第八章動植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

第八章動植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

第一節(jié)動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)第二節(jié)植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)知識目標(biāo)1.掌握動植物細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)。2.掌握動植物培養(yǎng)生物反應(yīng)器的類型。3.了解動植物細(xì)胞培養(yǎng)在生物制藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。能力目標(biāo)1.掌握主要的動植物細(xì)胞培養(yǎng)方式。2.掌握培養(yǎng)基的組成、制備、細(xì)胞培養(yǎng)過程的檢測等基本操作。3第一節(jié)動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)一、動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)概述二、動物細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)和方法三、動物細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境要求四、動物細(xì)胞生物反應(yīng)器五、動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)4一、動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)概述

1.動物細(xì)胞的形態(tài)2.動物細(xì)胞的生理特點(diǎn)3.動物細(xì)胞培養(yǎng)的主要特點(diǎn)4.生產(chǎn)用動物細(xì)胞系5.動物細(xì)胞的冷凍保存6.動物細(xì)胞培養(yǎng)基的種類和組成5

動物細(xì)胞培養(yǎng)（animalcellculture）是用無菌操作的方法從動物體分離得到細(xì)胞，將它們置于模擬動物體內(nèi)生理?xiàng)l件的人工環(huán)境中，在體外進(jìn)行培養(yǎng)并使其繼續(xù)生長的過程。人們借以該技術(shù)可以觀察細(xì)胞的生長、繁殖、細(xì)胞分化以及細(xì)胞衰老等生命現(xiàn)象。動物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)物可以是單個(gè)細(xì)胞，也可以是細(xì)胞群。動物細(xì)胞培養(yǎng)已廣泛應(yīng)用于病毒學(xué)，免疫學(xué)，遺傳學(xué)，腫瘤學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)，毒理學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域。利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)生產(chǎn)出了多種生物制品，如狂犬病疫苗，干擾素，生長調(diào)節(jié)素。擾素，生長調(diào)節(jié)素。動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展1907年，哈里森（Harrison）在無菌條件下用淋巴液作培養(yǎng)基，培養(yǎng)蛙胚神經(jīng)組織存活數(shù)周，并觀察到神經(jīng)細(xì)胞突起的生長過程，由此創(chuàng)建了蓋片覆蓋凹窩玻璃懸滴培養(yǎng)法，奠定了動物組織體外培養(yǎng)的基礎(chǔ)。之后，又有人將懸滴培養(yǎng)法改良為雙蓋片培養(yǎng)，提高了傳代效率并減少了污染。1923年，卡雷爾（Carrel）設(shè)計(jì)了卡氏瓶培養(yǎng)法，擴(kuò)大了組織生存空間。1951年，厄爾（Earle）發(fā)明了體外培養(yǎng)動物細(xì)胞的人工合成培養(yǎng)基。1951年，波米拉（Pomerat）設(shè)計(jì)了灌流小室，使細(xì)胞生活在不斷更新的培養(yǎng)液中，便于作顯微攝影和細(xì)胞代謝的研究。1957年，格拉夫（Graff）用灌注培養(yǎng)法創(chuàng)造了懸浮細(xì)胞培養(yǎng)史上絕無僅有的1×1010～2×1010細(xì)胞/L的記錄，標(biāo)志著現(xiàn)代灌注概念的誕生。進(jìn)一步提高了細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的效率。1957年，杜爾貝科（Dulbecco）等人采用胰蛋白酶消化處理和應(yīng)用液體培養(yǎng)基的方法，獲得了單層細(xì)胞培養(yǎng)。1962年，Capstile成功大規(guī)模懸浮培養(yǎng)小鼠腎細(xì)胞（BHK），標(biāo)志著動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的起步。1967年，VanWezel用DEAE-SephadexA50為載體培養(yǎng)動物細(xì)胞獲得成功。1975年，Sato等在培養(yǎng)基中用激素代替血清使垂體細(xì)胞株GH3在無血清介質(zhì)中生長獲得成功，預(yù)示著無血清培養(yǎng)技術(shù)的誘人前景。1975年，Kobhler和Milstein成功融合了小鼠B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞而產(chǎn)生能分泌穩(wěn)定單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。1986年，DemoBiotech公司首次用微囊化技術(shù)大規(guī)模培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)單抗獲得成功。1989年，Konstantinovti首次提出大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)過程中的生理狀態(tài)控制，更新了傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)工藝中優(yōu)化控制理論。1.動物細(xì)胞的形態(tài)2.動物細(xì)胞的生理特點(diǎn)⑴分裂期長，可達(dá)12～48h，同一種屬不同部位的細(xì)胞分裂期長短也不相同，分裂期長短受培養(yǎng)條件的影響，如溫度、酸度、成分等。⑵細(xì)胞生長需貼附于基質(zhì)，并有接觸抑制現(xiàn)象。⑶正常二倍體細(xì)胞的壽命是有限的。⑷動物細(xì)胞對周圍環(huán)境十分敏感。⑸動物細(xì)胞對培養(yǎng)基要求很高。⑹動物細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成途徑和修飾功能與細(xì)菌不同。動物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞生產(chǎn)藥物的缺點(diǎn)是培養(yǎng)條件要求高、成本高、產(chǎn)量低；優(yōu)點(diǎn)是多半可分泌到細(xì)胞外，提取純化方便，蛋白質(zhì)經(jīng)糖基化修飾后與天然產(chǎn)物更接近，適合于臨床應(yīng)用。3.動物細(xì)胞培養(yǎng)的主要特點(diǎn)⑴污染概率大⑵營養(yǎng)成分要求高⑶培養(yǎng)環(huán)境適應(yīng)差⑷培養(yǎng)條件要求嚴(yán)格⑸代謝廢物毒性大⑹檢測控制指標(biāo)多⑺載體生長依賴強(qiáng)4.生產(chǎn)用動物細(xì)胞系生產(chǎn)用動物細(xì)胞是按生產(chǎn)條件選擇、馴化、適于大量培養(yǎng)，用于生產(chǎn)制備生物制劑的動物細(xì)胞。用于動物細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞系主要有四類，即原代細(xì)胞、二倍體細(xì)胞、連續(xù)細(xì)胞系、融合細(xì)胞和重組細(xì)胞系。細(xì)胞系（cellline）指原代細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后所繁殖的細(xì)胞群體。其中能夠連續(xù)傳代的細(xì)胞叫做連續(xù)細(xì)胞系或無限細(xì)胞系，不能連續(xù)培養(yǎng)的稱為有限細(xì)胞系。大多數(shù)二倍體細(xì)胞為有限細(xì)胞系。通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志物的培養(yǎng)物稱為細(xì)胞株（CellStrain），也就是說，細(xì)胞株是用單細(xì)胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法，由單細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群。細(xì)胞株的特殊性質(zhì)或標(biāo)志必須在整個(gè)培養(yǎng)期間始終存在。（1）原代細(xì)胞系原代細(xì)胞是指從機(jī)體取出后立即培養(yǎng)的細(xì)胞。有人把培養(yǎng)的第1代細(xì)胞與傳10代以內(nèi)的細(xì)胞統(tǒng)稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。特點(diǎn)：細(xì)胞分裂增殖不旺盛，與體內(nèi)細(xì)胞相似。應(yīng)用：藥物檢測實(shí)驗(yàn)，藥理研究。生產(chǎn)用的最多的是雞胚細(xì)胞、原代兔腎或鼠腎細(xì)胞，以及血液淋巴細(xì)胞等。（2）二倍體細(xì)胞系二倍體細(xì)胞系是原代細(xì)胞經(jīng)過傳代、篩選、克隆，從多種細(xì)胞成分的組織中挑選出來的具有某種特征的細(xì)胞株。該細(xì)胞仍具有“正?！奔?xì)胞的特點(diǎn)，即①染色體組是2n的核型；②具有明顯的貼壁依賴和接觸抑制的特性；③只有有限增殖能力，一般可連續(xù)傳代培養(yǎng)50代；④無致瘤性。廣泛用于生產(chǎn)的二倍體細(xì)胞系有WI-38、MRC-5和2BS等。WI-38細(xì)胞是人二倍體細(xì)胞系，成纖維細(xì)胞，能產(chǎn)生膠原，倍增時(shí)間為24小時(shí)，有限壽命50代，用于制備疫苗。MRC-5：人二倍體細(xì)胞系，成纖維細(xì)胞，有限壽命42～46代，用于制備疫苗。（3）連續(xù)細(xì)胞系連續(xù)細(xì)胞系:從正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來，分化不成熟的、獲得了無限增殖能力的一種細(xì)胞株。常常由于染色體的斷裂而變成異倍體，并失去正常細(xì)胞的特點(diǎn)。傳代細(xì)胞在長期培養(yǎng)中，由于自發(fā)或人為方法可獲得無限增殖能力。此外，直接從腫瘤組織建立的細(xì)胞系也是轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。由于轉(zhuǎn)化的細(xì)胞具有無限的生命力，而且倍增時(shí)間常常較短，對培養(yǎng)條件和生長因子要求較低，故適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。近年來用于生產(chǎn)的這種細(xì)胞有Namalwa、CHO、BHK-21和Vero細(xì)胞。CHO-K1：從中國地鼠卵巢中分離的上皮樣細(xì)胞，用于構(gòu)建工程細(xì)胞。BHK-21：從地鼠幼鼠的腎臟中分離。成纖維樣細(xì)胞，用于構(gòu)建工程菌，可生產(chǎn)疫苗。Vero：從非洲綠猴腎中分離，貼壁依賴的成纖維細(xì)胞，用于制備疫苗。Namalwa：從淋巴瘤病人分離，生產(chǎn)干擾素。（4）基因工程細(xì)胞系基因工程細(xì)胞系指采用基因工程技術(shù)或細(xì)胞融合技術(shù)對宿主細(xì)胞的遺傳物質(zhì)進(jìn)行修飾改造或重組，獲得具有穩(wěn)定遺傳的獨(dú)特性狀的細(xì)胞系。隨著細(xì)胞融合和基因重組技術(shù)的發(fā)展，已有多種有生物活性的基因重組蛋白在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)的研究和應(yīng)用中發(fā)揮越來越重要的作用，并產(chǎn)生巨大的效益。人們通過基因工程技術(shù)，把編碼蛋白質(zhì)的基因在分子的水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)、改造、重組，再轉(zhuǎn)移到新的宿主細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行復(fù)制、表達(dá)和折疊，以產(chǎn)生新的功能蛋白。這種在基因水平上進(jìn)行操作構(gòu)建的細(xì)胞，稱為基因工程細(xì)胞系。5.動物細(xì)胞的冷凍保存冷凍保存：將體外培養(yǎng)物或生物活性材料懸浮在加有或不加冷凍保護(hù)劑的溶液中，以一定的冷凍速率降至零下某一溫度（一般是低于-70℃的超低溫條件），并在此溫度下對其長期保存的過程。復(fù)蘇：以一定的復(fù)溫速率將凍存的體外培養(yǎng)物或生物活性材料恢復(fù)到常溫的過程。在低于-70℃的超低溫條件下，有機(jī)體細(xì)胞內(nèi)部的生化反應(yīng)極其緩慢，甚至終止。當(dāng)以適當(dāng)?shù)姆椒▽龃娴纳锊牧匣謴?fù)至常溫時(shí)，其內(nèi)部的生化反應(yīng)可恢復(fù)正常。冷凍保護(hù)劑是指可以保護(hù)細(xì)胞免受冷凍損傷的物質(zhì)。冷凍保護(hù)劑常常配制成一定的溶液。冷凍保護(hù)劑可分為滲透性和非滲透性兩類。滲透性冷凍保護(hù)劑可以滲透到細(xì)胞內(nèi)，一般是一些小分子物質(zhì)，主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。凍存時(shí)DMSO平衡多在4℃下進(jìn)行，一般需要40～60分鐘。非滲透性冷凍保護(hù)劑不能滲透到細(xì)胞內(nèi)，一般是些大分子物質(zhì)，主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羥乙基淀粉等。不同的冷凍保護(hù)劑有不同的優(yōu)、缺點(diǎn)。目前一般多采用聯(lián)合使用兩種以上冷凍保護(hù)劑組成保護(hù)液。由于許多冷凍保護(hù)劑（如DMSO）在低溫下能保護(hù)細(xì)胞，但在常溫下卻對細(xì)胞有害，故在細(xì)胞復(fù)溫后應(yīng)及時(shí)洗滌冷凍保護(hù)劑。6.動物細(xì)胞培養(yǎng)基的種類和組成（1）天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基是指來自動物體液或利用組織分離提取的一類培養(yǎng)基，如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等。組織培養(yǎng)技術(shù)建立早期，體外培養(yǎng)細(xì)胞都是利用天然培養(yǎng)基。由于天然培養(yǎng)基制作過程復(fù)雜、批間差異大，因此逐漸為合成培養(yǎng)基所替代。目前廣泛使用的天然培養(yǎng)基是血清，另外各種組織提取液、促進(jìn)細(xì)胞貼壁的膠原類物質(zhì)在培養(yǎng)某些特殊細(xì)胞也是必不可少。其優(yōu)點(diǎn)是營養(yǎng)成分豐富、培養(yǎng)效果好；缺點(diǎn)是成分復(fù)雜、個(gè)體差異大、來源有限。天然培養(yǎng)基的種類主要包括生物性體液（如血清）、組織浸出液（如胚胎浸出液）、凝固劑（如血漿）、水解乳蛋白等。（2）合成培養(yǎng)基

