王鏡巖生物化學(xué)（第三版）答案

朽木易折，金石可鏤。千里之行，始于足下。全文共頁(yè)-word可編輯生物化學(xué)（第三版）課后習(xí)題詳細(xì)解答第三章氨基酸提要α-氨基酸是蛋白質(zhì)的構(gòu)件分子，當(dāng)用酸、堿或蛋白酶水解蛋白質(zhì)時(shí)可獲得它們。蛋白質(zhì)中的氨基酸都是L型的。但堿水解得到的氨基酸是D型和L型的消旋混合物。參加蛋白質(zhì)組成的基本氨基酸惟獨(dú)20種。此外還有若干種氨基酸在某些蛋白質(zhì)中存在，但它們都是在蛋白質(zhì)生物合成后由相應(yīng)是基本氨基酸（殘基）經(jīng)化學(xué)修飾而成。除參加蛋白質(zhì)組成的氨基酸外，還有無(wú)數(shù)種其他氨基酸存在與各種組織和細(xì)胞中，有的是β-、γ-或δ-氨基酸，有些是D型氨基酸。氨基酸是兩性電解質(zhì)。當(dāng)pH臨近1時(shí)，氨基酸的可解離基團(tuán)所有質(zhì)子化，當(dāng)pH在13左右時(shí)，則所有去質(zhì)子化。在這中間的某一pH（因不同氨基酸而異），氨基酸以等電的兼性離子（H3N+CHRCOO-）狀態(tài)存在。某一氨基酸處于凈電荷為零的兼性離子狀態(tài)時(shí)的介質(zhì)pH稱為該氨基酸的等電點(diǎn)，用pI表示。所有的α-氨基酸都能與茚三酮發(fā)生色彩反應(yīng)。α-NH2與2,4-二硝基氟苯（DNFB）作用產(chǎn)生相應(yīng)的DNP-氨基酸（Sanger反應(yīng)）；α-NH2與苯乙硫氰酸酯（PITC）作用形成相應(yīng)氨基酸的苯胺基硫甲酰衍生物（Edman反應(yīng)）。胱氨酸中的二硫鍵可用氧化劑（如過(guò)甲酸）或還原劑（如巰基乙醇）斷裂。半胱氨酸的SH基在空氣中氧化則成二硫鍵。這幾個(gè)反應(yīng)在氨基酸荷蛋白質(zhì)化學(xué)中占有重要地位。除甘氨酸外α-氨基酸的α-碳是一個(gè)手性碳原子，因此α-氨基酸具有光學(xué)活性。比旋是α-氨基酸的物理常數(shù)之一，它是鑒別各種氨基酸的一種按照。參加蛋白質(zhì)組成的氨基酸中色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸在紫外區(qū)有光吸收，這是紫外吸收法定量蛋白質(zhì)的根據(jù)。核磁共振（NMR）波譜技術(shù)在氨基酸和蛋白質(zhì)的化學(xué)表征方面起重要作用。氨基酸分析分離主意主要是基于氨基酸的酸堿性質(zhì)和極性大小。常用主意有離子交換柱層析、高效液相層析（HPLC）等。習(xí)題1.寫出下列氨基酸的單字母和三字母的縮寫符號(hào)：精氨酸、天冬氨酸、谷氨酰氨、谷氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。[見(jiàn)表3-1]表3-1氨基酸的簡(jiǎn)寫符號(hào)名稱三字母符號(hào)單字母符號(hào)名稱三字母符號(hào)單字母符號(hào)丙氨酸(alanine)AlaA亮氨酸(leucine)LeuL精氨酸(arginine)ArgR賴氨酸(lysine)LysK天冬酰氨(asparagines)AsnN甲硫氨酸(蛋氨酸)(methionine)MetM天冬氨酸(asparticacid)AspD苯丙氨酸(phenylalanine)PheFAsn和/或AspAsxB半胱氨酸(cysteine)CysC脯氨酸(praline)ProP谷氨酰氨(glutamine)GlnQ絲氨酸(serine)SerS谷氨酸(glutamicacid)GluE蘇氨酸(threonine)ThrTGln和/或GluGlsZ甘氨酸(glycine)GlyG色氨酸(tryptophan)TrpW組氨酸(histidine)HisH酪氨酸(tyrosine)TyrY異亮氨酸(isoleucine)IleI纈氨酸(valine)ValV2、計(jì)算賴氨酸的εα-NH3+20%被解離時(shí)的溶液PH。[9.9]解：pH=pKa+lg20%pKa=10.53(見(jiàn)表3-3，P133)pH=10.53+lg20%=9.833、計(jì)算谷氨酸的γ-COOH三分之二被解離時(shí)的溶液pH。[4.6]解：pH=pKa+lg2/3%pKa=4.25pH=4.25+0.176=4.4264、計(jì)算下列物質(zhì)0.3mol/L溶液的pH：(a)亮氨酸鹽酸鹽；(b)亮氨酸鈉鹽；(c)等電亮氨酸。[(a)約1.46,(b)約11.5,(c)約6.05]5、按照表3-3中氨基酸的pKa值，計(jì)算下列氨基酸的pI值：丙氨酸、半胱氨酸、谷氨酸和精氨酸。[pI:6.02;5.02;3.22;10.76]解：pI=1/2（pKa1+pKa2）pI(Ala)=1/2（2.34+9.69）=6.02pI(Cys)=1/2（1.71+10.78）=5.02pI(Glu)=1/2（2.19+4.25）=3.22pI(Ala)=1/2（9.04+12.48）=10.766、向1L1mol/L的處于等電點(diǎn)的甘氨酸溶液參加0.3molHCl，問(wèn)所得溶液的pH是多少？倘若參加0.3molNaOH以代替HCl時(shí)，pH將是多少？[pH：2.71；9.23]7、將丙氨酸溶液（400ml）調(diào)節(jié)到pH8.0，然后向該溶液中參加過(guò)量的甲醛，當(dāng)所得溶液用堿反滴定至Ph8.0時(shí)，消耗0.2mol/LNaOH溶液250ml。問(wèn)起始溶液中丙氨酸的含量為多少克？[4.45g8、計(jì)算0.25mol/L的組氨酸溶液在pH6.4時(shí)各種離子形式的濃度（mol/L）。[His2+為1.78×10-4，His+為0.071，His0為2.8×10-4]9、說(shuō)明用含一個(gè)結(jié)晶水的固體組氨酸鹽酸鹽（相對(duì)分子質(zhì)量=209.6；咪唑基pKa=6.0）和1mol/LKOH配制1LpH6.5的0.2mol/L組氨酸鹽緩沖液的主意[取組氨酸鹽酸鹽41.92g(0.2mol)，參加352ml1mol/LKOH，用水稀釋至1L10、為什么氨基酸的茚三酮反映液能用測(cè)壓法定量氨基酸？解：茚三酮在弱酸性溶液中與α-氨基酸共熱，引起氨基酸氧化脫氨脫羧反映，（其反應(yīng)化學(xué)式見(jiàn)P139），其中，定量釋放的CO2可用測(cè)壓法測(cè)量，從而計(jì)算出參加反應(yīng)的氨基酸量。11、L-亮氨酸溶液（3.0g/50ml6mol/LHCl）在20cm旋光管中測(cè)得的旋光度為+1.81o。計(jì)算L-亮氨酸在6mol/LHCl中的比旋（[a]）。[[a]=+15.112、標(biāo)出異亮氨酸的4個(gè)光學(xué)異構(gòu)體的（R，S）構(gòu)型名稱。[參考圖3-15]13、甘氨酸在溶劑A中的溶解度為在溶劑B中的4倍，苯丙氨酸在溶劑A中的溶解度為溶劑B中的兩倍。利用在溶劑A和B之間的逆流分溶主意將甘氨酸和苯丙氨酸分開(kāi)。在起始溶液中甘氨酸含量為100mg，苯丙氨酸為81mg，試回答下列問(wèn)題：(1)利用由4個(gè)分溶管組成的逆流分溶系統(tǒng)時(shí)，甘氨酸和苯丙氨酸各在哪一號(hào)分溶管中含量最高？（2）在這樣的管中每種氨基酸各為多少毫克？[（1）第4管和第3管；（2）51.2mgGly+24mgPhe和38.4mgGly+36mgPhe]解：按照逆流分溶原理，可得：對(duì)于Gly：Kd=CA/CB=4=q(動(dòng)相)/p（靜相）p+q=1=(1/5+4/5)4個(gè)分溶管分溶3次：（1/5+4/5）3=1/125+2/125+48/125+64/125對(duì)于Phe：Kd=CA/CB=2=q(動(dòng)相)/p（靜相）p+q=1=(1/3+2/3)4個(gè)分溶管分溶3次：（1/3+2/3）3=1/27+6/27+12/27+8/27故利用4個(gè)分溶管組成的分溶系統(tǒng)中，甘氨酸和苯丙氨酸各在4管和第3管中含量最高，其中：第4管：Gly：64/125×100=51.2mgPhe：8/27×81=24mg第3管：Gly：48/125×100=38.4mgPhe：12/27×81=36mg14、指出在正丁醇：醋酸：水的系統(tǒng)中舉行紙層析時(shí)，下列混合物中氨基酸的相對(duì)遷移率（假定水相的pH為4.5）：(1)Ile,Lys;(2)Phe,Ser(3)Ala,Val,Leu;(4)Pro,Val(5)Glu,Asp;(6)Tyr,Ala,Ser,His.[Ile>lys；Phe,>Ser；Leu>Val>Ala,；Val>Pro；Glu>Asp；Tyr>Ala>Ser≌His]解：按照P151圖3-25可得結(jié)果。15．將含有天冬氨酸(pI=2.98)、甘氨酸(pI=5.97)、亮氨酸(pI=6.53)和賴氨酸(pI=5.98)的檸檬酸緩沖液，加到預(yù)先同樣緩沖液平衡過(guò)的強(qiáng)陽(yáng)離交換樹(shù)脂中，隨后用愛(ài)緩沖液析脫此柱，并分離收集洗出液，這5種氨基酸將按什么次序洗脫下來(lái)？[Asp,Thr,Gly,Leu,Lys]解：在pH3左右，氨基酸與陽(yáng)離子交換樹(shù)脂之間的靜電吸引的大小次序是減刑氨基酸(A2+)>中性氨基酸(A+)>酸性氨基酸(A0)。因此氨基酸的洗出順序大體上是酸性氨基酸、中性氨基酸，最后是堿性氨基酸，因?yàn)榘被岷蜆?shù)脂之間還存在疏水互相作用，所以其洗脫順序?yàn)椋篈sp,Thr,Gly,Leu,Lys。第四章蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)構(gòu)提要蛋白質(zhì)分子是由一條或多條肽鏈構(gòu)成的生物大分子。多肽鏈?zhǔn)怯砂被嵬ㄟ^(guò)肽鍵共價(jià)銜接而成的，各種多肽鏈都有自己特定的氨基酸序列。蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量介于6000到或更高。蛋白質(zhì)分為兩大類：?jiǎn)渭兊鞍踪|(zhì)和綴合蛋白質(zhì)。按照分子形狀可分為纖維狀蛋白質(zhì)、球狀蛋白質(zhì)和膜蛋白質(zhì)。此外還可按蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能分類。為了表示蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的不同組織層次，常常使用一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和四級(jí)結(jié)構(gòu)這樣一些專門術(shù)語(yǔ)。一級(jí)結(jié)構(gòu)就是共價(jià)主鏈的氨基酸序列，偶爾也稱化學(xué)結(jié)構(gòu)。