TSPPHN 003-2024 豆科蔬菜主要病毒病綜合防控技術(shù)規(guī)程

ICS01.040.65CCSB15/19CodeofIntegralPreventionTechnologyoftheEpidemicLegumeVegetable湖南省植物保護(hù)學(xué)會(huì)發(fā)布I本文件是根據(jù)GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由湖南省植物保護(hù)學(xué)會(huì)提出。本文件由湖南省植物保護(hù)學(xué)會(huì)歸口。本文件起草單位為湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院、寧波大學(xué)、全國(guó)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心、沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所、江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所、廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院、云南農(nóng)業(yè)大學(xué)、山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。本文件主要起草人：劉勇、燕飛、張松柏、章東方、張卓、史曉斌、張德詠、孫書(shū)娥、嚴(yán)丹侃、鄭紅英、顧江濤、張海珊、張安盛、季英華、吳元華、李方方、何自福、劉慧、李凡。1豆科蔬菜主要病毒病綠色綜合防控技術(shù)規(guī)程本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豆科蔬菜主要病毒病的術(shù)語(yǔ)和定義、發(fā)生流行規(guī)律、病害診斷、防治原則、防治方法、加強(qiáng)病蟲(chóng)測(cè)報(bào)，實(shí)行統(tǒng)防統(tǒng)治、建立防治檔案等技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于豇豆、蠶豆、菜豆和豌豆等豆科蔬菜主要病毒病的綜合防控。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4285農(nóng)藥安全使用標(biāo)準(zhǔn)GB/T8321農(nóng)藥合理使用準(zhǔn)則3術(shù)語(yǔ)和定義GB/T35333和界定的以及下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3.1綜合防控技術(shù)IntegratedPreventionandControlTechnology綜合防控是基于“預(yù)防為主、綜合防治”的植保方針，以確保農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量和農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境安全為目標(biāo)，以減少農(nóng)藥使用為目的，優(yōu)先采取生態(tài)調(diào)控、生物防治、物理防治和科學(xué)用藥等資源節(jié)約型、環(huán)境友好型技術(shù)來(lái)控制農(nóng)作物病蟲(chóng)害的植物保護(hù)措施。3.2豆科蔬菜LegumeVegetables豆科蔬菜主要包括豇豆、蠶豆、菜豆和豌豆等蔬菜。3.3病毒病VirusDisease即由植物病毒侵染引起的病害，具有寄生性、專(zhuān)一性或廣譜性等特性。3.4鑒別寄主DifferentialHost對(duì)特定病原物有特殊反應(yīng)或表現(xiàn)特定癥狀的植物稱(chēng)為鑒別寄主。3.5陽(yáng)性對(duì)照PositiveControl2凡是確定可以出現(xiàn)預(yù)期結(jié)果的處理，稱(chēng)為陽(yáng)性對(duì)照。3.6陰性對(duì)照NegativeControl凡是確定不會(huì)出現(xiàn)預(yù)期結(jié)果的處理，稱(chēng)為陰性對(duì)照。3.7空白對(duì)照BlankControl凡是不加處理因素的處理，稱(chēng)為空白對(duì)照。4發(fā)生流行規(guī)律豆科蔬菜病毒病主要由黃瓜花葉病毒（Cucumbermosaicvirus，CMV）、煙草花葉病毒（Tobaccomosaicvirus，TMV）、蠶豆萎蔫病毒（Broadbeanwiltvirus，BBWV）、紫云英矮縮病毒（Milkvetchdvirus，MDV）等病毒引起。常表現(xiàn)為多種病毒的混合侵染。CMV、TMV和BBWV均可由蚜蟲(chóng)或汁液接觸傳播，而MDV主要由蚜蟲(chóng)以持久方式進(jìn)行傳播。病毒可在多種植物上越冬，病殘?bào)w、帶毒種子均可成為病毒病的初侵染源。