組成穩(wěn)定，可大量生產(chǎn)供應(yīng)。成分為氨基酸、維生素、糖類（碳源）、無機(jī)鹽、其他（前體和氧化還原劑）。合成培養(yǎng)基中除了各種營養(yǎng)成分外，還需添加5%～10%的小牛血清，才能使細(xì)胞很好地增殖。血清主要作用：提供基本營養(yǎng)物質(zhì)；提供激素和各種生長因子；提供結(jié)合蛋白；提供促接觸和伸展因子使細(xì)胞貼壁免受機(jī)械損傷；對培養(yǎng)中的細(xì)胞起到某些保護(hù)作用。合成培養(yǎng)基是根據(jù)天然培養(yǎng)基的成分，用化學(xué)物質(zhì)對細(xì)胞體內(nèi)生存環(huán)境中已知物質(zhì)在體外人工條件的模擬，經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)篩選、強(qiáng)化和重新組合后形成的培養(yǎng)基。合成培養(yǎng)基既能給細(xì)胞提供一個(gè)近似于體內(nèi)的生存環(huán)境，又便于控制和提供標(biāo)準(zhǔn)化體外生存環(huán)境。（3）無血清培養(yǎng)基

無血清培養(yǎng)基提高了細(xì)胞培養(yǎng)的可重復(fù)性，避免了血清差異所帶來的細(xì)胞差異；減少了由血清帶來的病毒、真菌和支原體等微生物污染的危險(xiǎn)；供應(yīng)充足、穩(wěn)定；細(xì)胞產(chǎn)品易于純化；避免了血清中某些因素對有些細(xì)胞的毒性；減少了血清中蛋白對某些生物測定的干擾，便于結(jié)果分析。無血清培養(yǎng)基在天然或合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加激素、生長因子、結(jié)合蛋白、貼附和伸展因子及其他元素。二、動物細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)和方法（一）動物細(xì)胞的原代培養(yǎng)技術(shù)（二）動物細(xì)胞的傳代培養(yǎng)技術(shù)（一）動物細(xì)胞的原代培養(yǎng)技術(shù)1.組織塊培養(yǎng)法組織塊培養(yǎng)法是將組織剪成小塊后，接種于培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)。是常用的、簡便易行的以及成功率較高的原代培養(yǎng)方法，可根據(jù)不同細(xì)胞生長需求要將培養(yǎng)瓶做適當(dāng)處理。優(yōu)點(diǎn)：操作方便，部分種類的組織細(xì)胞在小塊貼壁培養(yǎng)24h后，細(xì)胞就從組織塊四周游出。缺點(diǎn)：由于反復(fù)剪切和接種過程中對組織塊的損傷，并不是每個(gè)小塊都能長出細(xì)胞。細(xì)胞生長緩慢，耗時(shí)較長。組織塊培養(yǎng)法特別適合于組織量少的原代培養(yǎng)。組織塊原代培養(yǎng)法操作方法①將組織剪成或切成1mm3大小的小塊，并加入少許培養(yǎng)基使組織濕潤。②將小塊均勻涂布于瓶壁，每小塊間距0.2cm～0.5cm，一般在25mL培養(yǎng)瓶（底面積為17.5cm2）可接種20～30小塊為宜，小塊放置后，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使瓶底朝上，然后于瓶內(nèi)加入適量培養(yǎng)基蓋好瓶塞，將瓶傾斜放置在37℃溫箱內(nèi)。③培養(yǎng)24h，待小塊貼附后，將培養(yǎng)瓶緩慢翻轉(zhuǎn)平放，靜置培養(yǎng)，動作要輕，嚴(yán)禁搖動和來回振蕩，以防由于沖動而使小塊漂起而造成培養(yǎng)失敗，若組織塊不易貼壁可預(yù)先在瓶壁涂一薄層血清、胎汁或鼠尾膠原等。開始培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基不宜多，以保持組織塊濕潤即可，培養(yǎng)24小時(shí)后再補(bǔ)液，培養(yǎng)初期移動和觀察時(shí)要輕拿輕放，開始幾天盡量不去搬動，以利貼壁和生長，培養(yǎng)3~～5天時(shí)可換液，一方面補(bǔ)充營養(yǎng)，一方面去除代謝產(chǎn)物和漂浮小塊所產(chǎn)生的毒性作用。注意事項(xiàng)組織塊接種后1-3天，由于游出細(xì)胞數(shù)量較少，組織塊粘貼不牢固，在觀察和移動過程中要注意輕拿輕放，盡量不要引起液體的流動而產(chǎn)生對組織塊的沖擊力使其漂浮。原代培養(yǎng)3-5天后，需換液一次，因?yàn)橐哑〉慕M織塊和很多細(xì)胞碎片含有有毒物質(zhì)，影響原代細(xì)胞的生長，要及時(shí)清除。2.消化培養(yǎng)法消化培養(yǎng)法是采用組織消化分散法將細(xì)胞間質(zhì)包括基質(zhì)、纖維等妨礙細(xì)胞生長的物質(zhì)去除，使細(xì)胞分散，形成懸液，從而易用于從外界吸收養(yǎng)分和排出代謝產(chǎn)物。優(yōu)點(diǎn)：快速得到大量活細(xì)胞，細(xì)胞也能在短時(shí)間內(nèi)生長成片，適用于培養(yǎng)大量組織，原代細(xì)胞產(chǎn)量高。缺點(diǎn)：步驟繁瑣、易污染，一些消化酶價(jià)格昂貴，實(shí)驗(yàn)成本高。消化培養(yǎng)法的基本步驟操作方法①按消化分離法獲得細(xì)胞②在消化過程中，可隨時(shí)吸取少量消化液在鏡下觀察，如發(fā)現(xiàn)組織已分散成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞，則終止消化。如有組織塊，可用孔徑適當(dāng)?shù)暮Y網(wǎng)將其濾掉。大組織可加入新的消化液繼續(xù)消化。③將已過濾的消化液以800-1000r/min低速離心后，棄上清液，加含血清的培養(yǎng)液，輕輕吹打形成懸浮液。細(xì)胞計(jì)數(shù)后，接種細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置5%CO2溫箱培養(yǎng)。④某些特殊類型細(xì)胞，如內(nèi)皮細(xì)胞、骨髓細(xì)胞等，需用特殊消化手段和步驟進(jìn)行。（二）動物細(xì)胞傳代培養(yǎng)技術(shù)1.原代培養(yǎng)的首次傳代使原代細(xì)胞經(jīng)分散接種的過程稱之為傳代。每進(jìn)行一次分離再培養(yǎng)稱之為傳一代，傳至5～10代以內(nèi)的細(xì)胞通常稱為次代培養(yǎng)細(xì)胞，傳至10～20代以上的細(xì)胞，通常確定為傳代細(xì)胞（或稱傳代細(xì)胞系）。傳代細(xì)胞系的建立，關(guān)鍵是初代培養(yǎng)的首次傳代。應(yīng)注意如下幾點(diǎn)：（1）細(xì)胞生長密度不高時(shí)，或未能達(dá)到覆蓋整個(gè)瓶底時(shí)不能急于傳代。（2）原代培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞多為混雜細(xì)胞，形態(tài)各異，往往是上皮樣細(xì)胞和成纖維樣細(xì)胞并存，采用胰蛋白酶消化時(shí)要掌握好消化時(shí)間，因成纖維細(xì)胞易于脫壁，上皮細(xì)胞不易脫壁，因此，可根據(jù)需要選用適當(dāng)?shù)南瘯r(shí)間及時(shí)中止消化。在早先傳代時(shí)，其消化時(shí)間比一般已建系的細(xì)胞相對長一些。（3）吹打已消化的細(xì)胞要輕巧，既不能聽到有明顯的吹打聲，又不能有大量泡沫在懸液中形成，以盡可能減少對細(xì)胞的機(jī)械損傷。（4）首次傳代時(shí)細(xì)胞接種數(shù)量要多一些，以利于細(xì)胞的生存和繁殖。如果消化分離的細(xì)胞懸液有組織塊，也一并傳入到培養(yǎng)瓶，盡量減少細(xì)胞損失。（5）首次傳代培養(yǎng)時(shí)的pH不能高，寧可偏低一些。此外，小牛血清濃度可適當(dāng)加大至15%~20%左右。2.細(xì)胞傳代方法（1）貼壁生長的消化傳代①吸棄或倒掉瓶內(nèi)陳舊培養(yǎng)液。②在培養(yǎng)瓶內(nèi)加入適量消化液。③消化2～5min后吧培養(yǎng)瓶放置于顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大后，應(yīng)立即停止消化。④吸除或倒掉消化液。