二、三和四級(jí)結(jié)構(gòu)又稱空間結(jié)構(gòu)（即三維結(jié)構(gòu)）或高級(jí)結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的生物功能決定于它的高級(jí)結(jié)構(gòu)，高級(jí)結(jié)構(gòu)是由一級(jí)結(jié)構(gòu)即氨基酸序列決定的，二氨基酸序列是由遺傳物質(zhì)DNA的核苷酸序列規(guī)定的。肽鍵（CO—NH）是銜接多肽鏈主鏈中氨基酸殘破的共價(jià)鍵，二硫鍵是使多肽鏈之間交聯(lián)或使多肽鏈成環(huán)的共價(jià)鍵。多肽鏈或蛋白質(zhì)當(dāng)發(fā)生部分水解時(shí)，可形成長(zhǎng)短不一的肽段。除部分水解可以產(chǎn)生小肽之外，生物界還存在許多游離的小肽，如谷胱甘肽等。小肽晶體的熔點(diǎn)都很高，這說(shuō)明短肽的晶體是離子晶格、在水溶液中也是以偶極離子存在的。測(cè)定蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的策略是：（1）測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈數(shù)目；（2）拆分蛋白質(zhì)分子的多肽鏈；（3）斷開(kāi)多肽鏈內(nèi)的二硫橋；（4）分析每一多肽鏈的氨基酸組成；（5）鑒定多肽鏈的N-末端和C-末端殘基；（6）斷裂多肽鏈成較小的肽段，并將它們分離開(kāi)來(lái)；（7）測(cè)定各肽段的氨基酸序列；（8）利用重疊肽重建殘破多肽鏈的一級(jí)結(jié)構(gòu)；（9）決定半胱氨酸殘基形成的S-S交聯(lián)橋的位置。序列分析中的重要主意和技術(shù)有：測(cè)定N-末端基的苯異硫氰酸酯（PITC）法，分析C-末端基的羧肽酶法，用于多肽鏈局部斷裂的酶裂解和CNBr化學(xué)裂解，斷裂二硫橋的巰基乙醇處理，測(cè)定肽段氨基酸序列的Edman化學(xué)降解和電噴射串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，重建多肽鏈一級(jí)序列的重疊肽拼湊法以及用于二硫橋定位的對(duì)角線電泳等。在不同生物體中行使相同或相似功能的蛋白質(zhì)稱同源蛋白質(zhì)。同源蛋白質(zhì)具有顯然的序列相似性(稱序列同源),兩個(gè)物種的同源蛋白質(zhì)，其序列間的氨基酸差異數(shù)目與這些物種間的系統(tǒng)發(fā)生差異是成比例的。并按照同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列資料建立起進(jìn)化樹(shù)。同源蛋白質(zhì)具有共同的進(jìn)化起源。在生物體內(nèi)有些蛋白質(zhì)常以前體形試合成，惟獨(dú)按一定方式裂解除去部分肽鏈之后才浮上生物活性，這一現(xiàn)象稱蛋白質(zhì)的激活。血液凝結(jié)是涉及氨基酸序列斷裂的一系列酶原被激活的結(jié)果，酶促激活的級(jí)聯(lián)放大，使血凝塊疾馳形成成為可能。凝血酶原和血清蛋白原是兩個(gè)最重要的血凝因子。血纖蛋白蛋白原在凝血酶的作用下改變?yōu)檠宓鞍啄龎K（血塊的主要成分）。我國(guó)在20世紀(jì)60年代首次在世界上人工合成了蛋白質(zhì)——結(jié)晶牛胰島素。近二、三十年發(fā)展起來(lái)的固相肽合成是控制合成技術(shù)上的一個(gè)龐大長(zhǎng)進(jìn)，它對(duì)分子生物學(xué)和基因工程也就具有重要影響和意義。至今利用Merrifield固相肽合成儀已勝利地合成了許多肽和蛋白質(zhì)。習(xí)題1.倘若一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為12000的蛋白質(zhì)，含10種氨基酸，并假設(shè)每種氨基酸在該蛋白質(zhì)分子中的數(shù)目相等，問(wèn)這種蛋白質(zhì)有多少種可能的羅列順序？[10100]解：/120=101002、有一個(gè)A肽，經(jīng)酸解分析得知為L(zhǎng)ys、His、Asp、Glu2、Ala以及Val、Tyr驟然兩個(gè)NH3分子組成。當(dāng)A肽與FDNB試劑反應(yīng)后得DNP-Asp；當(dāng)用羧肽酶處理后得游離纈氨酸。倘若我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中將A肽用胰蛋白酶降解時(shí)，得到兩種肽，其中一種（Lys、Asp、Glu、Ala、Tyr）在pH6.4時(shí)，凈電荷為零，另一種（His、Glu以及Val）可給除DNP-His，在pH6.4時(shí)，帶正電荷。此外，A肽用糜蛋白酶降解時(shí)，也得到兩種肽，其中一種（Asp、Ala、Tyr）在pH6.4時(shí)全中性，另一種（Lys、His、Glu2以及Val）在pH6.4時(shí)帶正電荷。問(wèn)A肽的氨基酸序列如何？[Asn-Ala-Tyr-Glu-Lys-His-Gln-Val]解：1、N-末端分析：FDNB法得：Asp-；2、C-末端分析：羧肽酶法得：-Val；3、胰蛋白酶只斷裂賴氨酸或精氨酸殘基的羧基形成的肽鍵，得到的是以Arg和Lys為C-末端殘基的肽斷。酸水解使Asn→Asp+NH4+，由已知條件（Lys、Asp、Glu、Ala、Tyr）可得：Asn-()-()-()-Lys-()-()-Val；4、FDNB法分析N-末端得DNP-His，酸水解使Gln→Glu+NH4+由已知條件（His、Glu、Val）可得：Asn-()-()-()-Lys-His-Gln-Val；5、糜蛋白酶斷裂Phe、Trp和Tyr等疏水氨基酸殘基的羧基端肽鍵。由題，得到的一條肽（Asp、Ala、Tyr）結(jié)合（3）、（4）可得該肽的氨基酸序列為：Asn-Ala-Tyr-Glu-Lys-His-Gln-Val3、某多肽的氨基酸序列如下：Glu-Val-Lys-Asn-Cys-Phe-Arg-Trp-Asp-Leu-Gly-Ser-Leu-Glu-Ala-Thr-Cys-Arg-His-Met-Asp-Gln-Cys-Tyr-Pro-Gly-Glu_Glu-Lys。（1）如用胰蛋白酶處理，此多肽將產(chǎn)生幾個(gè)肽？并解釋緣故（假設(shè)沒(méi)有二硫鍵存在）；（2）在pH7.5時(shí)，此多肽的凈電荷是多少單位？說(shuō)明理由（假設(shè)pKa值：α-COOH4.0；α-NH3+6.0；Glu和Asp側(cè)鏈基4.0；Lys和Arg側(cè)鏈基11.0；His側(cè)鏈基7.5；Cys側(cè)鏈基9.0；Tyr側(cè)鏈基11.0）；（3）如何判斷此多肽是否含有二硫鍵？倘若有二硫鍵存在，請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)決定5，17和23位上的Cys哪兩個(gè)參加形成？[（1）4個(gè)肽；（2）-2.5單位；（3）倘若多肽中無(wú)二硫鍵存在，經(jīng)胰蛋白酶水解后應(yīng)得4個(gè)肽段；倘若存在一個(gè)二硫鍵應(yīng)得3個(gè)肽段并且個(gè)肽段所帶電荷不同，因此可用離子交換層析、電泳等主意將肽段分開(kāi)，鑒定出含二硫鍵的肽段，測(cè)定其氨基酸順序，便可決定二硫鍵的位置]4、今有一個(gè)七肽，經(jīng)分析它的氨基酸組成是：Lys、Pro、Arg、Phe、Ala、Tyr和Ser。此肽未經(jīng)糜蛋白酶處理時(shí)，與FDNB反應(yīng)不產(chǎn)生α-DNP-氨基酸。經(jīng)糜蛋白酶作用后，此肽斷裂城兩個(gè)肽段，其氨基酸組成分離為Ala、Tyr、Ser和Pro、Phe、Lys、Arg。這兩個(gè)肽段分離與FDNB反應(yīng)，可分離產(chǎn)生DNP-Ser和DNP-Lys。此肽與胰蛋白酶反應(yīng)能生成兩個(gè)肽段，它們的氨基酸組成分離是Arg、Pro和Phe、Tyr、Lys、Ser、Ala。試問(wèn)此七肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)怎樣？[它是一個(gè)環(huán)肽，序列為：-Phe-Ser-Ala-Tyr-Lys-Pro-Arg-]解：（1）此肽未經(jīng)糜蛋白酶處理時(shí)，與FDNB反應(yīng)不產(chǎn)生α-DNP-氨基酸，說(shuō)明此肽不含游離末端NH2，即此肽為一環(huán)肽；（2）糜蛋白酶斷裂Phe、Trp和Tyr等疏水氨基酸殘基的羧基端肽鍵，由已知兩肽段氨基酸組成（Ala、Tyr、Ser和Pro、Phe、Lys、Arg）可得：-()-()-Tyr-和-()-()-()-Phe-；（3）由（2）得的兩肽段分離與FDNB反應(yīng)，分離產(chǎn)生DNP-Ser和DNP-Lys可知該兩肽段的N-末端分離為-Ser-和-Lys-，結(jié)合（2）可得：-Ser-Ala-Tyr-和-Lys-()-()-Phe-；（4）胰蛋白酶專一斷裂Arg或Lys殘基的羧基參加形成的肽鍵，由題生成的兩肽段氨基酸組成（Arg、Pro和Phe、Tyr、Lys、Ser、Ala）可得：-Pro-Arg-和-()-()-()-()-Lys；綜合（2）、（3）、（4）可得此肽一級(jí)結(jié)構(gòu)為：-Lys-Pro-Arg-Phe-Ser-Ala-Tyr-5、三肽Lys-Lys-Lys的pI值必然大于它的任何一個(gè)個(gè)別基團(tuán)的pKa值，這種說(shuō)法是否準(zhǔn)確？為什么？[準(zhǔn)確，因?yàn)榇巳奶幱诘入婞c(diǎn)時(shí)，七解離集團(tuán)所處的狀態(tài)是C-末端COO-（pKa=3.0），N末端NH2（pKa≌8.0），3個(gè)側(cè)鏈3（1/3ε-NH3+）（pKa=10.53）(pKa=10.53),因此pI>最大的pKa值（10.53）]6、一個(gè)多肽可還原為兩個(gè)肽段，它們的序列如下：鏈1為Ala-Cys-Phe-Pro-Lys-Arg-Trp-Cys-Arg-Arg-Val-Cys；鏈2為Cys-Tyr-Cys-Phe-Cys。當(dāng)用嗜熱菌蛋白酶消化原多肽（具有殘破的二硫鍵）時(shí)可用下列各肽：（1）（Ala、Cys2、Val）；（2）（Arg、Lys、Phe、Pro）；（3）(Arg2、Cys2、Trp、Tyr)；（4）(Cys2、Phe)。試指出在該天然多肽中二硫鍵的位置。（結(jié)構(gòu)如下圖）S-SAla-Cys-Phe-Pro-Lys-Arg-Trp-Cys-Arg-Arg-Val_CysSSCys-Tyr-Cys-Phe-Cys解：嗜熱菌蛋白酶作用專一性較差，按照題中已知條件：（1）消化原多肽得到（Ala、Cys2、Val），說(shuō)明鏈1在2位Cys后及11位Val前發(fā)生斷裂，2位Cys與12位Cys之間有二硫鍵；（2）由鏈1序列可得該肽段序列為：-Phe-Pro-Lys-Arg-；（3）由（1）（2）可知該肽段(Arg2、Cys2、Trp、Tyr)中必有一Cys來(lái)自鏈2，另一Cys為鏈1中8位Cys，即鏈1中8位Cys與鏈2中的一個(gè)Cys有二硫鍵；（4）嗜熱菌蛋白酶能水解Tyr、Phe等疏水氨基酸殘基，故此肽（Cys2、Phe）來(lái)自鏈2，結(jié)合（3）中含Tyr，可知（3）中形成的二硫鍵為鏈18位Cys與鏈2中3位Cys與鏈2中3位Cys之間；（4）中（Cys2、Phe）說(shuō)明鏈2中1位Cys與5位Cys中有二硫鍵。