第八章動植物細胞培養(yǎng)技術(shù)

第八章動植物細胞培養(yǎng)技術(shù)

第一節(jié)動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)第二節(jié)植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)知識目標1.掌握動植物細胞培養(yǎng)基本技術(shù)。2.掌握動植物培養(yǎng)生物反應(yīng)器的類型。3.了解動植物細胞培養(yǎng)在生物制藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。能力目標1.掌握主要的動植物細胞培養(yǎng)方式。2.掌握培養(yǎng)基的組成、制備、細胞培養(yǎng)過程的檢測等基本操作。3第一節(jié)動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)一、動物細胞培養(yǎng)技術(shù)概述二、動物細胞培養(yǎng)的基本技術(shù)和方法三、動物細胞培養(yǎng)的環(huán)境要求四、動物細胞生物反應(yīng)器五、動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)4一、動物細胞培養(yǎng)技術(shù)概述

1.動物細胞的形態(tài)2.動物細胞的生理特點3.動物細胞培養(yǎng)的主要特點4.生產(chǎn)用動物細胞系5.動物細胞的冷凍保存6.動物細胞培養(yǎng)基的種類和組成5

動物細胞培養(yǎng)（animalcellculture）是用無菌操作的方法從動物體分離得到細胞，將它們置于模擬動物體內(nèi)生理條件的人工環(huán)境中，在體外進行培養(yǎng)并使其繼續(xù)生長的過程。人們借以該技術(shù)可以觀察細胞的生長、繁殖、細胞分化以及細胞衰老等生命現(xiàn)象。動物細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)物可以是單個細胞，也可以是細胞群。動物細胞培養(yǎng)已廣泛應(yīng)用于病毒學(xué)，免疫學(xué)，遺傳學(xué)，腫瘤學(xué)，細胞生物學(xué)，毒理學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)等各個領(lǐng)域。利用細胞培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)生產(chǎn)出了多種生物制品，如狂犬病疫苗，干擾素，生長調(diào)節(jié)素。擾素，生長調(diào)節(jié)素。動物細胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展1907年，哈里森（Harrison）在無菌條件下用淋巴液作培養(yǎng)基，培養(yǎng)蛙胚神經(jīng)組織存活數(shù)周，并觀察到神經(jīng)細胞突起的生長過程，由此創(chuàng)建了蓋片覆蓋凹窩玻璃懸滴培養(yǎng)法，奠定了動物組織體外培養(yǎng)的基礎(chǔ)。之后，又有人將懸滴培養(yǎng)法改良為雙蓋片培養(yǎng)，提高了傳代效率并減少了污染。1923年，卡雷爾（Carrel）設(shè)計了卡氏瓶培養(yǎng)法，擴大了組織生存空間。1951年，厄爾（Earle）發(fā)明了體外培養(yǎng)動物細胞的人工合成培養(yǎng)基。1951年，波米拉（Pomerat）設(shè)計了灌流小室，使細胞生活在不斷更新的培養(yǎng)液中，便于作顯微攝影和細胞代謝的研究。1957年，格拉夫（Graff）用灌注培養(yǎng)法創(chuàng)造了懸浮細胞培養(yǎng)史上絕無僅有的1×1010～2×1010細胞/L的記錄，標志著現(xiàn)代灌注概念的誕生。進一步提高了細胞懸浮培養(yǎng)的效率。