⑤用吸管吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，按順序反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，從培養(yǎng)瓶底部一邊開始到另一邊結(jié)束，以確保所有底部都被吹到。⑥計(jì)數(shù)后，按要求的接種量接種在新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。（2）懸浮細(xì)胞的傳代①直接傳代使懸浮細(xì)胞慢慢沉淀瓶底，吸掉1/2～1/3的上清液，用吸管吹打形成細(xì)胞懸浮液后再傳代。②離心收集細(xì)胞后傳代將細(xì)胞連同培養(yǎng)液一并轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以8001000r/min離心5min，棄上清液，加入新的培養(yǎng)液到離心管內(nèi)，用吸管輕輕吹打使之形成細(xì)胞懸液，然后傳代接種。懸浮細(xì)胞多采用此法。3.細(xì)胞系的維持(1)細(xì)胞檔案細(xì)胞檔案要記錄好，如組織來源、生物學(xué)特性（由形態(tài)、生長繁殖曲線、染色體核型情況、代謝特性、分化特性、病毒敏感性、致瘤特性、有無支原體和潛存病毒等）、培養(yǎng)基的要求、傳代換液時(shí)間、擴(kuò)增時(shí)間（分裂指數(shù)），細(xì)胞的特殊遺傳標(biāo)志（標(biāo)記染色體）等，這些記錄對于保證細(xì)胞的正常生長，保持細(xì)胞的一致和經(jīng)長期培養(yǎng)細(xì)胞特性的變異比較，都有十分重要的意義。(2)遵從細(xì)胞生長的規(guī)律性細(xì)胞系的傳代、換液方法一般都有自身的規(guī)律性，因而在繼續(xù)傳代時(shí)，要注意保持其穩(wěn)定的規(guī)律性，這樣可以減少由于傳代時(shí)細(xì)胞密度的頻繁增減或換液時(shí)間的不規(guī)律而導(dǎo)致細(xì)胞生長特性的改變，給以后的實(shí)驗(yàn)帶來影響。(3)防止細(xì)胞間交叉感染多種細(xì)胞系維持傳代，要嚴(yán)格操作程序，對所用的試劑各系不能交叉。每傳5代后，細(xì)胞種子均應(yīng)凍存。傳代時(shí)均應(yīng)作好記錄，培養(yǎng)瓶上要有明顯標(biāo)記，標(biāo)記細(xì)胞系名稱和傳代的代數(shù)及傳代時(shí)間。(4)及時(shí)凍存防丟失細(xì)胞種子的及時(shí)凍存不僅可防止污染丟失，而且還可防止因盲目傳代而造成細(xì)胞變異，此外還可提供不同代次的細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行對比試驗(yàn)。（5）細(xì)胞系（或株）的鑒定和管理三、動物細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境要求主要有細(xì)胞生長的支持物、氣體交換、培養(yǎng)溫度、pH值、滲透壓及其他因素等方面。1.支持物（1）玻璃很便宜，容易洗滌，且不損失支持生長的性質(zhì)，可方便地用于干熱和濕熱滅菌，透光性好，強(qiáng)堿可使玻璃對培養(yǎng)產(chǎn)生不良影響，但用酸洗中和后即可。（2）塑料制品細(xì)胞培養(yǎng)用的塑料用品要用γ射線、化學(xué)藥品或電弧處理使之產(chǎn)生帶電荷的表面，具有可濕潤性。（3）微載體材料有聚苯乙烯、交聯(lián)葡萄糖、聚丙烯酰胺、纖維素衍生物、幾丁質(zhì)、明膠等。優(yōu)點(diǎn)是使貼壁細(xì)胞可以像懸浮培養(yǎng)那樣進(jìn)行。2.氣體交換（1）氧氣氧參與三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生能量供給細(xì)胞生長、增殖以及合成各種成分。一些細(xì)胞在缺氧情況下，借糖酵解也可獲取能量，但多數(shù)細(xì)胞缺氧不能生存。在開放培養(yǎng)時(shí)，一般置細(xì)胞于95％空氣加5％二氧化碳的混合氣體環(huán)境中培養(yǎng)。（2）二氧化碳二氧化碳既是細(xì)胞代謝產(chǎn)物，也是細(xì)胞所需成分，它主要與維持培養(yǎng)基的pH有直接關(guān)系。動物細(xì)胞大多數(shù)需要輕微的堿性條件，pH值約在7.2～7.4，在細(xì)胞生長過程中，隨細(xì)胞數(shù)量的增多和代謝活動的加強(qiáng)，二氧化碳不斷被釋放，培養(yǎng)液變酸，pH值發(fā)生變化。由于NaHCO3容易分解為二氧化碳，很不穩(wěn)定，致使緩沖系統(tǒng)難以精確地控制。故這一緩沖系統(tǒng)適合密閉培養(yǎng)。3.培養(yǎng)溫度哺乳動物及人源細(xì)胞最適培養(yǎng)溫度為35℃～37℃，對低溫耐受力比高溫強(qiáng)。39℃以上受損→死亡；不低于0℃時(shí)（0℃～34℃），細(xì)胞能生存，但代謝降低、分裂延緩。溫度調(diào)節(jié)的范圍最大不超過±0.5℃。4.pH值合適的pH值是細(xì)胞生存的必要條件之一，動物細(xì)胞合適的pH值一般在7.2～7.4，低于6.8或高于7.6都對細(xì)胞產(chǎn)生不利影響，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致細(xì)胞退變或死亡。維持細(xì)胞生存環(huán)境中的pH值至關(guān)重要，最常用的方法是加磷酸緩沖液，緩沖液中碳酸氫鈉具有調(diào)節(jié)CO2的作用。由于容易從環(huán)境中逸出，故只適用于封閉式培養(yǎng)。為克服碳酸氫鈉的缺點(diǎn)，有時(shí)采用羥乙基哌嗪乙烷硝酸（HEPES），它對細(xì)胞無作用，主要防止pH值迅速波動，具有較強(qiáng)的穩(wěn)定培養(yǎng)基pH值的能力。5.滲透壓細(xì)胞必須生活在等滲環(huán)境中，大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞對滲透壓有一定耐受性。人血漿滲透壓290mOsm/kg,可視為培養(yǎng)人體細(xì)胞的理想滲透壓。鼠細(xì)胞滲透壓在320mOsm/kg左右。對于大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞，滲透壓在260～320mOsm/kg的范圍都適宜。四、動物細(xì)胞生物反應(yīng)器（一）生物反應(yīng)器的分類目前，動物細(xì)胞培養(yǎng)用生物反應(yīng)器主要包括：轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)器、塑料袋增殖器、填充床反應(yīng)器、多層板反應(yīng)器、螺旋膜反應(yīng)器、管式螺旋反應(yīng)器、陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀反應(yīng)器、流化床反應(yīng)器、中空纖維及其它膜式反應(yīng)器、攪拌反應(yīng)器、氣升式反應(yīng)器等。按其培養(yǎng)細(xì)胞的方式不同，這些反應(yīng)可分為以下三類。懸浮培養(yǎng)用反應(yīng)器，如攪拌反應(yīng)器、中空纖維反應(yīng)器、陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀反應(yīng)器、氣升式反應(yīng)器。貼壁培養(yǎng)用反應(yīng)器，如攪拌反應(yīng)器（微載體培養(yǎng)）、玻璃珠床反應(yīng)器、中空纖維反應(yīng)器、陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀反應(yīng)器。包埋培養(yǎng)用反應(yīng)器，如流化床反應(yīng)器、固化床反應(yīng)器。1.攪拌罐生長反應(yīng)器這是最經(jīng)典、最早被采用的一種生物反應(yīng)器。此類反應(yīng)器與傳統(tǒng)的微生物生物反應(yīng)器類似，針對動物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)，采用了不同的攪拌器及通氣方式。通過攪拌器的作用使細(xì)胞和養(yǎng)分在培養(yǎng)液中均勻分布，使養(yǎng)分充分被細(xì)胞利用，并增大氣液接觸面，有利于氧的傳遞?，F(xiàn)已開發(fā)的有：籠式通氣攪拌器、雙層籠式通氣攪拌器、槳式攪拌器等。