綜合（1）、（2）、（3）、（4）可得結(jié)果。7、一個(gè)十肽的氨基酸分析表明其水解液中存在下列產(chǎn)物：NH4+AspGluTyrArgMetProLysSerPhe并看見(jiàn)下列事實(shí)：（1）用羧肽酶A和B處理該十肽無(wú)效；（2）胰蛋白酶處理產(chǎn)生兩各四肽和游離的Lys；（3）梭菌蛋白酶處理產(chǎn)生一個(gè)四肽和一個(gè)六肽；（4）溴化氫處理產(chǎn)生一個(gè)八肽和一個(gè)二肽，用單字母符號(hào)表示其序列位NP；（5）胰凝乳蛋白酶處理產(chǎn)生兩個(gè)三肽和一個(gè)四肽，N-末端的胰凝乳蛋白酶水解肽段在中性pH時(shí)攜帶-1凈電荷，在pH12時(shí)攜帶-3凈電荷；（6）一輪Edman降解給出下面的PTH衍生物：（圖略）寫出該十肽的氨基酸序列。[Ser-Glu-Tyr-Arg-Lys-Lys-Phe-Met-Asn-Pro]解：（1）用羧肽酶A和B處理十肽無(wú)效說(shuō)明該十肽C-末端殘基為-Pro；（2）胰蛋白酶專一斷裂Lys或Arg殘基的羧基參加形成的肽鍵，該十肽在胰蛋白酶處理后產(chǎn)生了兩個(gè)四肽和有利的Lys，說(shuō)明十肽中含Lys-…或-Arg-…-Lys-Lys-…或-Arg-Lys-…-Lys-…Arg-Lys-…四種可能的肽段，且水解位置在4與5、5與6或4與5、8與9、9與10之間；（3）梭菌蛋白酶專一裂解Arg殘基的羧基端肽鍵，處理該十肽后，產(chǎn)生一個(gè)四肽和一個(gè)六肽，則可知該十肽第四位為-Arg-；（4）溴化氰只斷裂由Met殘基的羧基參加形成的肽鍵，處理該十肽后產(chǎn)生一個(gè)八肽和一個(gè)二肽，說(shuō)明該十肽第八位或第二位為-Met-；用單字母表示二肽為NP，即-Asn-Pro-，故該十肽第八位為-Met-；（5）胰凝乳蛋白酶斷裂Phe、Trp和Tyr等疏水氨基酸殘基的羧基端肽鍵，處理該十肽后，產(chǎn)生兩個(gè)三肽和一個(gè)四肽，說(shuō)明該十肽第三位、第六位或第七位為Trp或Phe；（6）一輪Edman降解分析N-末端，按照其反應(yīng)邏輯，可得N-末端氨基酸殘疾結(jié)構(gòu)式為：-NH-CH(-CH2OH)-C(=O)-，還原為-NH-CH(-CH2OH)-COOH-，可知此為Ser；結(jié)合（1）、（2）、（3）、（4）、（5）、（6）可知該十肽的氨基酸序列為：Ser-Glu-Tyr-Arg-Lys-Lys-Phe-Met-Asn-Pro8、一個(gè)四肽，經(jīng)胰蛋白酶水解得兩個(gè)片段，一個(gè)片段在280nm附近有強(qiáng)的光吸收，并且Pauly反應(yīng)和坂口反應(yīng)（檢測(cè)胍基的）呈陽(yáng)性。另一片段用溴化氰處理釋放出一個(gè)與茚三酮反應(yīng)呈黃色的氨基酸。寫出此四肽的氨基酸序列。[YRMP]解：胰蛋白酶酶專一水解Lys和Arg殘基的羧基參加形成的肽鍵，故該四肽中含Lys或Arg；一肽段在280nm附近有強(qiáng)光吸收且Pauly反應(yīng)和坂口反應(yīng)（檢測(cè)胍基的）呈陽(yáng)性，說(shuō)明該肽段含Tyr和Arg；溴化氰專一斷裂Met殘基的羧基參加形成的肽鍵，又因生成了與茚三酮反應(yīng)呈黃色的氨基酸，故該肽段為-Met-Pro-；所以該四肽的氨基酸組成為Tyr-Arg-Met-Pro，即YRMP。9蜂毒明肽（apamin）是存在蜜蜂毒液中的一個(gè)十八肽，其序列為CNVRAPETALCARRCOOH，已知蜂毒明肽形成二硫鍵，不與碘乙酸發(fā)生反應(yīng)，（1）問(wèn)此肽中存在多少個(gè)二硫鍵？（2）請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)決定這些（個(gè)）二硫鍵位置的策略。[（1）兩個(gè)；（2）二硫鍵的位置可能是1-3和11-15或1-11和3-15或1-15和3-11，第一種情況，用胰蛋白酶斷裂將產(chǎn)生兩個(gè)肽加Arg；第二種情況和第三種，將產(chǎn)生一個(gè)肽加Arg，通過(guò)二硫鍵部分氧化可以把后兩種情況區(qū)別開(kāi)來(lái)。]10、講述用Mernfield固相化學(xué)主意合成二肽Lys-Ala。倘若你決定向Lys-Ala參加一個(gè)亮氨酸殘基使成三肽，可能會(huì)掉進(jìn)什么樣的“陷坑”？第五章蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)提要每一種蛋白質(zhì)至少都有一種構(gòu)像在生理?xiàng)l件下是穩(wěn)定的，并具有生物活性，這種構(gòu)像稱為蛋白質(zhì)的天然構(gòu)像。研究蛋白質(zhì)構(gòu)像的主要主意是X射線晶體結(jié)構(gòu)分析。此外紫外差光譜、熒光和熒光偏振、圓二色性、核磁共振和重氫交換等被用于研究溶液中的蛋白質(zhì)構(gòu)像。穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)像的作用有氫鍵、范德華力、疏水互相作用和離子鍵。此外二硫鍵在穩(wěn)定某些蛋白質(zhì)的構(gòu)像種也起重要作用。多肽鏈折疊成特定的構(gòu)像受到空間上的許多限制。就其主鏈而言，因?yàn)殡逆準(zhǔn)怯啥鄠€(gè)相鄰的肽平面構(gòu)成的，主鏈上惟獨(dú)α-碳的二平面角Φ和Ψ能自由旋轉(zhuǎn)，但也受到很大限制。某些Φ和Ψ值是立體化學(xué)所允許的，其他值則不被允許。并因此提出了拉氏構(gòu)像，它表明蛋白質(zhì)主鏈構(gòu)象在圖上所占的位置是很有限的（7.7%-20.3%）。蛋白質(zhì)主鏈的折疊形成由氫鍵維系的重復(fù)性結(jié)構(gòu)稱為二級(jí)結(jié)構(gòu)。最常見(jiàn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件有α螺旋、β轉(zhuǎn)角等。α螺旋是蛋白質(zhì)中最典型、含量最豐盛的二級(jí)結(jié)構(gòu)。α螺旋結(jié)構(gòu)中每個(gè)肽平面上的羰氧和酰氨氫都參加氫鍵的形成，因此這種構(gòu)象是相當(dāng)穩(wěn)定的。氫鍵大體上與螺旋軸平行，每圈螺旋占3.6個(gè)氨基酸殘基，每個(gè)殘基繞軸旋轉(zhuǎn)100°，螺距為0.54nm。α-角蛋白是毛、發(fā)、甲、蹄中的纖維狀蛋白質(zhì)，它幾乎徹低由α螺旋構(gòu)成的多肽鏈構(gòu)成。β折疊片中肽鏈主鏈處于較舒展的蜿蜒（鋸齒）形式，肽鏈之偶爾一條肽鏈的肽段之間借助氫鍵彼此銜接成片狀結(jié)構(gòu)，故稱為β折疊片，每條肽鏈或肽段稱為β折疊股或β股。肽鏈的走向可以有平行和反平行兩種形式。平行折疊片構(gòu)象的舒展程度略小于反平行折疊片，它們的重復(fù)周期分離為0.65nm和0.70nm。大多數(shù)β折疊股和β折疊片都有右手扭曲的傾向，以緩解側(cè)鏈之間的空間應(yīng)力（stericstrain）。蠶絲心蛋白幾乎徹低由扭曲的反平行β折疊片構(gòu)成。膠原蛋白是動(dòng)物結(jié)締組織中最豐盛的結(jié)構(gòu)蛋白，有若干原膠原分子組成。原膠原是一種右手超螺旋結(jié)構(gòu)，稱三股螺旋。彈性蛋白是結(jié)締組織中另一主要的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)按其形狀和溶解度可分為纖維狀蛋白質(zhì)、球狀蛋白質(zhì)和膜蛋白。α-角蛋白、絲心蛋白（β-角蛋白）、教員蛋白和彈性蛋白是不溶性纖維狀蛋白質(zhì)；肌球蛋白和原肌球蛋白是可溶性纖維狀蛋白質(zhì)，是肌纖維中最豐盛的蛋白質(zhì)。球狀蛋白質(zhì)是一類可溶性的功能蛋白，如酶、抗體、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、蛋白質(zhì)激素等，膜蛋白是一類與膜結(jié)構(gòu)和功能緊密相關(guān)的蛋白質(zhì)，它們又可分為膜內(nèi)在蛋白質(zhì)、脂錨定蛋白質(zhì)以及膜周邊蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)普通被分為4個(gè)組織層次（折疊層次），一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)。細(xì)分時(shí)可在二、三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)。細(xì)分時(shí)可在二、三級(jí)之間增強(qiáng)超二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域兩個(gè)層次。超二級(jí)結(jié)構(gòu)是指在一級(jí)序列上相鄰的二級(jí)結(jié)構(gòu)在三維折疊中彼此逼近并互相作用形成的組合體。超二級(jí)結(jié)構(gòu)有3中基本形式：αα（螺旋束）、βαβ（如Rossman折疊）、ββ（β蜿蜒和希臘鑰匙拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)）。結(jié)構(gòu)域是在二級(jí)結(jié)構(gòu)和超二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上形成并相對(duì)自立的三級(jí)結(jié)構(gòu)局部折疊區(qū)。結(jié)構(gòu)域常常也就是功能域。結(jié)構(gòu)域的基本類型有：全平行α螺旋結(jié)構(gòu)域、平行或混合型β折疊片結(jié)構(gòu)域、反平行β折疊片結(jié)構(gòu)域和富含金屬或二硫鍵結(jié)構(gòu)域等4類。球狀蛋白質(zhì)可按照它們的結(jié)構(gòu)分為全α-結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)、α、β-結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)、全β-結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)和富含金屬或二硫鍵蛋白質(zhì)等。球狀蛋白質(zhì)有些是單亞基的，稱單體蛋白質(zhì)，有些是多亞基的，稱寡聚或多聚蛋白質(zhì)。亞基普通是一條多胎鏈。亞基（包括單體蛋白質(zhì)）的總?cè)S結(jié)構(gòu)稱三級(jí)結(jié)構(gòu)。