TSPPHN 003-2024 豆科蔬菜主要病毒病綜合防控技術規(guī)程

ICS01.040.65CCSB15/19CodeofIntegralPreventionTechnologyoftheEpidemicLegumeVegetable湖南省植物保護學會發(fā)布I本文件是根據(jù)GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由湖南省植物保護學會提出。本文件由湖南省植物保護學會歸口。本文件起草單位為湖南省農(nóng)業(yè)科學院、寧波大學、全國農(nóng)業(yè)技術推廣服務中心、沈陽農(nóng)業(yè)大學、中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所、江蘇省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所、廣東省農(nóng)業(yè)科學院、云南農(nóng)業(yè)大學、山東省農(nóng)業(yè)科學院。本文件主要起草人：劉勇、燕飛、張松柏、章東方、張卓、史曉斌、張德詠、孫書娥、嚴丹侃、鄭紅英、顧江濤、張海珊、張安盛、季英華、吳元華、李方方、何自福、劉慧、李凡。1豆科蔬菜主要病毒病綠色綜合防控技術規(guī)程本標準規(guī)定了豆科蔬菜主要病毒病的術語和定義、發(fā)生流行規(guī)律、病害診斷、防治原則、防治方法、加強病蟲測報，實行統(tǒng)防統(tǒng)治、建立防治檔案等技術要求。本標準適用于豇豆、蠶豆、菜豆和豌豆等豆科蔬菜主要病毒病的綜合防控。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4285農(nóng)藥安全使用標準GB/T8321農(nóng)藥合理使用準則3術語和定義GB/T35333和界定的以及下列術語和定義適用于本文件。下列術語和定義適用于本標準。3.1綜合防控技術IntegratedPreventionandControlTechnology綜合防控是基于“預防為主、綜合防治”的植保方針，以確保農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量和農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境安全為目標，以減少農(nóng)藥使用為目的，優(yōu)先采取生態(tài)調(diào)控、生物防治、物理防治和科學用藥等資源節(jié)約型、環(huán)境友好型技術來控制農(nóng)作物病蟲害的植物保護措施。3.2豆科蔬菜LegumeVegetables豆科蔬菜主要包括豇豆、蠶豆、菜豆和豌豆等蔬菜。3.3病毒病VirusDisease即由植物病毒侵染引起的病害，具有寄生性、專一性或廣譜性等特性。3.4鑒別寄主DifferentialHost對特定病原物有特殊反應或表現(xiàn)特定癥狀的植物稱為鑒別寄主。3.5陽性對照PositiveControl2凡是確定可以出現(xiàn)預期結(jié)果的處理，稱為陽性對照。3.6陰性對照NegativeControl凡是確定不會出現(xiàn)預期結(jié)果的處理，稱為陰性對照。3.7空白對照BlankControl凡是不加處理因素的處理，稱為空白對照。4發(fā)生流行規(guī)律豆科蔬菜病毒病主要由黃瓜花葉病毒（Cucumbermosaicvirus，CMV）、煙草花葉病毒（Tobaccomosaicvirus，TMV）、蠶豆萎蔫病毒（Broadbeanwiltvirus，BBWV）、紫云英矮縮病毒（Milkvetchdvirus，MDV）等病毒引起。常表現(xiàn)為多種病毒的混合侵染。CMV、TMV和BBWV均可由蚜蟲或汁液接觸傳播，而MDV主要由蚜蟲以持久方式進行傳播。病毒可在多種植物上越冬，病殘體、帶毒種子均可成為病毒病的初侵染源。通過有翅蚜蟲遷飛傳播擴散蔓延，全年均可發(fā)病，以春秋季發(fā)病最為嚴重。