2.氣升式生物反應(yīng)器1979年首次應(yīng)用氣升式生物反應(yīng)器成功的進(jìn)行了動物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)。其優(yōu)點(diǎn)：罐內(nèi)液體流動溫和均勻，產(chǎn)生剪切力小，對細(xì)胞損傷較小；可直接噴射空氣供氧，因而氧傳遞率較高；液體循環(huán)量大，細(xì)胞和養(yǎng)分都能均勻分布于培養(yǎng)液中；結(jié)構(gòu)簡單，利于密封并降低了造價(jià)。常用的氣升式反應(yīng)器有三種：內(nèi)循環(huán)式氣升式、外循環(huán)式氣升式、內(nèi)外循環(huán)式氣升式生物反應(yīng)器。3.鼓泡式生物反應(yīng)器與氣升式反應(yīng)器相類似，是利用氣體鼓泡來進(jìn)行供氧及混合，其設(shè)計(jì)原理與氣升式生物反應(yīng)器也相同。4.中空纖維生物反應(yīng)器用途較廣，既可用于懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)，又可用于貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)。原理：模擬細(xì)胞在體內(nèi)生長的三維狀態(tài)，利用反應(yīng)器內(nèi)數(shù)千根中空纖維的縱向布置，提供細(xì)胞近似生理?xiàng)l件的體外生長微環(huán)境，使細(xì)胞不斷生長。中空纖維是一種細(xì)微的管狀結(jié)構(gòu)，管壁為極薄的半透膜，富含毛細(xì)管，培養(yǎng)時(shí)纖維管內(nèi)灌流充以氧氣的無血清培養(yǎng)液，管外壁則供細(xì)胞黏附生長，營養(yǎng)物質(zhì)通過半透膜從管內(nèi)滲透出來供細(xì)胞生長；對于血清等大分子營養(yǎng)物，必須從管外灌入，否則會被半透膜阻隔不能被細(xì)胞利用；細(xì)胞的代謝廢物也可通過半透膜滲入管內(nèi)，避免了過量代謝物對細(xì)胞的毒害作用。優(yōu)點(diǎn)是：占地空間少；細(xì)胞產(chǎn)量高，細(xì)胞密度可達(dá)109數(shù)量級；生產(chǎn)成本低，且細(xì)胞培養(yǎng)維持時(shí)間長，適用于長期分泌的細(xì)胞。中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器流程5.微載體培養(yǎng)技術(shù)（microcarrierculturetechnique）及反應(yīng)器微載體：是指直徑在60-250μm，能適用于貼壁細(xì)胞生長的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各種合成的聚合物組成。微載體的表面帶少量正電荷，能促進(jìn)細(xì)胞貼壁。微載體培養(yǎng)法:將動物細(xì)胞吸附于微載體表面，微載體(帶著細(xì)胞)懸浮于培養(yǎng)基中，使細(xì)胞在微載體表面長成單層的培養(yǎng)方法。微載體培養(yǎng)兼具懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，是目前公認(rèn)的最有發(fā)展前途的一種動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)。微載體培養(yǎng)原理：是將對細(xì)胞無害的顆粒-微載體加入到培養(yǎng)容器的培養(yǎng)液中，作為載體，使細(xì)胞在微載體表面附著生長，同時(shí)通過持續(xù)攪動使微載體始終保持懸浮狀態(tài)。微載體培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)

