菌，純化水也需要檢查金黃色葡萄球菌。31銅綠假單胞菌XXX銅綠

假單胞菌在自然界分布廣泛，為土壤中存在的最常見的細(xì)菌之一。各種水、空氣、正常人的皮膚、呼吸道和腸道等都有本菌存在。

經(jīng)常引起術(shù)后傷口感染，也可引起褥瘡、膿腫、化膿性中耳炎等

吉百芙、吉百芙的原輔料、純化水32沙門氏菌XXX沙門氏菌沙門氏菌病是公共衛(wèi)生學(xué)上具有重要意義的人畜共患病之一

部分輔料要求檢查沙門氏菌。例如USP中，硬脂酸鎂就要求每10g樣品中不得檢出沙門氏菌。純化水也要求檢出沙門氏菌。33微生物污染藥品的幾種途徑潔凈區(qū)污染的途徑空氣水表面器具XXX人員人員人是藥廠中最不清潔的成份，是最常見的、永不休止的污染源。人自出生后，外界的微生物就逐漸進(jìn)入人體。在正常人體皮膚、粘膜及外界相通的各種腔道（如口腔、鼻咽腔、腸道和泌尿道）等部位，存在著對人體無害的微生物群，包括細(xì)菌、真菌、螺旋體、支原體等，稱為正常菌群。人體的皮膚、手、臉、毛孔、皺紋處及潮濕部位等常有金黃色葡萄球菌、藤黃八疊球菌、類白喉桿菌等；偶有革蘭陰性菌；在皮膚上還有各種皮膚真菌。車間環(huán)境監(jiān)測中出現(xiàn)的最多的兩種菌是表皮葡萄球菌和微球菌屬某些種，這兩種菌被人員帶入的可能性很大。XXX35人員頭發(fā)皮膚嘴巴鼻子衣著化妝品手飾每分鐘從人類皮膚中要散發(fā)出約10,000個微生物,一小粒糖大的頭發(fā)中能裝載4億個微生物呼吸、咳嗽和噴嚏將產(chǎn)生出大量水滴，這種水滴既含有塵粒污染也含有微生物污染潔凈室內(nèi)當(dāng)工作人員穿無菌服（經(jīng)過過度滅菌處理）時，靜止時的發(fā)菌量為10～300個/(min·人)，軀體一般活動時的發(fā)菌量為150～1000個(min·人)，快步行走時的發(fā)菌量為900～2500個(min·人)。發(fā)膠、氣霧除臭劑、眼臉膏、香粉等，為微生物污染提供了極好的源泉。耳環(huán)、戒指、項鏈、手鏈等首飾，因為它們難于清洗，所以可能成為感染源或污染源XXX36空氣XXX從空氣中可分離到芽孢桿菌、梭菌、葡萄球菌、鏈球菌、棒狀桿菌等；還可分離到青霉、曲霉、毛霉、芽枝霉和酵母等。每立方米的空氣中至少含有60萬顆塵粒，同時還存在著大量的微生物，在這樣的空氣條件下進(jìn)行生產(chǎn)，肯定會污染藥品。使空氣質(zhì)量達(dá)到我們的要求。這就是要建立密閉廠房和空氣凈化系統(tǒng)的原因。使用的氣體經(jīng)過HEPA（高效過濾）后，再進(jìn)入潔凈區(qū)。潔凈區(qū)使用的氮氣等也是無菌的。潔凈區(qū)內(nèi)還會定期進(jìn)行臭氧熏蒸消毒或者在外線輻射消毒，主要針對的也是氣體。例如進(jìn)入隧道烘箱的氣體是經(jīng)過過濾的，百級層流，保證粒子按單一方向運行，保護(hù)環(huán)境。37水水可以分為生水、標(biāo)準(zhǔn)飲用水、純化水（通過蒸餾、離子交換、反滲透制得）、注射用水。各類水，不管怎樣仔細(xì)地蒸溜或過濾，總會含有一定量的可溶性有機(jī)物和鹽類。正是這些可溶性的物質(zhì)可被微生物利用作為它們生長的養(yǎng)料源泉。

自來水中不應(yīng)有已知的病原菌，除控制大腸桿菌群數(shù)外，仍含有其他微生物。去離子水中，污染微生物仍嚴(yán)重。蒸餾水中，污染的菌群通常是革蘭陰性菌，也有發(fā)現(xiàn)綠膿桿菌的記載。水每天進(jìn)行檢測，保證微生物在合格范圍內(nèi)。