球狀蛋白質(zhì)種類無(wú)數(shù)，結(jié)構(gòu)也很復(fù)雜，各有自己獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)。但球狀蛋白質(zhì)分子仍有某些共同的結(jié)構(gòu)特征：①一種分子可含多種二級(jí)結(jié)構(gòu)元件，②具有顯然的折疊層次，③緊密折疊成球狀或橢球狀結(jié)構(gòu)，④疏水測(cè)鏈埋藏在分子內(nèi)部，親水基團(tuán)裸露在分子表面，⑤分子表面往往有一個(gè)空穴（活性部位）。蛋白質(zhì)受到某些物理或化學(xué)因素作用時(shí)，引起生物活性走失，溶解度降低以及其他的物理化學(xué)常數(shù)的改變，這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)變性。變性實(shí)質(zhì)是非共價(jià)鍵破碎，天然構(gòu)象解體，但共價(jià)鍵未遭破碎。有些變性是可逆的。蛋白質(zhì)變性和復(fù)性實(shí)驗(yàn)表明，一級(jí)結(jié)構(gòu)規(guī)定它的三維結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能是蛋白質(zhì)天然構(gòu)象所具有的性質(zhì)。天然構(gòu)象是在生理?xiàng)l件下熱力學(xué)上最穩(wěn)定的即自由能最低的三維結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)折疊不是通過(guò)隨機(jī)搜索找到自由能最低構(gòu)象的。折疊動(dòng)力學(xué)研究表明，多肽鏈折疊過(guò)程中存在熔球態(tài)的中間體，并有異構(gòu)酶和朋友蛋白質(zhì)等參加。寡聚蛋白是由兩個(gè)或多個(gè)亞基通過(guò)非共價(jià)互相作用締合而成的聚攏體。締合形成聚攏體的方式構(gòu)成蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)，它涉及亞級(jí)在聚攏體中的空間羅列（對(duì)稱性）以及亞基之間的接觸位點(diǎn)（結(jié)構(gòu)互補(bǔ)）和作使勁（非共價(jià)互相作用的類型）。習(xí)題1.（1）計(jì)算一個(gè)含有78個(gè)氨基酸的α螺旋的軸長(zhǎng)。（2）此多肽的α螺旋徹低舒展時(shí)多長(zhǎng)？[11.7nm；28.08nm]解：（1）α螺旋中每個(gè)殘基繞軸旋轉(zhuǎn)100°，沿軸升高0.15nm，故該α螺旋的軸長(zhǎng)為：78×0.15nm=11.7nm(2)α螺旋每圈螺旋占3.6個(gè)氨基酸殘基，故該α螺旋圈數(shù)為：78÷3.6圈；α螺旋的直徑約為0.5nm，故每圈軸長(zhǎng)為0.5πnm。徹低舒展的α螺旋長(zhǎng)度約為：0.5π×（78÷3.6）≌34.01nm。2.某一蛋白質(zhì)的多肽鏈除一些區(qū)段為α螺旋構(gòu)想外，其他區(qū)段均為β折疊片構(gòu)象。該蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為240000，多肽鏈外姓的長(zhǎng)度為5.06×10-5cm。試計(jì)算：α螺旋占該多肽鏈的百分?jǐn)?shù)。（假設(shè)β解：普通來(lái)講氨基酸的平均分子量為120Da，此蛋白質(zhì)的分子量為240000Da，所以氨基酸殘基數(shù)為240000÷120=2000個(gè)。設(shè)有X個(gè)氨基酸殘基呈α螺旋結(jié)構(gòu)，則：X·0.15+（2000-X）×0.35=5.06×10-5×107=506nm解之得X=970，α螺旋的長(zhǎng)度為970×0.15=145.5，故α-螺旋占該蛋白質(zhì)分子的百分比為：145.5/536×100%=29%3.固然在真空中氫鍵鍵能約為20kj/mol，但在折疊的蛋白質(zhì)中它對(duì)蛋白質(zhì)的桅頂焓貢獻(xiàn)卻要小得多（<5kj/mol）。試解釋這種差別的緣故。[在舒展的蛋白質(zhì)中大多數(shù)氫鍵的共體和接納體都與水形成氫鍵。折舊時(shí)氫鍵能量對(duì)穩(wěn)定焓貢獻(xiàn)小的緣故。]4.多聚甘氨酸是一個(gè)容易的多肽，能形成一個(gè)具有φ=-80°ψ=+120°的螺旋，按照拉氏構(gòu)象圖（圖5-13），描述該螺旋的（a）手性；（b）每圈的堿基數(shù)。[（a）左手；（b）3.0]解：據(jù)P206圖5-13拉氏構(gòu)象圖，=φ-80°ψ=+120°時(shí)可知該螺旋為左手性，每圈殘基數(shù)為3.0。5.α螺旋的穩(wěn)定性不僅取決于肽鏈間的氫鍵形成，而且還取決于肽鏈的氨基酸側(cè)鏈的性質(zhì)。試預(yù)測(cè)在室溫下的溶液中下列多聚氨基酸那些種將形成α螺旋，那些種形成其他的有規(guī)矩的結(jié)構(gòu)，那些種不能形成有規(guī)矩的結(jié)構(gòu)？并說(shuō)明理由。（1）多聚亮氨酸，pH=7.0；（2）多聚異亮氨酸，pH=7.0；（3）多聚精氨酸，pH=7.0；（4）多聚精氨酸，pH=13；（5）多聚谷氨酸，pH=1.5；（6）多聚蘇氨酸，pH=7.0；（7）多聚脯氨酸，pH=7.0；[（1）（4）和（5）能形成α螺旋；（2）（3）和（6）不能形成有規(guī)矩的結(jié)構(gòu)；（7）有規(guī)矩，但不是α螺旋]6.多聚甘氨酸的右手或左手α螺旋中哪一個(gè)比較穩(wěn)定？為什么？[因?yàn)楦拾彼崾窃讦?碳原子上呈對(duì)稱的異常氨基酸，因此可以預(yù)料多聚甘氨酸的左右手α螺旋（他們是對(duì)映體）在能量上是相當(dāng)?shù)?，因而也是同等穩(wěn)定的。]7.考慮一個(gè)小的含101殘基的蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)將有200個(gè)可旋轉(zhuǎn)的鍵。并假設(shè)對(duì)每個(gè)鍵φ和ψ有亮個(gè)定向。問(wèn)：（a）這個(gè)蛋白質(zhì)可能有多種隨機(jī)構(gòu)象（W）？（b）按照（a）的答案計(jì)算在當(dāng)使1mol該蛋白質(zhì)折疊成惟獨(dú)一種構(gòu)想的結(jié)構(gòu)時(shí)構(gòu)想熵的變化（ΔS折疊）；（c）倘若蛋白質(zhì)徹低折疊成由H鍵作為穩(wěn)定焓的唯一來(lái)源的α螺旋，并且每molH鍵對(duì)焓的貢獻(xiàn)為-5kj/mol，試計(jì)算ΔH折疊；（d）按照逆的（b）和（c）的答案，計(jì)算25℃時(shí)蛋白質(zhì)的ΔG折疊。該蛋白質(zhì)的折疊形式在25[（a）W=2200=1.61×1060；（b）ΔS折疊=1.15kj/（K·mol）（c）ΔH折疊100×（-5kj/mol）=-500kj/mol；注重，這里我們沒(méi)有考慮在螺旋末端處某些氫鍵不能形成這一事實(shí)，但考慮與否差別很小。（d）ΔG折疊=-157.3kj/mol.因?yàn)樵?5℃時(shí)ΔG折疊8.兩個(gè)多肽鏈A和B，有著相似的三級(jí)結(jié)構(gòu)。但是在正常情況下A是以單體相識(shí)存在的，而B(niǎo)是以四聚體（B4）形式存在的，問(wèn)A和B的氨基酸組成可能有什么差別。[在亞基-亞基互相作用中疏水互相作用常常起主要作用，參加四聚體B4的亞基-亞基互相作用的表面可能比單體A的對(duì)應(yīng)表面具有較多的疏水殘基。]9.下面的序列是一個(gè)球狀蛋白質(zhì)的一部分。利用表5-6中的數(shù)據(jù)和Chou-Faman的經(jīng)驗(yàn)規(guī)矩，預(yù)測(cè)此區(qū)域的二級(jí)結(jié)構(gòu)。RRPVVLMAACLRPVVFITYGDGGTYYHWYH[殘基4-11是一個(gè)α螺旋，殘基14-19和24-30是β折疊片。殘基20-23很可能形成β轉(zhuǎn)角]10.從熱力學(xué)考慮，徹低裸露在水環(huán)境中和徹低埋藏在蛋白質(zhì)分子非極性內(nèi)部的兩種多肽片段，哪一種更容易形成α螺旋？為什么？[埋藏在蛋白質(zhì)的非極性內(nèi)部時(shí)更容易形成α螺旋。因?yàn)樵谒h(huán)境中多肽對(duì)穩(wěn)定焓（ΔH折疊）的貢獻(xiàn)要小些。]11.一種酶相對(duì)分子質(zhì)量為300000，在酸性環(huán)境中可解理成兩個(gè)不同組分，其中一個(gè)組分的相對(duì)分子質(zhì)量為100000，另一個(gè)為50000。大的組分占總蛋白質(zhì)的三分之二，具有催化活性。用β-巰基乙醇（能還原二硫橋）處理時(shí)，大的失去催化能力，并且它的沉降速度減小，但沉降圖案上只展示一個(gè)峰（參見(jiàn)第7章）。關(guān)于該酶的結(jié)構(gòu)作出什么結(jié)論？[此酶含4個(gè)亞基，兩個(gè)無(wú)活性亞基的相對(duì)分子質(zhì)量為50000，兩個(gè)催化亞基的相對(duì)分子質(zhì)量為100000，每個(gè)催化亞基是由兩條無(wú)活性的多肽鏈（相對(duì)分子質(zhì)量為50000）組成。彼此間由二硫鍵交聯(lián)在一起。]12.今有一種植物的毒素蛋白，直接用SDS凝膠電泳分析（見(jiàn)第7章）時(shí)，它的區(qū)帶位于肌紅蛋白（相對(duì)分子質(zhì)量為16900）和β-乳球蛋白（相對(duì)分子質(zhì)量37100）良種蛋白之間，當(dāng)這個(gè)毒素蛋白用β-巰基乙醇和碘乙酸處理后，在SDS凝膠電泳中仍得到一條區(qū)帶，但其位置逼近標(biāo)記蛋白細(xì)胞素（相對(duì)分子質(zhì)量為13370），進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，該毒素蛋白與FDNB反應(yīng)并酸水解后，釋放出游離的DNP-Gly和DNP-Tyr。關(guān)于此蛋白的結(jié)構(gòu)，你能做出什么結(jié)論？[該毒素蛋白由兩條不同的多肽鏈通過(guò)鏈間二硫鍵交聯(lián)而成，每條多肽鏈的相對(duì)分子質(zhì)量各在13000左右。]13.一種蛋白質(zhì)是由相同亞基組成的四聚體。（a）對(duì)該分子說(shuō)出來(lái)年各種可能的對(duì)稱性。穩(wěn)定締合的是哪種類型的互相作用（同種或異種）？（b）假設(shè)四聚體，如血紅蛋白，是由兩個(gè)相同的單位（每個(gè)單位含α和β兩種鏈）組成的。問(wèn)它的最高對(duì)稱性是什么？[（a）C4和D2，C4是通過(guò)異種互相作用締合在一起，D2是通過(guò)同種互相作用締合在一起，（b）C2因?yàn)槊總€(gè)αβ二聚體是一個(gè)不對(duì)稱的原聚體]14.