DB37T 4754.1-2024動(dòng)物疫病鑒別檢測(cè)技術(shù) 第1部分：豬瘟強(qiáng)毒與豬瘟疫苗弱毒

37Animaldiseaseidentificationanddet本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。動(dòng)物疫病是影響山東省畜牧業(yè)健康發(fā)展的重要因素之一。不同病原或者相同病原的不同血清型/基疫病鑒別檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)的建立，規(guī)定了對(duì)不同病原、相同病原的不同血清型/基因型以及弱毒疫苗株的鑒別檢測(cè)，為山東省動(dòng)物疫病精準(zhǔn)防控提供了技術(shù)支持，對(duì)于促進(jìn)畜牧業(yè)健康發(fā)展具有重要意豬瘟病毒（Classicalswinefever，CSFV）屬于黃病毒科瘟病毒屬成員，是引起豬瘟的病原體。的健康發(fā)展發(fā)揮引領(lǐng)和示范作用。本標(biāo)準(zhǔn)制定后，作為《動(dòng)物疫病鑒別檢測(cè)技術(shù)》的1部分，《動(dòng)物疫技術(shù)的操作，便于檢測(cè)技術(shù)在禽腺病毒病臨床診斷、流行病學(xué)調(diào)查、檢驗(yàn)檢疫等方面的穩(wěn)定動(dòng)物疫病鑒別檢測(cè)技術(shù)第1部分：豬瘟強(qiáng)毒與豬瘟疫苗弱毒GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范本文件通過(guò)特異性引物，在RT-PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增出了豬瘟疫苗弱毒126的產(chǎn)物，當(dāng)SYBRGreenI熒光染料信號(hào)急劇減弱，不同DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，Tm值不同，通過(guò)Tm值的差取1mLDEPC加入水至1000mL，充分震蕩混勻，靜置24h后，121℃高壓滅菌15min，2℃~8℃保加濃鹽酸將pH調(diào)節(jié)至7.4，加水定容至1000mL，121℃高壓滅菌15min，2℃~8℃保存?zhèn)溆谩?.6引物：引物名稱和序列見附錄A。5.7商品化病毒核酸提取試劑盒。5.8商品化一步法熒光RT-PCR反應(yīng)試劑。5.9豬瘟疫苗弱毒陽(yáng)性對(duì)照：市售商品化豬瘟兔化弱毒疫苗（傳代細(xì)胞源）。5.11豬瘟強(qiáng)毒陽(yáng)性對(duì)照：含有豬瘟強(qiáng)毒株擴(kuò)增目的基因的陽(yáng)性質(zhì)粒。5.13飲用水：清潔、無(wú)異味，pH值在6.5～8.56.8干熱滅菌器。7.2采樣7.2.2扁桃體樣品：鼻鉗子固定活豬上顎，用開口器打開口腔，用采樣槍采集扁桃體，滅菌牙簽挑至7.2.3內(nèi)臟樣品：采集病死或安樂死的豬、兔各種內(nèi)臟器官（脾臟、淋巴結(jié)7.3樣品的運(yùn)輸及保存7.3.1運(yùn)輸：采集的樣品密封后，采用保溫箱加冰密封，在2℃~8℃條件下24h內(nèi)運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。8.2核酸抽提在各設(shè)定的熒光RT-PCR管中分別加入陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和提取的試樣溶液2μL勻，瞬時(shí)離心1min。9結(jié)果判定9.1.1豬瘟病毒疫苗弱毒9.1.1.1陰性對(duì)照：無(wú)Ct值，無(wú)典型擴(kuò)增曲線，在熔解曲9.1.1.2陽(yáng)性對(duì)照：Ct值＜30.0，并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，且熔解曲線Tm值在81.5℃±0.5℃出現(xiàn)9.1.2豬瘟病毒強(qiáng)毒9.1.2.1陰性對(duì)照：無(wú)Ct值，無(wú)典型擴(kuò)增曲線，在熔解曲9.1.2.2陽(yáng)性對(duì)照：Ct值＜30.0，并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，且熔解曲線Tm值在83.3℃±0.9℃出現(xiàn)9.2.1豬瘟病毒疫苗弱毒9.2.1.1若檢測(cè)樣品無(wú)Ct值并且無(wú)典型的9.2.1.2若檢測(cè)樣品Ct值≤30.0，出現(xiàn)典型的9.2.1.3若檢測(cè)樣品30.0＜Ct值≤35.09.2.2豬瘟病毒強(qiáng)毒9.2.2.1若檢測(cè)樣品無(wú)Ct值并且無(wú)典型的9.2.2.2若檢測(cè)樣品Ct值≤30.0，出現(xiàn)典型的9.2.2.3若檢測(cè)樣品30.0＜Ct值≤35.0ACTATTCTGTAACCTGTCTCA2×OneStepTBGreenRT-PrimeScriptRTEnzymeExTaqHS（5U