1957年，杜爾貝科（Dulbecco）等人采用胰蛋白酶消化處理和應(yīng)用液體培養(yǎng)基的方法，獲得了單層細胞培養(yǎng)。1962年，Capstile成功大規(guī)模懸浮培養(yǎng)小鼠腎細胞（BHK），標志著動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的起步。1967年，VanWezel用DEAE-SephadexA50為載體培養(yǎng)動物細胞獲得成功。1975年，Sato等在培養(yǎng)基中用激素代替血清使垂體細胞株GH3在無血清介質(zhì)中生長獲得成功，預(yù)示著無血清培養(yǎng)技術(shù)的誘人前景。1975年，Kobhler和Milstein成功融合了小鼠B淋巴細胞和骨髓瘤細胞而產(chǎn)生能分泌穩(wěn)定單克隆抗體的雜交瘤細胞。1986年，DemoBiotech公司首次用微囊化技術(shù)大規(guī)模培養(yǎng)雜交瘤細胞生產(chǎn)單抗獲得成功。1989年，Konstantinovti首次提出大規(guī)模細胞培養(yǎng)過程中的生理狀態(tài)控制，更新了傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)工藝中優(yōu)化控制理論。1.動物細胞的形態(tài)2.動物細胞的生理特點⑴分裂期長，可達12～48h，同一種屬不同部位的細胞分裂期長短也不相同，分裂期長短受培養(yǎng)條件的影響，如溫度、酸度、成分等。⑵細胞生長需貼附于基質(zhì)，并有接觸抑制現(xiàn)象。⑶正常二倍體細胞的壽命是有限的。⑷動物細胞對周圍環(huán)境十分敏感。⑸動物細胞對培養(yǎng)基要求很高。⑹動物細胞蛋白質(zhì)的合成途徑和修飾功能與細菌不同。動物細胞作為宿主細胞生產(chǎn)藥物的缺點是培養(yǎng)條件要求高、成本高、產(chǎn)量低；優(yōu)點是多半可分泌到細胞外，提取純化方便，蛋白質(zhì)經(jīng)糖基化修飾后與天然產(chǎn)物更接近，適合于臨床應(yīng)用。3.動物細胞培養(yǎng)的主要特點⑴污染概率大⑵營養(yǎng)成分要求高⑶培養(yǎng)環(huán)境適應(yīng)差⑷培養(yǎng)條件要求嚴格⑸代謝廢物毒性大⑹檢測控制指標多⑺載體生長依賴強4.生產(chǎn)用動物細胞系生產(chǎn)用動物細胞是按生產(chǎn)條件選擇、馴化、適于大量培養(yǎng)，用于生產(chǎn)制備生物制劑的動物細胞。用于動物細胞培養(yǎng)的細胞系主要有四類，即原代細胞、二倍體細胞、連續(xù)細胞系、融合細胞和重組細胞系。細胞系（cellline）指原代細胞培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后所繁殖的細胞群體。其中能夠連續(xù)傳代的細胞叫做連續(xù)細胞系或無限細胞系，不能連續(xù)培養(yǎng)的稱為有限細胞系。大多數(shù)二倍體細胞為有限細胞系。通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細胞系中獲得具有特殊性質(zhì)或標志物的培養(yǎng)物稱為細胞株（CellStrain），也就是說，細胞株是用單細胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法，由單細胞增殖形成的細胞群。細胞株的特殊性質(zhì)或標志必須在整個培養(yǎng)期間始終存在。（1）原代細胞系原代細胞是指從機體取出后立即培養(yǎng)的細胞。有人把培養(yǎng)的第1代細胞與傳10代以內(nèi)的細胞統(tǒng)稱為原代細胞培養(yǎng)。特點：細胞分裂增殖不旺盛，與體內(nèi)細胞相似。應(yīng)用：藥物檢測實驗，藥理研究。生產(chǎn)用的最多的是雞胚細胞、原代兔腎或鼠腎細胞，以及血液淋巴細胞等。（2）二倍體細胞系二倍體細胞系是原代細胞經(jīng)過傳代、篩選、克隆，從多種細胞成分的組織中挑選出來的具有某種特征的細胞株。該細胞仍具有“正?！