證實(shí)一個(gè)多階段裝配過(guò)程比一個(gè)單階段裝配過(guò)程更容易控制蛋白質(zhì)的質(zhì)量?？紤]一個(gè)多聚體酶復(fù)合物的合成，此復(fù)合物含6個(gè)相同的二聚體，每個(gè)二聚體由一個(gè)多肽A和一個(gè)B組成，多肽A和B的長(zhǎng)度分離為300個(gè)和700個(gè)氨基酸殘基。假設(shè)從氨基酸合成多肽鏈，多肽鏈組成二聚體，再?gòu)亩垠w聚攏成多聚體酶，在這一建造過(guò)程中每次操作的錯(cuò)誤頻率為10-8，假設(shè)氨基酸序列沒(méi)有錯(cuò)誤的話，多肽的折疊總是準(zhǔn)確的，并假設(shè)在每一裝配階段剔除有缺陷的亞結(jié)構(gòu)效率為100%，試比較在下列情況下有缺陷復(fù)合物的頻率：（1）該復(fù)合物以一條6000個(gè)氨基酸延續(xù)的多肽鏈一步合成，鏈內(nèi)含有6個(gè)多肽A和6個(gè)多肽B。（2）該復(fù)合物分3個(gè)階段形成：第一階段，多肽A和B的合成；第二階段，AB二聚體的形成；第三階段，6個(gè)AB二聚體裝配成復(fù)合物。[（1）有缺陷復(fù)合物的平均頻率是6000×10-8=6×10-5][（2）因?yàn)橛腥毕莸亩垠w可被剔除，因此有缺陷復(fù)合物的平均率只是最后階段的操作次數(shù)（5此操作裝配6個(gè)亞基）乘以錯(cuò)誤頻率，即：5×10-8。因此它比一步合成所產(chǎn)生的缺陷頻率約低1000倍。]第六章蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系提要肌紅蛋白（Mb）和血紅蛋白（Hb）是脊椎動(dòng)物中的載氧蛋白質(zhì)。肌紅蛋白便于氧在肌肉中轉(zhuǎn)運(yùn)，并作為氧的可逆性貯庫(kù)。而血紅蛋白是血液中的氧載體。這些蛋白質(zhì)含有一個(gè)結(jié)合得很緊的血紅素輔基。它是一個(gè)取代的卟啉，在其中央有一個(gè)鐵原子。亞鐵（Fe2+）態(tài)的血紅素能結(jié)合氧，但高鐵（+3）態(tài)的不能結(jié)合氧。紅血素中的鐵原子還能結(jié)合其他小分子如CO、NO等。肌紅蛋白是一個(gè)單一的多肽鏈，含153個(gè)殘基，形狀緊湊。Mb內(nèi)部幾乎都是非極性殘基。多肽鏈中約75%是α螺旋，共分八個(gè)螺旋段。一個(gè)亞鐵血紅素即位于疏水的空穴內(nèi)，它可以保護(hù)鐵不被氧化成高鐵。血紅素鐵離子直接與一個(gè)His側(cè)鏈的氮原子結(jié)合。此近側(cè)His（H8）占領(lǐng)5個(gè)配位位置。第6個(gè)配位位置是O2的結(jié)合部位。在此附近的遠(yuǎn)側(cè)His（E7）降低在氧結(jié)合部位上CO的結(jié)合，并抑制血紅素氧化或高鐵態(tài)。氧與Mb結(jié)合是可逆的。對(duì)單體蛋白質(zhì)如Mb來(lái)說(shuō)，被配體（如）O2占領(lǐng)的結(jié)合部位的分?jǐn)?shù)是配體濃度的雙曲線函數(shù)，如Mb的氧集合曲線。血紅蛋白由4個(gè)亞基（多肽鏈）組成，每個(gè)亞基都有一個(gè)血紅素基。HbA是成人中主要的血紅蛋白，具有α2β2的亞基結(jié)構(gòu)。四聚體血紅蛋白中浮上了單體血紅蛋白所不具有的新性質(zhì)，Hb除運(yùn)載氧外還能轉(zhuǎn)運(yùn)H+和CO2。血紅蛋白以兩種可以互相轉(zhuǎn)化的構(gòu)象態(tài)存在，稱T（緊張）和R（松弛）態(tài)。T態(tài)是通過(guò)幾個(gè)鹽橋穩(wěn)定的。無(wú)氧結(jié)合時(shí)達(dá)到最穩(wěn)定。氧的結(jié)合促進(jìn)T態(tài)改變?yōu)镽態(tài)。氧與血紅蛋白的結(jié)合是別構(gòu)結(jié)合行為的一個(gè)典型例證。T態(tài)和R態(tài)之間的構(gòu)象變化是由亞基-亞基互相作用所介導(dǎo)的，它導(dǎo)致血紅蛋白浮上別構(gòu)現(xiàn)象。Hb展示3種別構(gòu)效應(yīng)。第一，血紅蛋白的氧結(jié)合曲線是S形的，這以為著氧的結(jié)合是協(xié)同性的。氧與一個(gè)血紅素結(jié)合有助于氧與同一分子中的其他血紅素結(jié)合。第二，H+和CO2促進(jìn)O2從血紅蛋白中釋放，這是生理上的一個(gè)重要效應(yīng)，它提高O2在代謝活躍的組織如肌肉的釋放。相反的，O2促進(jìn)H+和CO2在肺泡毛細(xì)血管中的釋放。H+、CO2和O2的結(jié)合之間的別構(gòu)聯(lián)系稱為Bohr效應(yīng)。第三，血紅蛋白對(duì)O2的親和力還受2、3-二磷酸甘油酸（BPG）調(diào)節(jié)，BPG是一個(gè)負(fù)電荷密度很高的小分子。BPG能與去氧血紅蛋白結(jié)合，但不能與氧合血紅蛋白結(jié)合。因此，BPG是降低血紅蛋白對(duì)氧的親和力的。胎兒血紅蛋白（α2β2）比成年人的血紅蛋白（α2β2）有較高的氧親和力，就是因?yàn)樗Y(jié)合BPG較少。導(dǎo)致一個(gè)蛋白質(zhì)中氨基酸改變的基因突變能產(chǎn)生所謂分子病，這是一種遺傳病。了解最清晰的分子病是鐮刀狀細(xì)胞貧血病。這種病人的步正常血紅蛋白稱為HbS，它只是在兩條β鏈第六位置上的Glu倍置換乘Val。這一改變?cè)谘t蛋白表面上產(chǎn)生一個(gè)疏水小區(qū)，因而導(dǎo)致血紅蛋白聚攏成不溶性的纖維束，并引起紅細(xì)胞鐮刀狀化和輸氧能力降低。純合子的病人浮上慢性貧血而死亡。地中海貧血是因?yàn)槿笔б粋€(gè)或多個(gè)編碼血紅蛋白鏈的基因造成的。棉衣反映是由特化的白細(xì)胞——淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞及其相關(guān)的蛋白質(zhì)之間的互相作用介導(dǎo)的。T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生T細(xì)胞受體，B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白，即抗體。所有的細(xì)胞都能產(chǎn)生MHC蛋白，它們?cè)诩?xì)胞表面展示宿主（自我）肽或抗原（非自我）肽。助T細(xì)胞誘導(dǎo)那些產(chǎn)生免疫球蛋白的B細(xì)胞和產(chǎn)生T細(xì)胞受體的胞毒T細(xì)胞增殖。免疫球蛋白或T細(xì)胞受體能與特異的抗原結(jié)合。一個(gè)特定的祖先細(xì)胞通過(guò)刺激繁殖，產(chǎn)生一個(gè)具有同樣免疫能力的細(xì)胞群的過(guò)程稱為克隆挑選。人類具有5個(gè)類別的免疫球蛋白，每一類別的生物學(xué)功能都是不同的。最豐盛的是IgG類，它由4條多肽鏈組成，兩條重鏈，兩條輕鏈，通過(guò)二硫鍵銜接成Y形結(jié)構(gòu)的分子。逼近Y的兩“臂”頂端的結(jié)構(gòu)域是多變區(qū)，形成來(lái)年各個(gè)抗原結(jié)合部位。一個(gè)給頂?shù)拿庖咔虻鞍灼胀ㄖ唤Y(jié)合一個(gè)大抗原分子的一部分，稱為表位。結(jié)合常常涉及IgG的構(gòu)象變化，以便域抗原誘導(dǎo)契合。因?yàn)榭贵w容易制取并具有高度特異性，它成為許多分析和制備生化主意的核心，如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）、Western印跡和單克隆抗體技術(shù)等都得到廣泛應(yīng)用。在發(fā)動(dòng)機(jī)蛋白質(zhì)中蛋白質(zhì)-配體互相作用上空間和時(shí)光的組織達(dá)到相當(dāng)完美的程度。肌肉收縮是因?yàn)榧∏虻鞍缀图?dòng)蛋白“精心安頓”的互相作用的結(jié)果。肌球蛋白是由纖維狀的尾和球狀的頭組成的棒狀分子，在肌肉中倍組織成粗絲。G-肌動(dòng)蛋白是一種單體，由它聚攏成纖維狀的F-肌動(dòng)蛋白，后者是細(xì)絲的主體。由粗絲和細(xì)絲構(gòu)成肌肉收縮單位——肌節(jié)。肌球蛋白上的ATP水解與肌球蛋白頭片的系列構(gòu)象變化相偶聯(lián)，引起肌球蛋白頭從F-肌動(dòng)蛋白亞基上解離并與細(xì)絲前方的另一F-肌動(dòng)蛋白亞基再結(jié)合。因此肌球蛋白沿肌動(dòng)蛋白細(xì)絲滑動(dòng)。肌肉收縮受從肌質(zhì)網(wǎng)釋放的Ga2+刺激。Ga2+與肌鈣蛋白結(jié)合導(dǎo)致肌鈣蛋白-原肌球蛋白復(fù)合體的構(gòu)象變化，引發(fā)肌動(dòng)蛋白-肌球蛋白0互相作用的循環(huán)發(fā)生。習(xí)題1.蛋白質(zhì)A和B各有一個(gè)配體X的結(jié)合部位，前者的解離常數(shù)Kd為10-6mol/L。（a）哪個(gè)蛋白質(zhì)對(duì)配體X的親和力更高？（b）將這兩個(gè)蛋白質(zhì)的Kd轉(zhuǎn)換為結(jié)合常數(shù)Ka。[（a）蛋白質(zhì)B；（b）蛋白質(zhì)A的Ka=106(mol/L)-1，蛋白質(zhì)B的Ka=10-9(mol/L)-12.下列變化對(duì)肌紅蛋白和血紅蛋白的O2親和力有什么影響？（a）血漿的pH從7.4降到7.2；（b）肺中CO2分壓從45torr（屏息）降到15torr（正常）；（c）BPG水平從4.5mmol/L（海平面）增至7.5mmol（高空）。[對(duì)肌紅蛋白：（a）無(wú)；（b）無(wú)；（c）無(wú)。對(duì)血紅蛋白：（a）降低；（b）增強(qiáng)；（c）降低]3.在37℃，pH7.4，CO2p（O2）%飽和度（=100×Y）10.61019.53027.45037.57050.48577.39692.398（a）按照這些數(shù)據(jù)，繪制氧結(jié)合曲線；估算在（1）100torrp（O2）(肺中)和（2）30torrp（O2）（靜脈血中）下血的氧百分飽和度。（b）肺中[100torrp（O2）]結(jié)合的氧有百分之多少輸送給組織[30torrp（O2）]？（c）倘若在毛細(xì)血管中pH降到7.0，利用圖6-17數(shù)據(jù)重新估算（b）部分。[（a）（1）98%，（2）58%；（b）約40%；（c）約50%]解：（a）圖略，從圖中克知分離為98%和58%；（b）98%-58%=40%，故約40%；（c）當(dāng)pH降到7.0時(shí)，據(jù)圖6-17可知：96%-46%=50%。4.倘若已知P50和n，可利用方程（6-15）Y/（1-Y）=[p（O2）/P50]n計(jì)算Y（血紅蛋白氧分?jǐn)?shù)飽和度）。設(shè)P50=26torr，n=2.8，計(jì)算肺（這里p（O2）=100torr）中的Y和毛細(xì)血管（這里p（O2）=40torr）中的Y。在這些條件下輸氧效率（Y肺-Y毛細(xì)血管=ΔY）是多少？除n=1.0外，重復(fù)上面計(jì)算。