XXX38潔凈區(qū)墻面、地面、設(shè)備表面由于空氣中的濕度、所有表面都被包上了一層含水的薄膜、這層薄膜由于靜電吸引而飽含塵埃，許多時候，表面還覆蓋一層油狀物，此油膜易受到塵粒污染。清洗：從表面除去泥土和其它微粒，從而阻止污染物聚積和生長的過程。消毒滅菌：消滅清洗后常常留在表面的致病菌的過程。人員接觸潔凈區(qū)表面也可能造成表面存在微生物，所以一般要求人員不能依靠在潔凈區(qū)表面。XXX39器具生產(chǎn)用器具經(jīng)過滅菌柜蒸汽滅菌或者烘箱干熱滅菌處理后（均屬于過度滅菌）再傳入，風(fēng)險較少。其他物料經(jīng)過消毒劑擦拭消毒或紫外燈消毒后傳入，有一定風(fēng)險。XXX40原輔料綜述原輔料經(jīng)檢測合格后使用，風(fēng)險較少。

綜上所述，控制潔凈區(qū)環(huán)境的重點是人員和物料的傳入部分。重點關(guān)注G-菌（可以產(chǎn)生內(nèi)毒素），芽孢桿菌（產(chǎn)生耐受性強的芽孢），霉菌（產(chǎn)生大量孢子）。XXX41消毒與滅菌1滅菌——使達(dá)到無菌狀態(tài)的方法。通常是指殺滅或除去全部活的微生物（包括繁殖體和芽孢）。2消毒——用物理或化學(xué)方法殺滅或清除傳播媒介上的病原微生物，使其達(dá)到無害化。所以消毒是不徹底的，不能代替滅菌。XXX42干熱滅菌法干熱滅菌法干熱通過使蛋白質(zhì)氧化、變性、炭化和電解質(zhì)濃縮中毒而使微生物死亡，但對微生物的滅活能力遠(yuǎn)不及濕熱。如車間的干熱烘箱用來沒膠塞桶、膠塞旋轉(zhuǎn)盤等（除熱源）。微生物實驗室200℃，60min用來干熱滅菌取樣器具，250℃，60min用來除內(nèi)毒素。XXX43濕熱滅菌法濕熱滅菌法通過熱蒸汽或沸水使蛋白質(zhì)變性而殺滅微生物的方法。濕熱穿透力強，滅菌效果較干熱好。其殺菌所需溫度較低，對物品的穿透速度快，要求持續(xù)時間短，因此是目前最好的消毒與滅菌方法。

①煮沸或流通蒸汽滅菌：100℃，處理30~60min②低溫間隙滅菌（巴斯德滅菌法）：先用60~80℃加熱（或煮沸）1h，然后置20~25℃保存24h，使其中殘存的芽孢萌發(fā)成繁殖體，再滅菌，反復(fù)三次。③高壓蒸汽滅菌：通過加壓提高蒸汽溫度，滅菌效果最好。常用條件為：

121℃15過度滅菌115℃32minF0=8殘存概率滅菌XXX44F0值、Z值、D值、SALD值Z值SAL指的是121℃蒸汽滅菌的時間。如F0=8,表示121℃蒸汽滅菌8min。如115℃，滅菌32min的F0=8，意思是說115℃，32min和121℃,8min滅菌效果相同。在一定的處理環(huán)境中和在一定的熱力致死溫度條件下某細(xì)菌數(shù)群中每殺死90%原有殘存活菌數(shù)時所需要的時間使D值下降一個對數(shù)單位需要提高的溫度無菌保障水平，一般要求污染概率不超過百萬分之一，也就是SAL<10-6F0值XXXLOGO45

影響濕熱滅菌的因素

細(xì)菌的種類和數(shù)量，藥物性質(zhì)與滅菌時間，蒸汽的性質(zhì)（蒸汽飽和度），介質(zhì)的性質(zhì)（滅菌溶液的性質(zhì)）

生物指示劑挑戰(zhàn)實驗D值SALXXX做生物指示劑挑戰(zhàn)實驗的目的，我認(rèn)為是證明滅菌效果，也就是保證SAL<10-6，而不是為了證明F0>8。F0>8有物理測試保證。保證SAL<10-6需要的F0=D污（lgN污+6）

挑戰(zhàn)實驗反應(yīng)出來的F0值

F0=DBI（lgNBI+1）

DBI是生物指示劑的D值，NBI是指示劑開始的孢子量，括號內(nèi)加1的意思是：把孢子數(shù)滅菌到100（也就是剩余1個菌）之后，再下降一個對數(shù)單位，這樣就是無菌生長。