整枝，打叉，搭架，采果等農(nóng)事活動中，只要造成寄主微創(chuàng)口，即可侵入危害。此外，土壤瘠薄、黏重、板結(jié)、排水不良和偏施氮肥都會加重病情發(fā)展。5病害診斷5.1病害田間診斷豆科植物感染病毒后，癥狀表型多樣，主要有花葉斑駁、明脈皺縮、矮化等類型癥狀。癥狀類型參見附錄A。5.2生物學檢測具體方法和檢測結(jié)果見附錄B。5.3血清學檢測具體方法和檢測結(jié)果見附錄B。5.4分子生物學檢測具體方法和檢測結(jié)果見附錄B。6防治原則根據(jù)豆科蔬菜病毒病和傳毒害蟲的發(fā)生規(guī)律及危害特點，本著“預防為主，綜合防治”的指導思想，從農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)整體出發(fā)，保護生物多樣性，控制生產(chǎn)環(huán)境，減少病毒來源，優(yōu)先選擇農(nóng)業(yè)防治、物理防治、生物防治技術，盡量減少化學農(nóng)藥的使用。7防治方法37.1農(nóng)業(yè)防治7.1.1種植抗病品種根據(jù)各地栽培條件選用抗病品種。7.1.2留種設立無病留種田，在留種田淘汰病株，減少毒源，從無病優(yōu)質(zhì)的良種株上采集種子。7.1.3種子消毒播種前將種子在清水中浸泡（蠶豆浸泡2~3d，豌豆1d，菜豆3~4h，豇豆不能浸種），再放入10%磷酸三鈉溶液中浸種20～30min，撈出后用清水沖洗干凈后播種；選用30%噻蟲嗪拌種；或者選用商品包衣種子。7.1.4合理輪作盡量避免與豆科作物重茬栽培，選用空茬地或倒茬地，與非豆科作物合理輪作。7.1.5田間衛(wèi)生清除田間及周邊雜草，加強肥水管理，及時摘除病葉，拔除病株。7.2物理防治7.2.1使用防蟲網(wǎng)大棚豆科蔬菜選擇60目以上的防蟲網(wǎng)。7.2.2色板誘殺對于矮桿豆科作物（豌豆、蠶豆等）可采用色板誘殺蚜蟲，在田間放置30cm×40cm的誘蟲黃板300~450塊/hm2，呈棋盤式均勻插置田間，黃板底部略高出植株頂端10~20cm左右，黃板粘滿害蟲后及時更換。7.3藥劑防治藥劑使用應符合GB4285和GB8321的相關規(guī)定。7.3.1病毒病防治病毒病防控以預防為主，當病情指數(shù)≥5%時，選擇使用高效、低毒、低殘留農(nóng)藥進行防治。由于豆科蔬菜，尤其是大棚內(nèi)種植，采收之前7~10d，必須停止用藥。防治病毒病常用藥劑的用量及用法見附錄C。7.3.2蚜蟲防治抓好早治蚜連續(xù)治蚜，減少蟲媒傳毒。當蚜株率≥5%時，優(yōu)先采用植物源農(nóng)藥，嚴禁使用禁用農(nóng)藥或高毒農(nóng)藥，防治蚜蟲常用藥劑的用量及用法見附錄C。8加強病蟲測報，實行統(tǒng)防統(tǒng)治4根據(jù)田間調(diào)查情況結(jié)合氣象因素分析，及時對病蟲害進行預測預報，當病蟲害達到影響經(jīng)濟閥值時，當?shù)卣畱M織種植戶對整片作物進行科學的病蟲害防治。9建立防治檔案在田間調(diào)查豆科病毒病發(fā)生情況時，具體調(diào)查內(nèi)容參見附錄D。5附錄A6或不結(jié)莢等癥狀(圖A4)。7目)撒到待接種葉的表面(也可直接將金剛砂加在研磨液中),在營養(yǎng)缽內(nèi)插上標簽，注明處理及時間；放于溫室(最好22~25℃)。用緩沖液接種植株作對照；將帶毒葉片用接種緩沖液研磨后采用摩擦汁液燥處理后，寫明標簽，存于-80℃冰箱。將經(jīng)分離純化后得到的不同病毒的病89LP2，12000rpm離心5min，取上清液，加入BufferLP3。加入吸附柱中，12000rpm離心1min。棄掉廢液，向收集管中加入BufferGW，12000rpm離心1min，重復1次。將吸附柱放入新離心管中，滴加100μLBufferGE，靜置5min，12000rpm離心1min，收集DNA溶液，-20℃保存?zhèn)溆?。