奔毎奶攸c，即①染色體組是2n的核型；②具有明顯的貼壁依賴和接觸抑制的特性；③只有有限增殖能力，一般可連續(xù)傳代培養(yǎng)50代；④無致瘤性。廣泛用于生產(chǎn)的二倍體細胞系有WI-38、MRC-5和2BS等。WI-38細胞是人二倍體細胞系，成纖維細胞，能產(chǎn)生膠原，倍增時間為24小時，有限壽命50代，用于制備疫苗。MRC-5：人二倍體細胞系，成纖維細胞，有限壽命42～46代，用于制備疫苗。（3）連續(xù)細胞系連續(xù)細胞系:從正常細胞轉(zhuǎn)化而來，分化不成熟的、獲得了無限增殖能力的一種細胞株。常常由于染色體的斷裂而變成異倍體，并失去正常細胞的特點。傳代細胞在長期培養(yǎng)中，由于自發(fā)或人為方法可獲得無限增殖能力。此外，直接從腫瘤組織建立的細胞系也是轉(zhuǎn)化細胞系。由于轉(zhuǎn)化的細胞具有無限的生命力，而且倍增時間常常較短，對培養(yǎng)條件和生長因子要求較低，故適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。近年來用于生產(chǎn)的這種細胞有Namalwa、CHO、BHK-21和Vero細胞。CHO-K1：從中國地鼠卵巢中分離的上皮樣細胞，用于構(gòu)建工程細胞。BHK-21：從地鼠幼鼠的腎臟中分離。成纖維樣細胞，用于構(gòu)建工程菌，可生產(chǎn)疫苗。Vero：從非洲綠猴腎中分離，貼壁依賴的成纖維細胞，用于制備疫苗。Namalwa：從淋巴瘤病人分離，生產(chǎn)干擾素。（4）基因工程細胞系基因工程細胞系指采用基因工程技術(shù)或細胞融合技術(shù)對宿主細胞的遺傳物質(zhì)進行修飾改造或重組，獲得具有穩(wěn)定遺傳的獨特性狀的細胞系。隨著細胞融合和基因重組技術(shù)的發(fā)展，已有多種有生物活性的基因重組蛋白在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)的研究和應(yīng)用中發(fā)揮越來越重要的作用，并產(chǎn)生巨大的效益。人們通過基因工程技術(shù)，把編碼蛋白質(zhì)的基因在分子的水平上進行設(shè)計、改造、重組，再轉(zhuǎn)移到新的宿主細胞系統(tǒng)內(nèi)進行復(fù)制、表達和折疊，以產(chǎn)生新的功能蛋白。這種在基因水平上進行操作構(gòu)建的細胞，稱為基因工程細胞系。5.動物細胞的冷凍保存冷凍保存：將體外培養(yǎng)物或生物活性材料懸浮在加有或不加冷凍保護劑的溶液中，以一定的冷凍速率降至零下某一溫度（一般是低于-70℃的超低溫條件），并在此溫度下對其長期保存的過程。復(fù)蘇：以一定的復(fù)溫速率將凍存的體外培養(yǎng)物或生物活性材料恢復(fù)到常溫的過程。在低于-70℃的超低溫條件下，有機體細胞內(nèi)部的生化反應(yīng)極其緩慢，甚至終止。當以適當?shù)姆椒▽龃娴纳锊牧匣謴?fù)至常溫時，其內(nèi)部的生化反應(yīng)可恢復(fù)正常。冷凍保護劑是指可以保護細胞免受冷凍損傷的物質(zhì)。冷凍保護劑常常配制成一定的溶液。冷凍保護劑可分為滲透性和非滲透性兩類。滲透性冷凍保護劑可以滲透到細胞內(nèi)，一般是一些小分子物質(zhì)，主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。凍存時DMSO平衡多在4℃下進行，一般需要40～60分鐘。非滲透性冷凍保護劑不能滲透到細胞內(nèi)，一般是些大分子物質(zhì)，主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羥乙基淀粉等。不同的冷凍保護劑有不同的優(yōu)、缺點。目前一般多采用聯(lián)合使用兩種以上冷凍保護劑組成保護液。由于許多冷凍保護劑（如DMSO）在低溫下能保護細胞，但在常溫下卻對細胞有害，故在細胞復(fù)溫后應(yīng)及時洗滌冷凍保護劑。6.