（1）表面積/體積（S/V）大，因此單位體積培養(yǎng)液的細(xì)胞產(chǎn)率高；（2）把懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)融合在一起，兼有兩者的優(yōu)點(diǎn)；（3）可用簡單的顯微鏡觀察細(xì)胞在微珠表面的生長情況；（4）簡化了細(xì)胞生長各種環(huán)境因素的檢測和控制，重現(xiàn)性好；（5）培養(yǎng)基利用率較高；

（6）放大容易；

（7）細(xì)胞收獲過程不復(fù)雜；（8）勞動強(qiáng)度?。唬?）培養(yǎng)系統(tǒng)占地面積和空間小。微載體培養(yǎng)操作要點(diǎn)培養(yǎng)初期：保證培養(yǎng)基與微球體處于穩(wěn)定的PH與溫度水平，接種細(xì)胞（對數(shù)生長期，而非穩(wěn)定期）至終體積1/3的培養(yǎng)液中，以增加細(xì)胞與微載體接觸的機(jī)會。不同的微載體所用濃度及接種細(xì)胞密度是不同的。常使用2-3g/L的微載體含量，更高的微載體濃度需要控制環(huán)境或經(jīng)常換液。貼壁階段（3-8d）后，緩慢加入培養(yǎng)液至工作體積，并且增加攪拌速度保證完全均質(zhì)混合。培養(yǎng)維持期：進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)（胞核計(jì)數(shù)）、葡萄糖測定及細(xì)胞形態(tài)鏡檢。隨意細(xì)胞增殖，微球變得越來越重，需增加攪拌速率。經(jīng)過3d左右，培養(yǎng)液開始呈酸性，需換液：停止攪拌，讓微珠沉淀5min，棄掉適宜體積的培養(yǎng)液，緩慢加入新鮮培養(yǎng)液（37℃），重新開始攪拌。收獲細(xì)胞：排干培養(yǎng)液，至少用緩沖液漂洗一遍，然后加入相應(yīng)的酶，快速攪拌（75-125r/min）20-30min，然后解離收集細(xì)胞及其產(chǎn)品。微載體培養(yǎng)的放大：可以通過增加微載體的含量或培養(yǎng)體積進(jìn)行放大。微載體培養(yǎng)系統(tǒng)（二）生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)和放大設(shè)計(jì)的總體原則包括以下幾個(gè)方面。①結(jié)構(gòu)嚴(yán)密，能耐受蒸汽滅菌，采用對生物催化劑無害和耐蝕材料制作，內(nèi)壁光滑無死角，內(nèi)部附件盡量減少，以維持純種培養(yǎng)需要；②有良好的氣-液接觸和液-固混和性能和熱量交換性能，使質(zhì)量與熱量傳遞有效地進(jìn)行；③保證產(chǎn)物質(zhì)量和產(chǎn)量前提下，盡量節(jié)省能源消耗；④減少泡沫產(chǎn)生，或附有消沫裝置以提高裝料系數(shù)，并有必要可靠的參數(shù)檢測和控制儀表并能與計(jì)算機(jī)聯(lián)機(jī)。

通常細(xì)胞生長所需要的氧氣控制在30%～70%。氧氣傳遞速率（oxygentransferrate,OTR）OTR=KLa(C*－CL)KLa為氧的傳遞系數(shù)；C*為相當(dāng)氣相氧分壓的溶氧濃度，CL為培養(yǎng)液中溶氧濃度。影響供氧的因素總體上講是KLa和C*－CL值。要增大C*－CL，無非是增大C*值或降低CL值。增大C*的措施，有適當(dāng)增加反應(yīng)器中操作壓力和增大氣相中的氧分壓兩個(gè)方法。影響KLa的因素大致可分為三個(gè)方面：一是反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)，包括相對幾何尺寸的比例；二是操作條件，如攪拌功率或循環(huán)泵功率的輸入量，通氣量等；三是培養(yǎng)或發(fā)酵液的物理化學(xué)性質(zhì)，如流變特性，特別是其粘度或顯示粘度、表面張力、擴(kuò)散系數(shù)、細(xì)胞形態(tài)、泡沫程度等。五、動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)（一）動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法（二）大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的操作方式（一）動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法（1）貼壁培養(yǎng)生長時(shí)必須要有給以貼附的支持物表面，細(xì)胞依靠自身分泌的或培養(yǎng)基中提供的貼附因子才能在該表面上生長和繁殖，細(xì)胞在表面上生長時(shí)有兩種形態(tài)，成纖維樣細(xì)胞型和上皮樣細(xì)胞型。成纖維樣細(xì)胞型主要來源于中胚層組織細(xì)胞心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞成骨細(xì)胞等，上皮樣細(xì)胞型主要來源于外胚層和內(nèi)胚層組織細(xì)胞，皮膚細(xì)胞、腸管上皮細(xì)胞，在培養(yǎng)過程中，隨著培養(yǎng)條件的變化細(xì)胞形態(tài)也會發(fā)生改變。（2）懸浮培養(yǎng)生長不依賴支持物表面，在培養(yǎng)液中懸浮生長，如淋巴細(xì)胞等。（3）固定化培養(yǎng)根據(jù)生長條件的不同可貼壁也可懸浮生長，中國地鼠卵巢細(xì)胞。（二）大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的操作方式深層培養(yǎng)可分為：分批式、流加式、半連續(xù)式、連續(xù)式和灌注式五種。1.分批式培養(yǎng)2.流加式培養(yǎng)3.半連續(xù)式培養(yǎng)4.連續(xù)式培養(yǎng)5.灌注式培養(yǎng)1.分批式培養(yǎng)（batchculture）分批式培養(yǎng)是細(xì)胞規(guī)模培養(yǎng)發(fā)展進(jìn)程中較早期采用的方式，也是其它操作方式的基礎(chǔ)。該方式采用機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器，將細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后，一次性轉(zhuǎn)入生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中其體積不變，不添加其它成分，待細(xì)胞增長和產(chǎn)物形成積累到適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，一次性收獲細(xì)胞、產(chǎn)物、培養(yǎng)基的操作方式。