比較n=2.8和n=1.0時(shí)的ΔY值。并說(shuō)出協(xié)同氧結(jié)合對(duì)血紅蛋白輸氧效率的影響。[n=2.8時(shí)，Y肺=0.98，Y毛細(xì)血管=0.77，所以，ΔY=0.21，n=1.0時(shí)，Y肺=0.79，Y毛細(xì)血管=0.61，所以，ΔY=0.18，兩ΔY之差0.21-0.18=0.03，差值似乎不大，但在代謝活躍的組織中p（O2）<40torr，因此潛在輸氧效率不小，參見(jiàn)圖6-15]解：Y肺/（1-Y肺）=[100/26]2.8Y肺=0.98Y毛/（1-Y毛）=[40/26]2.8Y毛=0.77ΔY=0.98-0.77=0.21當(dāng)n=1.0時(shí)，同理，Y肺=0.79Y毛=0.61ΔY=0.185.倘若不采取措施，儲(chǔ)藏相當(dāng)初光的血，2.3-BPG的含量會(huì)下降。倘若這樣的血用于輸血可能會(huì)產(chǎn)生什么后果？[儲(chǔ)藏過(guò)時(shí)的紅血球經(jīng)酵解途徑代謝BPG。BPG濃度下降，Hb對(duì)O2的親和力增強(qiáng)，致使不能給組織供氧。采納這種BPG濃度低的輸血，病人可能被窒息。]6.HbA能抑制HbS形成細(xì)長(zhǎng)纖維和紅細(xì)胞在脫氧后的鐮刀狀化。為什么HbA具有這一效應(yīng)？[去氧HbA含有一個(gè)互補(bǔ)部位，因而它能加到去氧HbS纖維上。這樣的纖維不能繼續(xù)延伸，因?yàn)槟┒说娜パ鮄bA分子缺少“粘性”區(qū)。]7.一個(gè)單克隆抗體與G-肌動(dòng)蛋白結(jié)合但不與F-肌動(dòng)蛋白結(jié)合，這對(duì)于抗體識(shí)別抗原表位能告訴你什么？[該表位可能是當(dāng)G-肌動(dòng)蛋白聚合成F-肌動(dòng)蛋白時(shí)被埋藏的那部分結(jié)構(gòu)。]8．假設(shè)一個(gè)Fab-半抗原復(fù)合體的解離常數(shù)在25℃和pH7時(shí)為5×10-7mol/L。（a）結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)自由能（25℃和pH7時(shí)）是多少？（b）此Fab的親和力結(jié)合常數(shù)是多少？（c）從該復(fù)合體中釋放半抗原的速度常數(shù)為120S-1。結(jié)合的速度常數(shù)是多少？此說(shuō)明在結(jié)合半抗原時(shí)抗體中的結(jié)構(gòu)變化是大還是?。縖（a）ΔG0ˊ=35.9kj/mol；（b）Ka=2×106mol-1L；（c）結(jié)合速度常數(shù)k=2×108mol-1S-1L，此值臨近于小分子與蛋白質(zhì)相遇（結(jié)合）的蔓延控制限制（108至109mol9.抗原與抗體的結(jié)合方式與血紅蛋白的氧結(jié)合相似。假設(shè)抗原是一價(jià)，抗體是n價(jià)，即6抗體分子有n個(gè)結(jié)合部位，且各結(jié)合部位的結(jié)合常數(shù)Ka值是相同的，則可證實(shí)當(dāng)游離抗原濃度為[L]時(shí)，結(jié)合到抗體上的抗原濃度[Lp]與抗體的總濃度[Pr]之比值，N=[Lp]/[Pr]=(nKa[L])/(1+Ka[L])N實(shí)際上表示被一個(gè)抗體分子結(jié)合的抗原分子平均數(shù)。（a）證實(shí)上面的方程可重排為N/[L]=Kan-KaN此方程式稱Scatchard方程，方程表明，N/[L]對(duì)N作圖將是一條直線。（b）按照Scatchard方程，利用下列數(shù)據(jù)作圖求出抗體-抗原反應(yīng)的n和Ka值。[L]mol/LN1.43×10-50.52.57×10-50.776.00×10-51.201.68×10-41.683.70×10-41.85[（a）第一個(gè)方程兩邊各乘（1+Ka[L]），然后兩邊各除以[L]，并重排第2個(gè)方程；（b）按照第二方程，N/[L]對(duì)N作圖的斜率是-Ka，N/[L]=0時(shí)的截距給出n。利用數(shù)據(jù)作圖得Ka=2.2×10-4mol/L，n=2.1。因?yàn)榻Y(jié)合部位數(shù)目只可能是整數(shù)，所以n=2]10.一個(gè)典型的松弛肌節(jié)中細(xì)絲長(zhǎng)約2μm，粗絲長(zhǎng)約為1.5μm。（a）估算在松弛和收縮時(shí)粗絲和細(xì)絲的重疊情況。（b）一次循環(huán)中肌球蛋白沿細(xì)絲滑行“一步”移動(dòng)約7.5nm，問(wèn)一次收縮中每個(gè)肌動(dòng)蛋白纖維需要舉行多少個(gè)步？[（a）約0.75nm，（b）約67步]解：（a）按照P281圖6-35A所示，當(dāng)松弛是重疊總長(zhǎng)度為：（1+1）-（3-1.5）=0.5μm0.5/2=0.25μm當(dāng)收縮時(shí)重疊總長(zhǎng)度為：（1+1）-（2-1.5）=1.5μm1.5/2=0.75μm（b）（3-2）÷2×103÷7.5≌67步第七章蛋白質(zhì)的分離、純化和表征提要蛋白質(zhì)也是一種兩性電解質(zhì)。它的酸堿性質(zhì)主要決定于肽鏈上可解離的R基團(tuán)。對(duì)某些蛋白質(zhì)說(shuō)，在某一pH下它所帶的正電荷與負(fù)電荷相等，即凈電荷為零，此pH稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。各種蛋白質(zhì)都有自己特定的等電點(diǎn)。在等電點(diǎn)以上的pH時(shí)蛋白質(zhì)分子帶凈負(fù)電荷，在等電點(diǎn)以下的pH時(shí)帶凈正電荷。蛋白質(zhì)處于等電點(diǎn)時(shí)溶解度最小。在無(wú)鹽類干擾情況下，一種蛋白質(zhì)的質(zhì)子供體基團(tuán)解離出來(lái)的質(zhì)子數(shù)與質(zhì)子受體基團(tuán)結(jié)合的質(zhì)子數(shù)相等時(shí)的pH是它的真正等電點(diǎn)，稱為等離子點(diǎn)，它是該蛋白質(zhì)的特征常數(shù)。測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）的最重要的主意是利用超速離心機(jī)的沉降速度法和沉降平衡法。沉降系數(shù)（s）的定義是單位離心場(chǎng)強(qiáng)度的沉降速度。s也常用來(lái)近似地描述生物大分子的大小。凝膠過(guò)濾是一種簡(jiǎn)便的測(cè)定蛋白質(zhì)Mr的主意。SDS-聚丙乙酰胺凝膠電泳（PAEG）用于測(cè)定單體蛋白質(zhì)或亞基的Mr。蛋白質(zhì)溶液是親水膠體系統(tǒng)。蛋白質(zhì)分子顆粒（直徑1～100nm）是系統(tǒng)的凝聚相，水是凝聚介質(zhì)。蛋白質(zhì)分子顆粒周圍的雙電層和水化層是穩(wěn)定蛋白質(zhì)膠體系統(tǒng)的主要因素。分離蛋白質(zhì)混合物的各種主意主要按照蛋白質(zhì)在溶液中的下列性質(zhì)：（1）分子大??；（2）溶解度；（3）電荷；（4）吸附性質(zhì)；（5）對(duì)配體分子特異的生物學(xué)親和力。透析和超過(guò)濾是利用蛋白質(zhì)不能通過(guò)半透膜的性質(zhì)使蛋白質(zhì)分子和小分子分開(kāi)，常用于濃縮和脫鹽。密度梯度離心和凝膠過(guò)濾層析都已勝利地用于分離蛋白質(zhì)混合物。等電點(diǎn)沉淀、鹽析和有機(jī)溶劑分級(jí)分離等主意常用于蛋白質(zhì)分離的頭幾步。移動(dòng)界面電泳、各種形式的區(qū)帶電泳，異常是圓盤凝膠電泳、毛細(xì)血管電泳以及等電聚焦具有很高的分辨率。纖維素離子交換劑和Sephadex離子交換劑的離子交換柱層析已廣泛地用于蛋白質(zhì)的分離純化。HPLC和親和層析法是十分有效的分離純化主意。蛋白質(zhì)制品的純度鑒定通常采用分辨率高的物理化學(xué)主意，例如PAGE、等電聚焦、毛細(xì)血管電泳、沉降分析和HPLC等。倘若制品是純的，在這些分析的圖譜上只展示一個(gè)峰或一條帶。必須指出，任何單獨(dú)鑒定只能認(rèn)為是蛋白質(zhì)分子均醫(yī)性的須要條件而不是充足條件。習(xí)題1.測(cè)得一種血紅素蛋白質(zhì)含0.426%鐵，計(jì)算最低相對(duì)分子質(zhì)量。一種純酶按分量計(jì)算含亮氨酸1.65%和異亮氨酸的分子質(zhì)量都是2.48%，問(wèn)其最低相對(duì)分子質(zhì)量是多少？[13110；15870]解：（1）蛋白質(zhì)MV=55.8÷0.426%=13100（2）亮氨酸和異亮氨酸的分子質(zhì)量都是131Da，按照兩種氨基酸的含量來(lái)看，異亮氨酸：亮氨酸=2.48%：1.65%=3：2，所以在此蛋白質(zhì)中的亮氨酸至少有兩個(gè)，異亮氨酸至少有三個(gè)，那么：1.65%=2×（131-18）÷蛋白質(zhì)MV蛋白質(zhì)MV=14581Da。2.超速離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為58000r/min時(shí)，（1）計(jì)算角速度ω，以rad/s表示；（2）計(jì)算距旋轉(zhuǎn)中央6.2cm處的離心加速度a；（3）此離心加速度相當(dāng)于重力加速度“g”的多少倍？[（1）ω=6070.7rad/s（2）a=2.284×108cm/s2；（3）a=解：（1）ω=58000×2π/60=6070.7rad/s（2）a=（6070.7）2×6.2=2.285×108cm（3）2.285×108/9.8=63.一種蛋白質(zhì)的偏微比容為0.707cm2/g,當(dāng)溫度校正為20℃，溶劑校正為水時(shí)蔓延系數(shù)（D20.W）為13.1×10-7cm2/s.沉降系數(shù)（S20.W）為2.05S。20℃時(shí)水的密度為0.998g解：Mr=(RTs)/[D(1-υρ)]=8.314×（273+20）×2.05/[13.1×10-7（1-0.707×0.998）]=130004.一個(gè)層析柱中負(fù)頂相體積（Vs）為流動(dòng)相體積（Vm）的1/5。假設(shè)某化合物的分配系數(shù)，（a）Kd=1；（b）Kd=50。計(jì)算該化合物的有效分配系數(shù)（Keff），也稱容量因子（capacity）。[（a）Keff=0.2；(b)Keff=10]5.指出從分子排阻層析柱上洗脫下列蛋白質(zhì)時(shí)的順序。分離蛋白質(zhì)的范圍是5000到400000；肌紅蛋白、過(guò)氧化氫酶、細(xì)胞色素C、肌球蛋白、胰凝乳蛋白酶原和血清清蛋白（它們的Mr見(jiàn)表7-4）。[肌球蛋白、過(guò)氧化氫酶、血清清蛋白、胰凝乳蛋白酶原、肌紅蛋白、細(xì)胞色素C]6.由第5題所述的，從分子排阻層析柱上洗脫細(xì)胞色素C、β-乳球蛋白和血清紅蛋白時(shí)，其洗脫體積分離為118、58、37和24ml，問(wèn)未知蛋白的Mr是多少？