B.3.2RT-PCR擴增（1）反轉(zhuǎn)錄以硅粒吸附法提取的總RNA為模板，選取隨機引物進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，具體反應體系及步驟見表B1。表B1病毒反轉(zhuǎn)錄體系試劑體積TotalRNARandomPrimer2×TSReactionMixRIEnzymeMixgDNARemover總體積20μL上述混合液25℃孵育10min，42℃孵育30min，85℃加熱5min，-20℃保存。（2）反應引物TMV、BBWV、CMV、MDV的特異性引物見表B2。表B2TMV、BBWV、CMV、MDV的特異性引物病毒名稱（前引/后引）引物序列片段長度ATTTAAGTGGASGGAAAAV(W=A或T；M=A/C；S=G/C,V=G/A)（3）反應體系TMV、BBWV、CMV特異性RT-PCR和MDV的PCR反應體系見表B3表B3TMV、BBWV、CMV特異性RT-PCR和MDV的PCR反應體系試劑體積10×Buffer2.0μL2.5mMdNTP酶0.3μLcDNA加水定容至20μL（4）反應程序TMV、BBWV、CMV特異性RT-PCR反應程序和MDV的PCR反應程序見表B4表B4TMV、BBWV、CMV特異性RT-PCR反應程序和MDV的PCR反應程序病毒名稱反應程序TMV94℃預變性4min，94℃,45s；55℃,45s；72℃,1min，35個循環(huán)；72℃延伸7min。BBWV94℃預變性4min，94℃,45s；56℃,45s；72℃,1min30s，35個循環(huán)7min。CMVMDV94℃預變性4min，94℃,45s；55℃,45s；72℃,1min，35個循環(huán)；72℃延伸7min。B.3.3瓊脂糖凝膠電泳1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，取5μL擴增反應物與2μLSYBRGreen?染料、3μLloadingbuffer混勻，點入樣孔內(nèi)。電泳緩沖液1×TAE適量，100V，電泳30min。B.3.4目的片段的克隆與分析電泳結(jié)束后，取出瓊脂糖凝膠，使用Alpha凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照記錄。擴增片段與預期目標條帶大小一致，則為陽性樣品，表明植物葉片中攜帶該病毒，結(jié)果見圖B5、圖B6、圖B7和圖B8。圖B5豆科作物攜帶BBWV的檢測圖B7豆科作物攜帶TMV的檢測4.0M異硫氰酸胍0.2MNaAc(pH5.2)25mMEDTA(pH8.0)2.5%(W/V)PVP-40（2）10%NLS將1g月桂酰醇（NLS）溶于10mL水中即得10%NLS溶液。（3）WB溶液1mMEDTA(pH8.0)20mMTris-HCl(pH7.5)10mMNaCl（4）NaI溶液6MNaI0.15MNa2SO3（5）硅溶液將60g二氧化硅溶于500mL水中，靜置24h，倒掉470mL上清，再加水至500mL，靜置5h，倒掉440mL上清，用HCl將剩下的60mL沉淀調(diào)pH值至2.0，高壓滅菌后，200μL/管分裝，-20℃保存。（規(guī)范性附錄）藥劑防治病毒病及傳毒害蟲一覽表表C1藥劑防治病毒病及傳毒害蟲一覽表防治對象防治農(nóng)藥使用劑量施用方法使用次數(shù)防治時期病毒病可濕性粉劑600g/hm2噴霧視病情嚴重情況，連續(xù)噴霧3~6次，間隔7~10d噴一次。病情指數(shù)≥5%0.5%菇類蛋白多糖水劑3L/hm2噴霧2%寧南霉素水劑14.4L/hm2噴霧1.5L/hm2噴霧沼澤紅假單胞菌懸浮劑3L/hm2噴霧嗜硫小紅卵菌懸浮劑3L/hm2噴霧蚜蟲10%溴氰蟲酰胺可分散油懸浮劑45g/hm2噴霧視病情嚴重情況，連續(xù)噴霧3~6次，間隔7~10d噴一次。蟲株率≥5%50%呋蟲胺可濕性粉劑90g/hm2噴霧10%氟啶蟲酰胺水分散粒劑60g/hm2噴霧25%噻蟲嗪水分散粒劑50g/hm2