特點(diǎn):操作簡單。培養(yǎng)周期短，染菌和細(xì)胞突變的風(fēng)險(xiǎn)小。直觀反映細(xì)胞生長代謝的過程。因培養(yǎng)期間細(xì)胞生長代謝是在一個(gè)相對固定的營養(yǎng)環(huán)境，不添加任何營養(yǎng)成分，因此可直觀的反映細(xì)胞生長代謝的過程,是動物細(xì)胞工藝基礎(chǔ)條件或"小試"研究常用的手段；可直接放大。由于培養(yǎng)過程工藝簡單，對設(shè)備和控制的要求較低，設(shè)備的通用性強(qiáng)，反應(yīng)器參數(shù)的放大原理和過程控制，比較其它培養(yǎng)系統(tǒng)較易理解和掌握，在工業(yè)化生產(chǎn)中分批式培養(yǎng)操作是傳統(tǒng)的、常用的方法，其工業(yè)反應(yīng)器規(guī)?？蛇_(dá)12000L。分批培養(yǎng)過程中，細(xì)胞的生長分為五個(gè)階段：延滯期、對數(shù)生長期、減速期、平穩(wěn)期和衰退期。典型的分批培養(yǎng)隨時(shí)間變化的過程曲線2.流加式培養(yǎng)（feedingculture）流加式培養(yǎng)是在批式培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，采用機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)，懸浮培養(yǎng)細(xì)胞或以懸浮微載體培養(yǎng)貼壁細(xì)胞，細(xì)胞初始接種的培養(yǎng)基體積一般為終體積的1/2～1/3，在培養(yǎng)過程中根據(jù)細(xì)胞對營養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗和需求，流加濃縮的營養(yǎng)物或培養(yǎng)基，從而使細(xì)胞持續(xù)生長至較高的密度，目標(biāo)產(chǎn)品達(dá)到較高的水平，整個(gè)培養(yǎng)過程沒有流出或回收，通常在細(xì)胞進(jìn)入衰亡期或衰亡期后進(jìn)行終止回收整個(gè)反應(yīng)體系，分離細(xì)胞和細(xì)胞碎片，濃縮、純化目標(biāo)蛋白。流加培養(yǎng)是當(dāng)前動物細(xì)胞培養(yǎng)中占有主流優(yōu)勢的培養(yǎng)工藝，也是近年來動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)研究的熱點(diǎn)。流加培養(yǎng)中的關(guān)鍵技術(shù)是基礎(chǔ)培養(yǎng)基和流加濃縮的營養(yǎng)培養(yǎng)基。流加的總體原則是維持細(xì)胞生長相對穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境。營養(yǎng)成分過剩會產(chǎn)生大量的代謝副產(chǎn)物造成營養(yǎng)利用效率下降而成為無效的利用，營養(yǎng)成分缺乏會導(dǎo)致細(xì)胞生長抑制或死亡。流加工藝中的營養(yǎng)成分主要有以下三大類。葡萄糖葡萄糖是細(xì)胞的供能物質(zhì)和主要的碳源物質(zhì)，當(dāng)其濃度較高是會產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物乳酸，因而需要進(jìn)行其濃度控制，以足夠維持細(xì)胞生長而不至于產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物的濃度為佳。谷氨酰胺谷氨酰胺是細(xì)胞的供能物質(zhì)和主要的氮源物質(zhì)，然而當(dāng)其濃度較高是會產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物氨，因而也需要進(jìn)行其濃度控制，以足夠維持細(xì)胞生長而不至于產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物的濃度為佳；大規(guī)模培養(yǎng)中細(xì)胞凋亡主要由于營養(yǎng)物質(zhì)的耗竭或代謝產(chǎn)物的堆積引起，如谷氨酰胺的耗竭是最常見的凋亡原因，而且凋亡一旦發(fā)生，補(bǔ)加谷氨酰胺已不能逆轉(zhuǎn)凋亡。另外，動物細(xì)胞在無血清、無蛋白培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞變得更為脆弱，更容易發(fā)生凋亡。氨基酸、維生素及其他主要包括營養(yǎng)必需氨基酸、營養(yǎng)非必需氨基酸、一些特殊的氨基酸如羥脯氨酸、羧基谷氨酸和磷酸絲氨酸；此外還包括其他營養(yǎng)成分如膽堿、生長刺激因子。添加的氨基酸形式多為左旋氨基酸，因而多以鹽或前體的形式替代單分子氨基酸，或者添加四肽或短肽的形式。在進(jìn)行添加時(shí)，不溶性氨基酸如胱氨酸、酪氨酸和色氨酸只在中性pH值部分溶解，可采用泥漿的形式進(jìn)行脈沖式添加；其他的可溶性氨基酸以溶液的形式用蠕動泵進(jìn)行緩慢連續(xù)流加。流加式培養(yǎng)分為單一補(bǔ)料分批式培養(yǎng)和反復(fù)補(bǔ)料分批式培養(yǎng)。單一補(bǔ)料分批式培養(yǎng)是在培養(yǎng)開始時(shí)投入一定量的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，培養(yǎng)到一定時(shí)期，開始連續(xù)補(bǔ)加濃縮營養(yǎng)物質(zhì)，直到培養(yǎng)液體積達(dá)到生物反應(yīng)器的最大操作容積，停止補(bǔ)加，最后將細(xì)胞培養(yǎng)液一次全部放出。該操作方式受到反應(yīng)器操作容積的限制，培養(yǎng)周期只能控制在較短的時(shí)間內(nèi)。反復(fù)補(bǔ)料分批式培養(yǎng)是在單一補(bǔ)料分批式操作的基礎(chǔ)上，每個(gè)一定時(shí)間按一定比例放出一部分培養(yǎng)液，是培養(yǎng)液體積始終不超過反應(yīng)器的最大操作容積，從而在理論上可以延長培養(yǎng)周期，直至培養(yǎng)效率下降，才將培養(yǎng)液全部放出。