假定所有蛋白質(zhì)都是球形的，并且都處于柱的分級(jí)分離范圍。[52000]7.在下面指出的pH下，下述蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中相哪個(gè)方向移動(dòng)，即向正極、負(fù)極還是不動(dòng)？（按照表7-2的數(shù)據(jù)判斷。）（1）血清蛋白，pH5.0；（2）β-乳球蛋白，pH5.0和7.0；（3）胰凝乳蛋白酶原，pH5.0、9.1和11。[（1）正極；（2）負(fù)極、正極；（3）負(fù)極、不動(dòng)、正極]解：（1）卵清蛋白pI=4.6，pH=5.0>4.6帶負(fù)電，向正極移動(dòng)；（2）β-乳球蛋白pI=5.2，pH=5.0<5.2帶正電，向負(fù)極移動(dòng)；pH=7.0>5.2帶負(fù)電，向正極移動(dòng)；（3）胰凝乳蛋白酶原pI=9.1，pH=5.0<9.1帶正電，向負(fù)極移動(dòng)；pH=9.1=pI凈電荷為零，不移動(dòng)；pH=11>9.1帶負(fù)電，向正極移動(dòng)；8.（1）當(dāng)Ala、Ser、Phe、Leu、Arg、Asp和His的混合物在pH3.9舉行紙電泳時(shí)，哪些氨基酸移向正極？哪些氨基酸移向負(fù)極？（2）紙電泳時(shí)，帶有相同電荷的氨基酸常有少許分開(kāi)，例如Gly可與Leu分開(kāi)，試說(shuō)明為什么？（3）設(shè)Ala、Val、Glu、Lys和Thr的混合物pH為6.0，試指出紙電泳后氨基酸的分離情況。PI值：Ala：6.02Ser：5.68Phe：5.48Leu：5.98Arg：10.76Asp：2.97His：7.59[（1）Ala、Ser、Phe和Leu以及Arg和His向負(fù)極，Asp移向正極；（2）電泳時(shí)，具有相同電荷的較大分子比較小分子移動(dòng)得慢，因?yàn)殡姾?質(zhì)量之比較小，因而引起每單位質(zhì)量遷移的驅(qū)動(dòng)力也較小。（3）Glu移向正極，Lys移向負(fù)極,Val、Ala和Thr則留在原點(diǎn)。]9.凝膠過(guò)濾層析和凝膠電泳中的分子篩效應(yīng)有什么不同？為什么？10.配制一系列牛血清清蛋白（BSA）稀釋液，每一種溶液取0.1ml舉行Bradford法測(cè)定。對(duì)適當(dāng)?shù)目瞻诇y(cè)定595nm波長(zhǎng)處的光吸收（A595）。結(jié)果如下表所示：BSA濃度（mg·L-1）A590.970.80.790.60.590.40.370.20.17BSA濃度對(duì)A595作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線。E.coli的蛋白質(zhì)提取液樣品（0.1ml）測(cè)得的A595為0.84。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線算出E.coli提取液中的蛋白質(zhì)濃度。[0.85mg/ml]解：標(biāo)準(zhǔn)曲線略。由標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，當(dāng)A595為0.84時(shí)，BSA濃度為0.85mg/ml。第八章酶通論提要生物體內(nèi)的各種化學(xué)變化都是在酶催化下舉行的。酶是由生物細(xì)胞產(chǎn)生的，受多種因素調(diào)節(jié)控制的具有催化能力的生物催化劑。與普通催化劑相比有其共同性，但又有顯著的特點(diǎn)，酶的催化效率高，具有高度的專一性，酶的活性受多種因素調(diào)節(jié)控制，酶作用條件溫暖，但不夠穩(wěn)定。酶的化學(xué)本質(zhì)除有催化活性的RNA分子之外都是蛋白質(zhì)。按照酶的化學(xué)組成可分為單純蛋白質(zhì)和綴合蛋白質(zhì)是由不表現(xiàn)酶活力的脫輔酶及輔因子（包括輔酶、輔基及某些金屬離子）兩部分組成。脫輔酶部分決定酶催化的專一性，而輔酶（或輔基）在酶催化作用中通常起傳遞電子、原子或某些化學(xué)基團(tuán)的作用。按照各種酶所催化反應(yīng)的類型，把酶分為六大類，即氧化還原酶類、轉(zhuǎn)移酶類、水解酶類、裂合酶類、異構(gòu)酶類和銜接酶類。按規(guī)定每種酶都有一個(gè)習(xí)慣名稱和國(guó)際系統(tǒng)名稱，并且有一個(gè)編號(hào)。酶對(duì)催化的底物有高度的挑選性，即專一性。酶往往只能催化一種或一類反應(yīng)，作用于一種或一類物質(zhì)。酶的專一性可分為結(jié)構(gòu)專一性和立體異構(gòu)專一性兩種類型。用“誘導(dǎo)契合說(shuō)”解釋酶的專一性已被人們所采納。酶的分離純化是酶學(xué)研究的基礎(chǔ)。已知大多數(shù)酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，因此用分離純化蛋白質(zhì)的主意純化酶，不過(guò)要注重挑選合適的材料，操作條件要溫暖。在酶的制備過(guò)程中，沒(méi)一步都要測(cè)定酶的活力和比活力，以了解酶的回收率及提純倍數(shù)，以便判斷提純的效果。酶活力是指在一定條件下酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的能力，可用反應(yīng)初速率來(lái)表示。測(cè)定酶活力及測(cè)酶反應(yīng)的初速率。酶活力大小來(lái)表示酶含量的多少。20世紀(jì)80年代初，Cech和Altmsn分離發(fā)現(xiàn)了某些RNA分子具有催化作用，定名為核酶（ribozyme）。有催化分子內(nèi)和分分子間反應(yīng)的核酶。具有催化功能RNA的發(fā)現(xiàn)，開(kāi)辟了生物化學(xué)研究的新領(lǐng)域，提出了生命起源的新概念。按照發(fā)夾狀或錘頭狀二級(jí)結(jié)構(gòu)原理，可以設(shè)計(jì)出各種人工核酶，用作抗病毒和抗腫瘤的防治藥物將會(huì)有良好的應(yīng)用前景?？贵w酶是一種具有催化能力的蛋白質(zhì)，本質(zhì)上是免疫球蛋白，但是在易變區(qū)賦予了酶的屬性。按照酶催化的過(guò)度態(tài)理論，設(shè)計(jì)各種過(guò)度態(tài)類似物作為半抗原免疫動(dòng)物，篩選具有催化活性的單抗。抗體酶具有酶的一切性質(zhì)?，F(xiàn)已研制出催化多種反應(yīng)的抗體酶?？贵w酶的發(fā)現(xiàn)，不僅為酶的過(guò)度態(tài)理論提供了有力的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，而且抗體酶將會(huì)得到廣泛的應(yīng)用。酶工程是將酶學(xué)原理與化學(xué)工程技術(shù)及基因重組技術(shù)有機(jī)結(jié)合而形成的新型應(yīng)用技術(shù)，是生物工程的支柱。按照研究和解決問(wèn)題的手段不同將酶工程分為化學(xué)酶工程和生物酶工程。隨著化學(xué)工程技術(shù)及基因工程技術(shù)的發(fā)展，酶工程發(fā)展更為疾馳，必將成為一個(gè)很大的生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)。習(xí)題1.酶作為生物催化劑有哪些特點(diǎn)？答：酶是細(xì)胞所產(chǎn)生的，受多種因素調(diào)節(jié)控制的具有催化能力的生物催化劑，與普通非生物催化劑相比較有以下幾個(gè)特點(diǎn)：1、酶易失活；2、具有很高的催化效率；3、具有高度專一性；4、酶活性受到調(diào)節(jié)和控制。2.何謂酶的專一性？酶的專一性有哪些？如何解釋酶作用的專一性？研究酶的專一性有何意義？答：酶的專一性是指酶對(duì)催化的反應(yīng)和反映物有鄭重的挑選性。酶的專一性分為兩種類型：1、結(jié)構(gòu)專一性，包括絕對(duì)專一性、相對(duì)專一性（族專一性或基團(tuán)專一性、鍵專一性）；2、立體異構(gòu)專一性，包括旋光異構(gòu)專一性、幾何異構(gòu)專一性。通過(guò)對(duì)酶結(jié)構(gòu)與功能的研究，確信酶與底物作用的專一性是因?yàn)槊概c底物分子的結(jié)構(gòu)互補(bǔ)，誘導(dǎo)契合，通過(guò)分子的互相識(shí)別而產(chǎn)生的。對(duì)酶的專一性研究具有重要的生物學(xué)意義。它有利于闡明生物體內(nèi)有序的代謝過(guò)程，酶的作用機(jī)制等。3.酶的活性受那些因素調(diào)節(jié)，試說(shuō)明之。答：酶的調(diào)節(jié)和控制有多種方式，主要有：（1）調(diào)節(jié)酶的濃度：主要有2種方式：誘導(dǎo)或抑制酶的合成；調(diào)節(jié)酶的降解；（2）通過(guò)激素調(diào)節(jié)酶活性、激素通過(guò)與細(xì)胞膜或細(xì)胞內(nèi)受體相結(jié)合而引起一系列生物學(xué)效應(yīng)，以此來(lái)調(diào)節(jié)酶活性；（3）反饋抑制調(diào)節(jié)酶活性：許多小分子物質(zhì)的合成是由一連串的反應(yīng)組成的，催化此物質(zhì)合成的第一步的酶，往往被他們終端產(chǎn)物抑制；（4）抑制劑和激活劑對(duì)酶活性的調(diào)節(jié)：酶受大分子抑制劑或小分子物質(zhì)抑制，從而影響酶活性；（5）其他調(diào)節(jié)方式：通過(guò)別構(gòu)酶、酶原的激活、酶的可逆共價(jià)修飾和同工酶來(lái)調(diào)節(jié)酶活性。４.輔基和輔酶有何不同？在酶催化反應(yīng)種起什么作用？答：輔酶通常指與脫輔酶結(jié)合比較松弛的小分子有機(jī)物質(zhì)。通過(guò)透析主意可以除去，如輔酶Ⅰ和輔酶Ⅱ等。輔基是以共價(jià)鍵和脫輔酶結(jié)合，不能通過(guò)透析除去，需要經(jīng)過(guò)一定的化學(xué)處理才干與蛋白分開(kāi)，如細(xì)胞色素氧化酶中的鐵卟啉，丙酮氧化酶中的黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）都屬于輔基。它們的區(qū)別只在于它們與脫輔酶結(jié)合的結(jié)實(shí)程度不同。輔酶、輔基在酶催化反應(yīng)中通常是起著電子、原子或某些化學(xué)基團(tuán)的傳遞作用。５.酶分哪幾大類？舉例說(shuō)明酶的國(guó)際系統(tǒng)命名法及酶的編號(hào)。答：國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)按照酶所催化反應(yīng)的類型，把酶分為６大類：即氧化還原酶類、轉(zhuǎn)移酶類、水解酶類、裂合酶類、異構(gòu)酶類和銜接酶類。