通過(guò)有翅蚜蟲(chóng)遷飛傳播擴(kuò)散蔓延，全年均可發(fā)病，以春秋季發(fā)病最為嚴(yán)重。整枝，打叉，搭架，采果等農(nóng)事活動(dòng)中，只要造成寄主微創(chuàng)口，即可侵入危害。此外，土壤瘠薄、黏重、板結(jié)、排水不良和偏施氮肥都會(huì)加重病情發(fā)展。5病害診斷5.1病害田間診斷豆科植物感染病毒后，癥狀表型多樣，主要有花葉斑駁、明脈皺縮、矮化等類(lèi)型癥狀。癥狀類(lèi)型參見(jiàn)附錄A。5.2生物學(xué)檢測(cè)具體方法和檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)附錄B。5.3血清學(xué)檢測(cè)具體方法和檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)附錄B。5.4分子生物學(xué)檢測(cè)具體方法和檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)附錄B。6防治原則根據(jù)豆科蔬菜病毒病和傳毒害蟲(chóng)的發(fā)生規(guī)律及危害特點(diǎn)，本著“預(yù)防為主，綜合防治”的指導(dǎo)思想，從農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)整體出發(fā)，保護(hù)生物多樣性，控制生產(chǎn)環(huán)境，減少病毒來(lái)源，優(yōu)先選擇農(nóng)業(yè)防治、物理防治、生物防治技術(shù)，盡量減少化學(xué)農(nóng)藥的使用。7防治方法37.1農(nóng)業(yè)防治7.1.1種植抗病品種根據(jù)各地栽培條件選用抗病品種。7.1.2留種設(shè)立無(wú)病留種田，在留種田淘汰病株，減少毒源，從無(wú)病優(yōu)質(zhì)的良種株上采集種子。7.1.3種子消毒播種前將種子在清水中浸泡（蠶豆浸泡2~3d，豌豆1d，菜豆3~4h，豇豆不能浸種），再放入10%磷酸三鈉溶液中浸種20～30min，撈出后用清水沖洗干凈后播種；選用30%噻蟲(chóng)嗪拌種；或者選用商品包衣種子。7.1.4合理輪作盡量避免與豆科作物重茬栽培，選用空茬地或倒茬地，與非豆科作物合理輪作。7.1.5田間衛(wèi)生清除田間及周邊雜草，加強(qiáng)肥水管理，及時(shí)摘除病葉，拔除病株。7.2物理防治7.2.1使用防蟲(chóng)網(wǎng)大棚豆科蔬菜選擇60目以上的防蟲(chóng)網(wǎng)。7.2.2色板誘殺對(duì)于矮桿豆科作物（豌豆、蠶豆等）可采用色板誘殺蚜蟲(chóng)，在田間放置30cm×40cm的誘蟲(chóng)黃板300~450塊/hm2，呈棋盤(pán)式均勻插置田間，黃板底部略高出植株頂端10~20cm左右，黃板粘滿(mǎn)害蟲(chóng)后及時(shí)更換。7.3藥劑防治藥劑使用應(yīng)符合GB4285和GB8321的相關(guān)規(guī)定。7.3.1病毒病防治病毒病防控以預(yù)防為主，當(dāng)病情指數(shù)≥5%時(shí)，選擇使用高效、低毒、低殘留農(nóng)藥進(jìn)行防治。由于豆科蔬菜，尤其是大棚內(nèi)種植，采收之前7~10d，必須停止用藥。防治病毒病常用藥劑的用量及用法見(jiàn)附錄C。7.3.2蚜蟲(chóng)防治抓好早治蚜連續(xù)治蚜，減少蟲(chóng)媒傳毒。當(dāng)蚜株率≥5%時(shí)，優(yōu)先采用植物源農(nóng)藥，嚴(yán)禁使用禁用農(nóng)藥或高毒農(nóng)藥，防治蚜蟲(chóng)常用藥劑的用量及用法見(jiàn)附錄C。8加強(qiáng)病蟲(chóng)測(cè)報(bào)，實(shí)行統(tǒng)防統(tǒng)治4根據(jù)田間調(diào)查情況結(jié)合氣象因素分析，及時(shí)對(duì)病蟲(chóng)害進(jìn)行預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)，當(dāng)病蟲(chóng)害達(dá)到影響經(jīng)濟(jì)閥值時(shí)，當(dāng)?shù)卣畱?yīng)組織種植戶(hù)對(duì)整片作物進(jìn)行科學(xué)的病蟲(chóng)害防治。9建立防治檔案在田間調(diào)查豆科病毒病發(fā)生情況時(shí)，具體調(diào)查內(nèi)容參見(jiàn)附錄D。5附錄A6或不結(jié)莢等癥狀(圖A4)。7目)撒到待接種葉的表面(也可直接將金剛砂加在研磨液中),在營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi)插上標(biāo)簽，注明處理及時(shí)間；放于溫室(最好22~25℃)。用緩沖液接種植株作對(duì)照；將帶毒葉片用接種緩沖液研磨后采用摩擦汁液燥處理后，寫(xiě)明標(biāo)簽，存于-80℃冰箱。將經(jīng)分離純化后得到的不同病毒的病89LP2，12000rpm離心5min，取上清液，加入BufferLP3。