3.半連續(xù)式培養(yǎng)（semi-continuousculture）半連續(xù)式培養(yǎng)又稱為重復(fù)分批式培養(yǎng)或換液培養(yǎng)。采用機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)，懸浮培養(yǎng)形式。在細(xì)胞增長和產(chǎn)物形成過程中，每間隔一段時(shí)間，從中取出部分培養(yǎng)物，再用新的培養(yǎng)液補(bǔ)足到原有體積，使反應(yīng)器內(nèi)的總體積不變。半連續(xù)式培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)物的體積逐步增加，可進(jìn)行多次收獲，細(xì)胞可持續(xù)指數(shù)生長，并可保持產(chǎn)物和細(xì)胞在較高的濃度水平，培養(yǎng)過程可延續(xù)到很長時(shí)間。該操作方式的優(yōu)點(diǎn)是操作簡便，生產(chǎn)效率高，可長時(shí)期進(jìn)行生產(chǎn)，反復(fù)收獲產(chǎn)品，可使細(xì)胞密度和產(chǎn)品產(chǎn)量一直保持在較高的水平。在動物細(xì)胞培養(yǎng)和藥品生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用。4.連續(xù)式培養(yǎng)（continuousculture）是一種常見的懸浮培養(yǎng)模式，采用機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)。該模式是將細(xì)胞接種與一定體積的培養(yǎng)基后，為了防止衰退期的出現(xiàn)，在細(xì)胞達(dá)最大密度之前，以一定速度向生物反應(yīng)器連續(xù)添加新鮮培養(yǎng)基；同時(shí)，含有細(xì)胞的培養(yǎng)物以相同的速度連續(xù)從反應(yīng)器流出，以保持培養(yǎng)體積的恒定。理論上講，該過程可無限延續(xù)下去。優(yōu)點(diǎn)：反應(yīng)器的培養(yǎng)狀態(tài)可以達(dá)到恒定，細(xì)胞在穩(wěn)定狀態(tài)下生長。連續(xù)式培養(yǎng)不足是容易造成污染，細(xì)胞的生長特性以及分泌產(chǎn)物容易變異，對設(shè)備、儀器的控制技術(shù)要求較高。連續(xù)式培養(yǎng)的特點(diǎn)主要表現(xiàn)在細(xì)胞維持持續(xù)指數(shù)增長，產(chǎn)物體積不斷增長，可控制衰退期與下降期。5.灌流式培養(yǎng)（perfusionculture）灌流式培養(yǎng)是把細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細(xì)胞增長和產(chǎn)物形成過程中，不斷地將部分培養(yǎng)基取出，同時(shí)又連續(xù)不斷地灌注新的培養(yǎng)基。與半連續(xù)式操作的不同之處在于取出部分培養(yǎng)基時(shí)，絕大部分細(xì)胞均保留在反應(yīng)器內(nèi)，而半連續(xù)培養(yǎng)在取培養(yǎng)物時(shí)同時(shí)也取出了部分細(xì)胞。灌流式培養(yǎng)具有很大的優(yōu)點(diǎn)。細(xì)胞截流系統(tǒng)可使細(xì)胞或酶保留在反應(yīng)器內(nèi)，維持較高的細(xì)胞密度，一般可達(dá)107～109個(gè)/ml，從而較大的提高了產(chǎn)品的產(chǎn)量；連續(xù)灌流系統(tǒng)，使細(xì)胞穩(wěn)定的處在較好的的營養(yǎng)環(huán)境中，有害代謝廢物濃度積累較低；反應(yīng)速率容易控制，培養(yǎng)周期較長，可提高生產(chǎn)率，目標(biāo)產(chǎn)品回收率高；產(chǎn)品在罐內(nèi)停留時(shí)間短，可及時(shí)回收到低溫下保存，有利于保持產(chǎn)品的活性。灌流式培養(yǎng)常使用的生物反應(yīng)器主要有兩種形式：攪拌式生物反應(yīng)器、固定床或流化床生物反應(yīng)器。攪拌式生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，必須具有細(xì)胞截流裝置，細(xì)胞截留系統(tǒng)開始多采用微孔膜過濾或旋轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)，最近開發(fā)的有各種形式的沉降系統(tǒng)或透析系統(tǒng)。它采用的中空纖維半透膜，透過小分子量的產(chǎn)物和底物，截流細(xì)胞和分子量較大的產(chǎn)物，在連續(xù)灌流過程中將絕大部分細(xì)胞截留在反應(yīng)器內(nèi)；近年來中空纖維生物反應(yīng)器被廣泛應(yīng)用于產(chǎn)物分泌性動物細(xì)胞的生產(chǎn)，主要用于培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體。固定床是在反應(yīng)器中裝配固定的籃筐，中間裝填聚脂纖維載體，細(xì)胞可附著在載體上生長，也可固定在載體纖維之間，靠攪拌中產(chǎn)生的負(fù)壓，迫使培養(yǎng)基不斷流經(jīng)填料，有利于營養(yǎng)成分和氧的傳遞，這種形式的灌流速度較大，細(xì)胞在載體中高密度生長。流化床生物反應(yīng)器是通過流體的上升運(yùn)動使固體顆粒維持在懸浮狀態(tài)進(jìn)行反應(yīng)，適合于固定化細(xì)胞的培養(yǎng)。6.細(xì)胞工廠(cellfactory)培養(yǎng)細(xì)胞工廠培養(yǎng)是一種設(shè)計(jì)精巧的細(xì)胞培養(yǎng)裝置。它在有限的空間內(nèi)利用了最大限度的培養(yǎng)表面，從而節(jié)省了大量的廠房空間，并可節(jié)省貴重的培養(yǎng)液。更重要的是，它可有效地保證操作的無菌性，從而避免因污染而帶來的原料、勞務(wù)和時(shí)間損失。它是對傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的革命。第二節(jié)植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)一、植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)概述二、植物細(xì)胞培養(yǎng)流程和方法三、植物細(xì)胞生物反應(yīng)器四、植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)一、植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)概述1.植物細(xì)胞形態(tài)2.植物細(xì)胞基本結(jié)構(gòu)3.植物細(xì)胞培養(yǎng)的概念4.植物細(xì)胞培養(yǎng)特性5.植物細(xì)胞培養(yǎng)所需營養(yǎng)物質(zhì)6.植物細(xì)胞培養(yǎng)的主要條件植物細(xì)胞培養(yǎng)是在離體條件下，將愈傷組織或其他易分散的組織置于液體培養(yǎng)基中進(jìn)行震蕩培養(yǎng)，得到分散成游離的懸浮細(xì)胞，通過繼代培養(yǎng)使細(xì)胞增殖，從而獲得大量細(xì)胞群體的一種技術(shù)。根據(jù)培養(yǎng)對象，植物細(xì)胞培養(yǎng)主要有單細(xì)胞培養(yǎng)，單倍體培養(yǎng)，原生質(zhì)體培養(yǎng)等。按照培養(yǎng)系統(tǒng)可分為懸浮培養(yǎng)、液體培養(yǎng)、固體培養(yǎng)、固定化培養(yǎng)等。植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展1902年，德國植物學(xué)家哈貝蘭特依據(jù)細(xì)胞學(xué)說認(rèn)為，高等植物的器官和組織可以分離成單個(gè)細(xì)胞，而每一個(gè)分離出來的細(xì)胞都具有進(jìn)一步分裂和發(fā)育的能力。1904年，亨寧（Henning）成功地進(jìn)行了胡蘿卜和辣菜根的離體胚的生長。1927年，溫特（Went）發(fā)現(xiàn)了生長素吲哚乙酸（IAA）能促進(jìn)細(xì)胞的生長。20世紀(jì)30年代，人們發(fā)現(xiàn)通過細(xì)胞或組織培養(yǎng)可使植物再生。1939年，高特里特（Gautheret）、諾伯科特（Nobercourt）和懷特（White）分別成功地培養(yǎng)了煙草、蘿卜和楊樹等細(xì)胞，并形成部分組織。至此，植物細(xì)胞培養(yǎng)才真正開始。1956年，Roetier等首先申請了用植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)生物化學(xué)物質(zhì)的專利。70年代后，引入外源基因的植物細(xì)胞可以產(chǎn)生人們所需要的產(chǎn)物。20世紀(jì)七十年代末到八十年代初，優(yōu)化細(xì)胞生長和次級代謝產(chǎn)物形成的研究能產(chǎn)生大量植物次生代謝產(chǎn)物，如培養(yǎng)紅豆杉細(xì)胞生產(chǎn)的抗癌新藥紫杉醇。1.植物細(xì)胞形態(tài)多細(xì)胞植物其細(xì)胞形態(tài)多種多樣，球形、類圓形、橢圓形、角形；具有支持作用的細(xì)胞細(xì)胞壁常增厚，類圓形、紡錘形；具有輸導(dǎo)作用的細(xì)胞管形。細(xì)胞大小不一，基本組織細(xì)胞體積較大直徑在20～100微米之間，儲藏組織細(xì)胞的直徑可達(dá)1毫米，最長的細(xì)胞是無節(jié)乳管長達(dá)數(shù)米至數(shù)十米。2.植物細(xì)胞基本結(jié)構(gòu)植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)示意圖3.植物細(xì)胞培養(yǎng)的概念（1）植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)是指在無菌和人工控制的營養(yǎng)（培養(yǎng)基）及環(huán)境條件（光照、溫度）下，研究植物的細(xì)胞、組織和器官以及控制其生長發(fā)育的技術(shù)。植物無菌培養(yǎng)包括：幼苗及較大植株的培養(yǎng)（植物培養(yǎng)）；從植物體各種器官的外植體增殖而形成的愈傷組織的培養(yǎng)（愈傷組織培養(yǎng)）；能夠保持較好分散性的離體細(xì)胞或較小細(xì)胞團(tuán)的液體培養(yǎng)（懸浮培養(yǎng)）；離體器官的培養(yǎng)（器官培養(yǎng)）；未成熟或成熟的胚胎的離體培養(yǎng)（胚胎培養(yǎng)）。（2）懸浮培養(yǎng)：在液體培養(yǎng)基中，能夠保持良好分散性的細(xì)胞和小的細(xì)胞聚集體的培養(yǎng)。組織化水平較低。（3）細(xì)胞培養(yǎng)：利用單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行液體或固體培養(yǎng)，誘導(dǎo)其增殖及分化。目的是為了得到單細(xì)胞無性繁殖系。（4）分生組織培養(yǎng)：又稱生長錐培養(yǎng)，在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)莖端分生組織細(xì)胞。（5）外植體：用于植物組織（細(xì)胞）培養(yǎng)的器官或組織（的切段），植物的個(gè)部位如根、莖、葉、花、果、穗、胚珠、胚乳、花藥和花粉等均可作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)。（6）愈傷組織：指從植物受傷部位或組織培養(yǎng)物產(chǎn)生的由分化和未分化細(xì)胞組成的一類薄壁組織。愈傷組織通常沒有固定形狀，可使傷口愈合，使表面的細(xì)胞呈木栓化而起著保護(hù)作用。當(dāng)植物扦插時(shí)，愈傷組織可形成不定根；在植物嫁接時(shí)，愈傷組織可使接穩(wěn)和砧木愈合；在植物組織培養(yǎng)中，愈傷組織常可形成不定芽。植物細(xì)胞培養(yǎng)的基本過程（7)花粉培養(yǎng)：在無菌條件下取出花藥或從花藥中取出花粉粒（小孢子），置于人工培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，形成花粉胚或花粉愈傷組織，最后長成花粉植株（圖1-4-5）。由于這種植株含有的染色體數(shù)目只相當(dāng)體細(xì)胞的一半，故又稱單倍體植株。單倍體植株經(jīng)過染色體加倍就成為純合的雙倍體植株。花粉培養(yǎng)目前已成為植物細(xì)胞育種的一種重要手段，并已取得重要成果。花粉培養(yǎng)的基本過程(8)原生質(zhì)體培養(yǎng):植株的幼胚、根、莖、葉等組織細(xì)胞都能進(jìn)行培養(yǎng)。首先用纖維素酶或果膠酶除去植物體細(xì)胞的細(xì)胞壁，去壁的細(xì)胞稱為原生質(zhì)體。原生質(zhì)體在良好的培養(yǎng)基上可以生長與分裂，并通過愈傷組織誘導(dǎo)分化長出莖、葉，再長出根而形成植株。原生質(zhì)體培養(yǎng)一方面可以提高變異頻率，另一方面可以為應(yīng)用細(xì)胞工程技術(shù)進(jìn)行遺傳重組提供有用的材料，細(xì)胞融合和基因轉(zhuǎn)移都必需在原生質(zhì)體上進(jìn)行。原生質(zhì)體培養(yǎng)的基本過程（9）器官形成：是指在組織培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)物中芽、根或花等器官的分化與形成?；蛘咴谙刃纬傻男「垦杆傩纬捎鷤M織，然后再形成芽；或者在不同部位分別形成芽和根之后，再形成錐管組織而將二者連成一個(gè)軸，最后形成小植株。（10）無性繁殖又叫克隆，指使用母體培養(yǎng)物反復(fù)進(jìn)行繼代培養(yǎng)時(shí)，通過同種外植體而獲得越來越多的無性繁殖后代。（11）突變體：細(xì)胞本身發(fā)生遺傳變異或應(yīng)用誘變處理發(fā)生的遺傳變異所得的新細(xì)胞。（12）繼代培養(yǎng)：由最初的外植體上切下的新增殖的組織，培養(yǎng)一代稱為“第一代培養(yǎng)”，連續(xù)多代的培養(yǎng)就稱為繼代培養(yǎng)。（13）次級代謝和次級代謝產(chǎn)物次級代謝作用是特殊蛋白質(zhì)內(nèi)源化合物的合成、代謝及分解作用的綜合體現(xiàn)。除了核酸、核苷、核苷酸、氨基酸、蛋白質(zhì)及糖類以外，具有如下特征的成分成為次級代謝產(chǎn)物：有明顯的分類學(xué)區(qū)域界限；其合成需在一定的條件下才能發(fā)生；缺乏明確的生理功能；是生命的多余成分。包括生物堿、黃酮體、萜類、有機(jī)酸、木質(zhì)素等。4.植物細(xì)胞的培養(yǎng)特性