分離利用1、2、3、4、5、6來(lái)表示。例如：1.1.3表示氧化還原酶，作用于CHOH基團(tuán)，受體是分子氧。按照底物中別所用的基團(tuán)或鍵的特點(diǎn)將每一大類分為若干亞類，每一個(gè)亞類又按順序變成1、2、3……等數(shù)字；每一個(gè)亞基可再分亞亞類，仍用1、2、3……編號(hào)，每一個(gè)每的分類編號(hào)由4個(gè)數(shù)字組成，數(shù)字間由由“·”隔開(kāi)。第一個(gè)數(shù)字指明該酶屬于哪一個(gè)亞類；第三個(gè)數(shù)字指出該酶屬于一個(gè)亞亞類；第四個(gè)數(shù)字則表明該酶在亞亞類中的排號(hào)。編號(hào)之間冠以EC（EnzymeCommision）。6.什么叫酶的活力和比活力？測(cè)定酶活力應(yīng)注重什么？為什么測(cè)定酶活力時(shí)以測(cè)定初速率為宜，并且底物濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于酶濃度？答：酶活力指酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的能力，其大小可用在一定條件下所催化的某一化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)速率來(lái)表示；酶的比活力代表酶的純度，按照國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)的規(guī)定比活力用每mg蛋白質(zhì)所含的酶活力單位數(shù)表示。酶的催化作用受測(cè)定環(huán)境的影響，因此測(cè)定酶活力要在最適條件下舉行，即最適溫度、最適pH、最適底物濃度和最適緩沖離子強(qiáng)度等。惟獨(dú)在最適條件下測(cè)定才干真切反映酶活力的大小。隨時(shí)光的延伸，酶促反應(yīng)中底物濃度降低，產(chǎn)物濃度增強(qiáng)，加速逆反應(yīng)的舉行，產(chǎn)物對(duì)酶抑制或激活作用以及隨時(shí)光的延伸引起酶本身部分分子失活等，酶促反應(yīng)速率降低，因此測(cè)定活力，應(yīng)測(cè)定酶促反應(yīng)的初速率，從而避免上述種種復(fù)雜因素對(duì)反應(yīng)速率的影響。底物濃度太低時(shí)，5%以下的底物濃度變化實(shí)驗(yàn)上不易測(cè)準(zhǔn)，所以在測(cè)定酶的活力時(shí)，往往使第五濃度充足大，這樣囫圇酶反應(yīng)對(duì)底物來(lái)說(shuō)是零級(jí)反應(yīng)，而對(duì)酶來(lái)說(shuō)卻是以及反應(yīng)，這樣測(cè)得的速率就比較可靠地反映酶的含量。7.什么叫核酶和抗體酶？它們的發(fā)現(xiàn)有什么重要意義？答：具有催化功能的RNA叫核酶。它的發(fā)現(xiàn)，表明RNA是一種既能攜帶遺傳信息又有生物催化功能的生物分子。因此很可能RNA早于蛋白質(zhì)和DNA，是生命起源中首先浮上的生物大分子，而一些有酶活性的內(nèi)含子可能是生物進(jìn)化過(guò)程中殘存的分子“化石”。酶RNA的發(fā)現(xiàn)，提出了生物大分子和生命起源的新概念，無(wú)疑促進(jìn)對(duì)生物進(jìn)化和生命起源的研究?？贵w酶是20實(shí)際80年代后期才浮上的一種具有催化能力的蛋白質(zhì)，其本質(zhì)上是免疫球蛋白，但是在易變區(qū)被賦予了酶的屬性，所以又稱“催化性抗體”，抗體酶的發(fā)現(xiàn)，不僅為酶的過(guò)渡態(tài)理論提供了有力的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，而且抗體酶將會(huì)得到廣泛的應(yīng)用。8.解釋下列名詞：（1）生物酶工程：酶學(xué)和以DNA重組技術(shù)為主的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物。（2）固定化酶：將水溶性酶用物理或化學(xué)主意處理，使之成為不溶于水的、但仍具有酶活性的狀態(tài)。（3）活化能：在一定溫度下1mol底物所有進(jìn)入活化狀態(tài)所需要的自由能（kj/mol）（4）酶的轉(zhuǎn)化數(shù)：在一定條件下每秒鐘每個(gè)酶分子轉(zhuǎn)換底物的分子數(shù)。（5）寡聚酶：由兩個(gè)以上亞基組成的酶。（6）Kat單位：在最適條件下，酶秒鐘催化1mol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量，為Kat單位。（7）酶偶聯(lián)分析法：因?yàn)榉止夤舛确ㄓ衅洫?dú)特的優(yōu)點(diǎn)，因此把一些遠(yuǎn)類沒(méi)有光吸收變化的酶反應(yīng)，可以通過(guò)與一些能引起光吸收變化的酶反映偶聯(lián)使第一個(gè)酶反映的產(chǎn)物改變成第二個(gè)酶的具有光吸收變化的產(chǎn)物來(lái)舉行測(cè)量。（8）誘導(dǎo)契合說(shuō)：1958年Koshland提出，當(dāng)酶分子與底物分子臨近時(shí)，酶蛋白受底物分子誘導(dǎo)，其構(gòu)想發(fā)生有利于底物結(jié)合的變化，酶與底物在此基礎(chǔ)上互補(bǔ)契合舉行反應(yīng)。（9）反饋抑制：許多小分子物質(zhì)的合成是由一聯(lián)串的反應(yīng)組成的，催化此物質(zhì)生成的第一步的酶，往往被它們終端產(chǎn)物抑制。這種抑制叫反饋抑制。（10）多酶復(fù)合體：由幾種酶靠非共價(jià)鍵彼此嵌合而成。9.用AgNO3對(duì)在10ml含有1.0mg/ml蛋白質(zhì)的純酶溶液舉行全抑制，需用0.342μmolAgNO3，求該酶的最低相對(duì)分子質(zhì)量。10.1μg純酶（Mr:92×103）在最適條件下，催化反應(yīng)速率為0.5μmol/min，試計(jì)算：（1）酶的比活力。[500U/mg]（2）轉(zhuǎn)換數(shù)。[766.7s-1]解：（1）比活力=0.5μmol/min/1μg=500U/mg（2）轉(zhuǎn)換數(shù)=0.5/60×1÷（1×10-6/92×103×106）=766.7s-111.1g鮮重的肌肉含有40單位的某種酶，其轉(zhuǎn)換數(shù)為6×104min-1，試計(jì)算該酶在細(xì)胞內(nèi)濃度（假設(shè)清新組織含水80%，并且所有在細(xì)胞內(nèi)）。[8.33×10-7mol/L]解：1/6×104×40÷（1×80%×103）=[8.33×10-7mol/L12.焦磷酸酶可以催化焦磷酸水解或磷酸，其相對(duì)分子質(zhì)量為120×103，由6個(gè)相同亞基組成。純酶的Vmax為2800U/mg酶。它的一個(gè)活力單位規(guī)定為：在標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定條件下，37℃、15min內(nèi)水解10μmol焦磷酸所需要的酶量。問(wèn)：（1）酶mg酶在每秒鐘內(nèi)水解多少mol底物？[3.11×10-5mol]。（2）每mg酶中有多少mol的活性部位（假設(shè)每個(gè)亞基上有一個(gè)活性部位）？[5×10-8mol活性中央]。（3）酶的轉(zhuǎn)換數(shù)是多少？[622s-1或622mol焦磷酸/（s·解：（1）2800×10/15×1/（60×106）×1=3.11×10-5mol（2）1×10-3/120×103×6=5×10-8mol（3）3.11×10-5÷1×10-3/120×103×1/6=62213.稱取25mg蛋白酶粉配制成25ml酶溶液，從中取出0.1ml酶液，以酪蛋白為底物，用Folin-酚比色法測(cè)定酶活力，得知每小時(shí)產(chǎn)生1500μg酪氨酸。另取2ml酶液，用凱氏定氮法測(cè)得蛋白質(zhì)為0.2mg，若以每分鐘產(chǎn)生1μg酪氨酸的酶量為1個(gè)活力單位計(jì)算，按照以上數(shù)據(jù)，求出：（1）1ml酶液中所含蛋白質(zhì)量及活力單位。[0.625mg蛋白質(zhì)，250U]（2）比活力。[400U/mg蛋白質(zhì)]（3）1g酶制劑的總蛋白含量及總活力。[0.625g，2.5×105U]解：（1）0.2×6.25÷（2×25/25）=0.625mg1500/60÷（0.1×25/25）=250U（2）250÷0.625=400U/mg（3）0.625÷（1×25/25）×1×103=0.625×103mg=0.625g1500/60÷（0.1×25/25）÷（1×25/25）×103=2.5×105U14.有1g淀粉酶酶制劑，用水溶解成1000ml，從中取出1ml測(cè)定淀粉酶活力，測(cè)知每5min分解0.25g淀粉。計(jì)算每g酶制劑所含淀粉酶活力單位數(shù)？[3000U]（淀粉酶活力單位定義：在最適條件下每小時(shí)分解1g淀粉的酶量稱為1個(gè)活力單位）解：0.25/5×60÷（1/1000×1）=3000U15.某酶的初提取液經(jīng)過(guò)一次純化后，竟測(cè)定得到下列數(shù)據(jù)：試計(jì)算比活力、百分產(chǎn)量及純化倍數(shù)。[比活力：180U/mg蛋白質(zhì)，百分產(chǎn)量：17%，純化倍數(shù)：9倍]體積/ml活力單位/（U/ml）蛋白質(zhì)/（mg/ml）初提取液（NH4）2SO4鹽析1205200810104解：（1）810/4.5=180U/mg（2）810×5÷（200×120）×100%=17%（3）180÷（200/10）=9第九章酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)提要酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)是研究酶促反應(yīng)的速率以及影響此速率各種因素的科學(xué)。它是以化學(xué)動(dòng)力學(xué)為基礎(chǔ)研究底物濃度、抑制劑、pH、溫度及激活劑等因素對(duì)酶反應(yīng)速率的影響?；瘜W(xué)動(dòng)力學(xué)中在研究化學(xué)反應(yīng)速率與反應(yīng)無(wú)濃度的關(guān)系時(shí)，常分為一級(jí)反應(yīng)、二級(jí)反應(yīng)及零級(jí)反應(yīng)。研究證實(shí)，酶催化過(guò)正的第一步是生成酶-底物中間產(chǎn)物，Michaelis-Menten該呢舉中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō)的理論推導(dǎo)出酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程式，即Km、Vmax、kcat