體型控制器：S6K1相關(guān)磷酸化抗體介紹

體型控制器：S6K1，相關(guān)磷酸化抗體介紹前言S6K1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，因能介導(dǎo)核糖體蛋白S6磷酸化而得名。眾所周知，胞內(nèi)蛋白磷酸化在多種生理及病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，并與癌癥的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。除此之外，S6K1還有控制體型的功能，下文我們將詳細(xì)描述。01S6K1概述S6K1（RibosomalproteinS6kinasebeta-1）主要由三個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，分別是N端結(jié)構(gòu)域（NTD）、中間激酶結(jié)構(gòu)域（KD）和C端自抑制結(jié)構(gòu)域（CTD）（如圖1）。S6K1具有兩種形式：p70和p85，兩者的區(qū)別是p70相較于p85缺失N端的23個(gè)氨基酸的核定位序列(NLS），其余序列完全一致，所以S6K1的WB結(jié)果往往呈現(xiàn)雙條帶的顯影。S6K1結(jié)構(gòu)示意圖（源自參考文獻(xiàn)：/10.1016/j.lfs.2015.03.001）S6K1介導(dǎo)核糖體蛋白S6的磷酸化，發(fā)揮調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期及維持細(xì)胞生成等作用，在癌癥的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。S6K1是雷帕霉素靶蛋白（mTOR）下游的一個(gè)重要效應(yīng)器，同時(shí)也是一個(gè)前沿的藥物靶點(diǎn)。根據(jù)藥融云數(shù)據(jù)顯示，全球在研的S6K1靶點(diǎn)藥物共有26個(gè)，大部分處于藥物發(fā)現(xiàn)階段，其中走在最前列的是默克公司的DIACC-3010（臨床Ⅲ期），靶向多種腫瘤。02S6K1調(diào)控體型研究S6K1的激活是一個(gè)多步驟調(diào)控的過(guò)程。靜息狀態(tài)下，S6K1的C端自抑制結(jié)構(gòu)域與N端結(jié)合，不展現(xiàn)激酶活性。但是當(dāng)C端多位點(diǎn)磷酸化之后，S6K1轉(zhuǎn)變?yōu)殚_(kāi)放構(gòu)象，暴露出389位的蘇氨酸位點(diǎn)（p70S6K1的T389對(duì)應(yīng)p85S6K1的T412），并被mTORC1復(fù)合物磷酸化，進(jìn)而展示激酶活性。S6K1磷酸化S6的位點(diǎn)有Ser235、Ser236、Ser240、Ser244、Ser247等。在細(xì)胞模型中，如果將S6五個(gè)磷酸化位點(diǎn)（Ser235、Ser236、Ser240、Ser244、Ser247）進(jìn)行丙氨酸（Ala）替換，導(dǎo)致S6K1無(wú)法磷酸化S6，則MEF、胰島β細(xì)胞會(huì)增強(qiáng)蛋白合成、加快細(xì)胞分裂速度，造成細(xì)胞體型明顯變小。細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的速率與蛋白質(zhì)合成的速率成正比。在正常細(xì)胞過(guò)程中，當(dāng)生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)存在時(shí)，S6K1會(huì)刺激蛋白質(zhì)合成。在小鼠模型中，同樣在高脂肪飲食喂養(yǎng)的情況下，S6K1基因缺陷小鼠體重相比野生型少30%以上，且主要是脂肪積累減少。結(jié)果表明氧化磷酸化途徑的上調(diào)和胰島素敏感性的提高，S6K1基因缺陷小鼠可避免高脂肪飲食引起的肥胖，且負(fù)向調(diào)節(jié)胰島素信號(hào)。因此，S6K1和S6不僅能夠調(diào)控細(xì)胞的體型大小，還能夠調(diào)控機(jī)體的體型大小。高脂肪飲食喂養(yǎng)4個(gè)月的小鼠體重變化（源自參考文獻(xiàn)：/10.1038/nature02866）磷酸化抗體驗(yàn)證數(shù)據(jù)RecombinantPhospho-p70S6Kinase1(Thr389)Antibody,RabbitMonoclonal，Cat:110396-R0001特異性驗(yàn)證：磷酸酶處理Westernblotanalysisofextractsfromserum-starvedMCF7,untreated(lineA);treatedwithIGF-1(Cat:10598-HNAE)(100ng/mL,30min;+)(lineB);treatedwithIGF-1andλ-phosphatase(lineC)usingPhospho-S6K1(Thr389)rabbitmonoclonalAntibody(Cat:110396-R0001)at1:5000dilution(upper),orAnti-RPS6KB1rabbitpolyclonalantibody(Cat:10099-T38)(lower)at1:5000dilution.特異性驗(yàn)證：磷酸化多肽競(jìng)爭(zhēng)Westernblotanalysisofextractsfromserum-starvedMCF7,untreated(lineA);treatedwithIGF-1(Cat:10598-HNAE)(100ng/mL,30min),withoutpeptide(lineB)orantigen-specificphosphopeptide(lineC)orantigen-specificpeptide(lineD)usingPhospho-S6K1(Thr389)rabbitmonoclonalAntibody(Cat:110396-R0001)at1:5000dilution.超高稀釋度（1:200000）Westernblotanalysisofextractsfromserum-starvedMCF7,treatedwithIGF-1(Cat:10598-HNAE)(100ng/mL,30min),usingPhospho-S6K1(Thr389)rabbitmonoclonalAntibody(Cat:110396-R0001)(Sino)andotherbrands’antibodies(companyC,companyP)atdilutionof1:1000,1:10000and1:200000.Phospho-S6RibosomalProtein(Ser240,244)Antibody,RabbitMab，Cat:110571-R0018Westernblotanalysisofextractsfromserum-starvedHEK293,untreated(-)ortreatedwith20%FBS,usingPhospho-S6RibosomalProtein(Ser240,244)Antibody,RabbitMAb(upper),orAnti-RPS6Antibody,RabbitPolyclonal(Cat:100676-T32)(lower)at1:1000dilution.Phospho-S6RibosomalProtein(Ser235,236)Antibody,RabbitMAb，Cat:110595-R0044Westernblotanalysisofextractsfromserum-starvedHek293,untreated(-)ortreatedwithIGF1(100ng/ml,15min;+),usingPhospho-S6RibosomalProtein(Ser235,236)rabbitMonoclonalAntibodyat1:1000dilution(upper)oranti-S6RibosomalProteinantibody(Cat:100676-T32)(lower)at1:1000dilution.【參考文獻(xiàn)】1.Jastrzebski,K.,etal.CoordinateregulationofribosomebiogenesisandfunctionbytheribosomalproteinS6kinase,akeymediatorofmTORfunction.GrowthFactors,2007./10.1080/089771907017791012.Ruvinsky,I.,etal.RibosomalproteinS6phosphorylationisadeterminantofcellsizeandglucosehomeostasis.GenesDev,2005./10.1101/gad.3516053.Tavares,M.R.,etal.TheS6Kproteinfamilyinhealthanddisease.LifeSci,2015./10.1016/j.lfs.2015.03.001Um,S.H.,etal.AbsenceofS6K1protectsagainstage-anddiet-inducedobesitywhileenhancinginsulinsensitivity.Nature,2004./10.1038/nature028664.Yamashita,D.,etal.hDREFregulatescellproliferationand