植物細(xì)胞的培養(yǎng)特性主要有：（1）細(xì)胞個(gè)體較大（較微生物細(xì)胞大得多），有纖維細(xì)胞壁，細(xì)胞抗剪切力差。（2）細(xì)胞生長速度較慢，容易被微生物污染，培養(yǎng)時(shí)需添加抗生素。（3）細(xì)胞培養(yǎng)過程中易聚集成團(tuán)，較難進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。（4）培養(yǎng)時(shí)需供養(yǎng)，但培養(yǎng)液粘度較大，不能耐受強(qiáng)力通風(fēng)攪拌。（5）植物細(xì)胞具有群體效應(yīng)及解除抑制性。（6）細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物滯留于細(xì)胞內(nèi)，產(chǎn)量低。（7）植物細(xì)胞具有結(jié)構(gòu)和功能全能性，即培養(yǎng)的細(xì)胞可以分化成完整的植株。5.植物細(xì)胞培養(yǎng)所需營養(yǎng)物質(zhì)

植物細(xì)胞的培養(yǎng)基主要包括：①無機(jī)鹽：根據(jù)工作濃度差異又分為大量元素“N、P、K、Ca、Mg、S”和微量元素“Fe、Mn、Zn、Cu、Mo”等。②碳源：蔗糖、葡萄糖、果糖等。③有機(jī)氮源：雖然植物細(xì)胞在培養(yǎng)過程中能合成氨基酸，但加入某些氨基酸效果更好。④生長調(diào)節(jié)素：植物生長素、細(xì)胞激動素、赤霉素和脫落酸（赤霉素和脫落酸對某些細(xì)胞起促進(jìn)作用，而對另一些細(xì)胞則起抑制作用，所以不常用）。⑤維生素：VB1、VB3、VB6、VC、生物素、葉酸、泛酸等。6.植物細(xì)胞培養(yǎng)的主要條件成功的植物細(xì)胞培養(yǎng)需要特別關(guān)注正確的無菌技術(shù)和溫度控制。①保證操作過程無菌：現(xiàn)在廣泛采用層流櫥作無菌接種設(shè)備。均一的特殊高效無菌過濾的空氣（HEPA）從櫥的后部吹出，當(dāng)容器打開時(shí)起到保護(hù)培養(yǎng)物的作用。②溫度：多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物僅在很窄的溫度范圍內(nèi)才能很好地生長。最通常的生長溫度是25℃。③光照：愈傷組織和搖瓶培養(yǎng)物一般在配有燈的暗室中培養(yǎng)即可。高強(qiáng)度光照或持續(xù)低劑量光照會導(dǎo)致培養(yǎng)物變綠（形成少量葉綠體）或褐色（聚合苯的積累），因而抑制代謝產(chǎn)物的積累。再生細(xì)胞培養(yǎng)物最好使用冷的日光燈—引起可提供與日光接近的光譜。常用定時(shí)器以適用于日夜循環(huán)（16～18h光照，6～8h黑暗）。光能自養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)屬特例。④通氣：多數(shù)情況下，搖瓶中植物懸浮培養(yǎng)物比微生物培養(yǎng)物的需氧量少。而從搖瓶中取出培養(yǎng)物進(jìn)行次代培養(yǎng)時(shí)，因許多防御系統(tǒng)的激活導(dǎo)致短期內(nèi)耗氧量的劇增，因此誘發(fā)后要迅速提高供氧量，可據(jù)實(shí)際情況調(diào)整通氣量。二、植物細(xì)胞培養(yǎng)流程和方法1.植物細(xì)胞培養(yǎng)流程植物細(xì)胞大量培養(yǎng)工藝流程2.植物細(xì)胞培養(yǎng)方法植物細(xì)胞的培養(yǎng)系統(tǒng)（1）單倍體細(xì)胞培養(yǎng)：主要用花藥在人工培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，可以從小孢子直接發(fā)育成胚狀體，然后長成單倍體植株；或者是通過組織誘導(dǎo)分化出芽和根，最終長成植株。（2）原生質(zhì)體培養(yǎng)：脫去全部細(xì)胞壁的細(xì)胞叫原生質(zhì)體，是一生物工程學(xué)概念。原生質(zhì)體是由質(zhì)膜所包圍的具有生活力的“裸露細(xì)胞”。原生質(zhì)體培養(yǎng)：對離體植物的原生質(zhì)體進(jìn)行培養(yǎng)，形成完整植株的培養(yǎng)技術(shù)。（3）固體培養(yǎng)：凝固劑除特殊研究外，基本都使用瓊脂，濃度一般為2%-3%，細(xì)胞在培養(yǎng)基表面生長。（4）液體培養(yǎng)：可分為靜止培養(yǎng)和振蕩培養(yǎng)兩類。靜止培養(yǎng)不需要任何設(shè)備，適合于某些原生質(zhì)體的培養(yǎng)；振蕩培養(yǎng)需要搖床使培養(yǎng)物和培養(yǎng)基保持充分混合，以利于氣體交換。（5）懸浮培養(yǎng)：是指單細(xì)胞和小的細(xì)胞聚集集團(tuán)塊懸浮于液體培養(yǎng)基中進(jìn)行生長的過程，這些細(xì)胞不發(fā)生分化。懸浮培養(yǎng)細(xì)胞較在固定培養(yǎng)基上生長的愈傷組織的生長和代謝速度快，通過對培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的控制可進(jìn)行更有效的操作。如加入前體可進(jìn)行多種生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，加入中間體可提高次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，篩選細(xì)胞系可產(chǎn)生完整植株中不存在的化合物。（6）固定化培養(yǎng)：應(yīng)用廣泛、能夠保持細(xì)胞活性的固定化方法是將細(xì)胞包埋于海藻酸鹽或卡拉膠中。三、植物細(xì)胞生物反應(yīng)器植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器示意圖1.機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器2.非攪拌式生物反應(yīng)器

非攪拌式生物反應(yīng)器所產(chǎn)生的剪切力小，結(jié)構(gòu)簡單。其主要類型有：鼓泡式生物反應(yīng)器、氣升式生物反應(yīng)器、轉(zhuǎn)鼓式生物反應(yīng)器等。3.固定化細(xì)胞生物反應(yīng)器主要包括：填充床生物反應(yīng)器、流化床生物反應(yīng)器、膜生物反應(yīng)器流化床反應(yīng)器固定化細(xì)胞膜反應(yīng)器四、植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)（一）植物細(xì)胞的大規(guī)模懸浮培養(yǎng)（二）植物細(xì)胞或原生質(zhì)體的固定化培養(yǎng)（三）影響植物細(xì)胞培養(yǎng)的因素（一）植物細(xì)胞的大規(guī)模懸浮培養(yǎng)1.懸浮培養(yǎng)中的植物細(xì)胞的特性2.植物細(xì)胞培養(yǎng)液的流變特性3.植物細(xì)胞培養(yǎng)過程中的氧傳遞4.泡沫和表面黏附性5.懸浮細(xì)胞的生長與增殖6.細(xì)胞團(tuán)和愈傷組織的再形成和植株的再生1.懸浮培養(yǎng)中的植物細(xì)胞的特性與