加入吸附柱中，12000rpm離心1min。棄掉廢液，向收集管中加入BufferGW，12000rpm離心1min，重復(fù)1次。將吸附柱放入新離心管中，滴加100μLBufferGE，靜置5min，12000rpm離心1min，收集DNA溶液，-20℃保存?zhèn)溆?。B.3.2RT-PCR擴(kuò)增（1）反轉(zhuǎn)錄以硅粒吸附法提取的總RNA為模板，選取隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，具體反應(yīng)體系及步驟見(jiàn)表B1。表B1病毒反轉(zhuǎn)錄體系試劑體積TotalRNARandomPrimer2×TSReactionMixRIEnzymeMixgDNARemover總體積20μL上述混合液25℃孵育10min，42℃孵育30min，85℃加熱5min，-20℃保存。（2）反應(yīng)引物TMV、BBWV、CMV、MDV的特異性引物見(jiàn)表B2。表B2TMV、BBWV、CMV、MDV的特異性引物病毒名稱(chēng)（前引/后引）引物序列片段長(zhǎng)度ATTTAAGTGGASGGAAAAV(W=A或T；M=A/C；S=G/C,V=G/A)（3）反應(yīng)體系TMV、BBWV、CMV特異性RT-PCR和MDV的PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表B3表B3TMV、BBWV、CMV特異性RT-PCR和MDV的PCR反應(yīng)體系試劑體積10×Buffer2.0μL2.5mMdNTP酶0.3μLcDNA加水定容至20μL（4）反應(yīng)程序TMV、BBWV、CMV特異性RT-PCR反應(yīng)程序和MDV的PCR反應(yīng)程序見(jiàn)表B4表B4TMV、BBWV、CMV特異性RT-PCR反應(yīng)程序和MDV的PCR反應(yīng)程序病毒名稱(chēng)反應(yīng)程序TMV94℃預(yù)變性4min，94℃,45s；55℃,45s；72℃,1min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。BBWV94℃預(yù)變性4min，94℃,45s；56℃,45s；72℃,1min30s，35個(gè)循環(huán)7min。CMVMDV94℃預(yù)變性4min，94℃,45s；55℃,45s；72℃,1min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。B.3.3瓊脂糖凝膠電泳1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，取5μL擴(kuò)增反應(yīng)物與2μLSYBRGreen?染料、3μLloadingbuffer混勻，點(diǎn)入樣孔內(nèi)。電泳緩沖液1×TAE適量，100V，電泳30min。B.3.4目的片段的克隆與分析電泳結(jié)束后，取出瓊脂糖凝膠，使用Alpha凝膠成像系統(tǒng)觀(guān)察并拍照記錄。擴(kuò)增片段與預(yù)期目標(biāo)條帶大小一致，則為陽(yáng)性樣品，表明植物葉片中攜帶該病毒，結(jié)果見(jiàn)圖B5、圖B6、圖B7和圖B8。圖B5豆科作物攜帶BBWV的檢測(cè)圖B7豆科作物攜帶TMV的檢測(cè)4.0M異硫氰酸胍0.2MNaAc(pH5.2)25mMEDTA(pH8.0)2.5%(W/V)PVP-40（2）10%NLS將1g月桂酰醇（NLS）溶于10mL水中即得10%NLS溶液。（3）WB溶液1mMEDTA(pH8.0)20mMTris-HCl(pH7.5)10mMNaCl（4）NaI溶液6MNaI0.15MNa2SO3（5）硅溶液將60g二氧化硅溶于500mL水中，靜置24h，倒掉470mL上清，再加水至500mL，靜置5h，倒掉440mL上清，用HCl將剩下的60mL沉淀調(diào)pH值至2.0，高壓滅菌后，200μL/管分裝，-20℃保存。（規(guī)范性附錄）藥劑防治病毒病及傳毒害蟲(chóng)一覽表表C1藥劑防治病毒病及傳毒害蟲(chóng)一覽表防治對(duì)象防治農(nóng)藥使用劑量施用方法使用次數(shù)防治時(shí)期病毒病可濕性粉劑600g/hm2噴霧視病情嚴(yán)重情況，連續(xù)噴霧3~6次，間隔7~10d噴一次。病情指數(shù)≥5%0.5%菇類(lèi)蛋白多糖水劑3L/hm2噴霧2%寧南霉素水劑14.4L/hm2噴霧1.5L/hm2噴霧沼澤紅假單胞菌懸浮劑3L/hm2噴霧嗜硫小紅卵菌懸浮劑3L/hm2噴霧蚜蟲(chóng)10%溴氰蟲(chóng)酰胺可分散油懸浮劑45g/hm2噴霧視病情嚴(yán)重情況，連續(xù)噴霧3~6次，間隔7~10d噴一次。蟲(chóng)株率≥5%50%呋蟲(chóng)胺可濕性粉劑90g/hm2噴霧10%氟啶蟲(chóng)酰胺水分散粒劑60g/hm2噴霧25%噻蟲(chóng)嗪水分散粒劑50g/hm2