D污是是平時污染菌中最耐熱菌的D值，這個如果有數(shù)據(jù)積累的話，應(yīng)該是知道的?，F(xiàn)在沒有數(shù)據(jù)積累。我們平時檢測耐熱菌，藥液先經(jīng)過100℃，30min處理，檢測無菌性。到目前為止沒有異常體現(xiàn)。如果按Z=10℃計算，100℃，30min處理，相當(dāng)于121℃，0.3min。即污染菌中的D<0.3。

N污是污染菌的數(shù)量，我們控制的標(biāo)準(zhǔn)是102，如果這是警戒線，加上一個安全因子，行動限定為103。

假如現(xiàn)在有106個樣品，每個樣品中含有N污個菌。6代表的是把N污染降到100（也就是剩余1個菌）之后，繼續(xù)滅菌，再次使這106個樣品降低到只有一個樣品里含有1個菌。也就是污染率不超過百萬分之一。（SAL<10-6）

所以達(dá)到SAL<10-6,我們只需要的F0=D污（lgN污+6）=0.3(3+6)=2.7

我們選用的NBI在7.0×103左右，D在1.7左右，測得的F0在8.0左右。NBI數(shù)量變化，反應(yīng)出來的F0有時候會小于8，但在8左右。但SAL<10-6是可以保證的。NBI數(shù)量我們很難控制到一個確切的數(shù)字，所以反應(yīng)出來的F0會在8左右，但SAL可以保證。

我認(rèn)為要求非過度滅菌工藝F0>8，是為了更有效的保證SAL<10-6，更有安全性。47化學(xué)滅菌法D值SALXXX常用化學(xué)消毒劑分為8類：①含氯消毒劑；②過氧化物類消毒劑；③醛類消毒劑；④雜環(huán)類氣體消毒劑；⑤醇類消毒劑；⑥酚類消毒劑；⑦季銨鹽類消毒劑；⑧其他類消毒劑（氯己定、碘、碘伏、高錳酸鉀、高氧化還原電位酸性水等）。

消毒劑不是無菌的概念

FDA官員曾經(jīng)在消毒劑中發(fā)現(xiàn)過耐受菌的存在，所以FDA的觀點，消毒劑不是無菌的。因而在關(guān)鍵區(qū)域使用的消毒劑，若購買的不是無菌產(chǎn)品，需要經(jīng)過0.22μm濾膜過濾后使用。市場上出售的消毒劑有的是經(jīng)過0.22μm過濾的品種，或者射線輻射滅菌的無菌消毒劑。48濾過除菌法D值SALXXX利用細(xì)菌不能通過致密具孔濾材的原理，除去對熱不穩(wěn)定的藥品溶液或液體物質(zhì)中的細(xì)菌的方法。過濾法一般只能除菌，不能除去支原體和病毒。

過濾除菌的效果與濾膜的性能、孔徑的大小、密度、濾膜的厚度等因素有關(guān)。

濾過除菌法要求最終過濾的濾膜孔徑為0.22μm。49輻射滅菌法D值SALXXX利用細(xì)菌不能通過致密具孔濾材的原理，除去對熱不穩(wěn)定的藥品溶液或液體物質(zhì)中的細(xì)菌的方法。過濾法一般只能除菌，不能除去支原體和病毒。

過濾除菌的效果與濾膜的性能、孔徑的大小、密度、濾膜的厚度等因素有關(guān)。

濾過除菌法要求最終過濾的濾膜孔徑為0.22μm。50濾過除菌法D值SALXXX利用細(xì)菌不能通過致密具孔濾材的原理，除去對熱不穩(wěn)定的藥品溶液或液體物質(zhì)中的細(xì)菌的方法。過濾法一般只能除菌，不能除去支原體和病毒。

過濾除菌的效果與濾膜的性能、孔徑的大小、密度、濾膜的厚度等因素有關(guān)。

濾過除菌法要求最終過濾的濾膜孔徑為0.22μm。51工藝驗證、設(shè)備驗證D值SALXXX1、模擬灌裝、分裝

模擬實際生產(chǎn)過程中最糟糕的狀況，如人員最多、維修設(shè)備、灌裝時間最長等等情況。

2、工藝驗證模擬生產(chǎn)過程，時間過長，微生物和內(nèi)毒素會不會滋生超過控制標(biāo)準(zhǔn)。

3、設(shè)備驗證：

隧道烘箱、干熱烘箱（除