動物細胞培養(yǎng)基的種類和組成（1）天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基是指來自動物體液或利用組織分離提取的一類培養(yǎng)基，如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等。組織培養(yǎng)技術(shù)建立早期，體外培養(yǎng)細胞都是利用天然培養(yǎng)基。由于天然培養(yǎng)基制作過程復(fù)雜、批間差異大，因此逐漸為合成培養(yǎng)基所替代。目前廣泛使用的天然培養(yǎng)基是血清，另外各種組織提取液、促進細胞貼壁的膠原類物質(zhì)在培養(yǎng)某些特殊細胞也是必不可少。其優(yōu)點是營養(yǎng)成分豐富、培養(yǎng)效果好；缺點是成分復(fù)雜、個體差異大、來源有限。天然培養(yǎng)基的種類主要包括生物性體液（如血清）、組織浸出液（如胚胎浸出液）、凝固劑（如血漿）、水解乳蛋白等。（2）合成培養(yǎng)基

組成穩(wěn)定，可大量生產(chǎn)供應(yīng)。成分為氨基酸、維生素、糖類（碳源）、無機鹽、其他（前體和氧化還原劑）。合成培養(yǎng)基中除了各種營養(yǎng)成分外，還需添加5%～10%的小牛血清，才能使細胞很好地增殖。血清主要作用：提供基本營養(yǎng)物質(zhì)；提供激素和各種生長因子；提供結(jié)合蛋白；提供促接觸和伸展因子使細胞貼壁免受機械損傷；對培養(yǎng)中的細胞起到某些保護作用。合成培養(yǎng)基是根據(jù)天然培養(yǎng)基的成分，用化學(xué)物質(zhì)對細胞體內(nèi)生存環(huán)境中已知物質(zhì)在體外人工條件的模擬，經(jīng)過反復(fù)試驗篩選、強化和重新組合后形成的培養(yǎng)基。合成培養(yǎng)基既能給細胞提供一個近似于體內(nèi)的生存環(huán)境，又便于控制和提供標準化體外生存環(huán)境。（3）無血清培養(yǎng)基

無血清培養(yǎng)基提高了細胞培養(yǎng)的可重復(fù)性，避免了血清差異所帶來的細胞差異；減少了由血清帶來的病毒、真菌和支原體等微生物污染的危險；供應(yīng)充足、穩(wěn)定；細胞產(chǎn)品易于純化；避免了血清中某些因素對有些細胞的毒性；減少了血清中蛋白對某些生物測定的干擾，便于結(jié)果分析。無血清培養(yǎng)基在天然或合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加激素、生長因子、結(jié)合蛋白、貼附和伸展因子及其他元素。二、動物細胞培養(yǎng)的基本技術(shù)和方法（一）動物細胞的原代培養(yǎng)技術(shù)（二）動物細胞的傳代培養(yǎng)技術(shù)（一）動物細胞的原代培養(yǎng)技術(shù)1.組織塊培養(yǎng)法組織塊培養(yǎng)法是將組織剪成小塊后，接種于培養(yǎng)瓶進行培養(yǎng)。是常用的、簡便易行的以及成功率較高的原代培養(yǎng)方法，可根據(jù)不同細胞生長需求要將培養(yǎng)瓶做適當處理。優(yōu)點：操作方便，部分種類的組織細胞在小塊貼壁培養(yǎng)24h后，細胞就從組織塊四周游出。缺點：由于反復(fù)剪切和接種過程中對組織塊的損傷，并不是每個小塊都能長出細胞。細胞生長緩慢，耗時較長。組織塊培養(yǎng)法特別適合于組織量少的原代培養(yǎng)。組織塊原代培養(yǎng)法操作方法①將組織剪成或切成1mm3大小的小塊，并加入少許培養(yǎng)基使組織濕潤。②將小塊均勻涂布于瓶壁，每小塊間距0.2cm～0.5cm，一般在25mL培養(yǎng)瓶（底面積為17.5cm2）可接種20～30小塊為宜，小塊放置后，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使瓶底朝上，然后于瓶內(nèi)加入適量培養(yǎng)基蓋好瓶塞，將瓶傾斜放置在37℃溫箱內(nèi)。③培養(yǎng)24h，待小塊貼附后，將培養(yǎng)瓶緩慢翻轉(zhuǎn)平放，靜置培養(yǎng)，動作要輕，嚴禁搖動和來回振蕩，以防由于沖動而使小塊漂起而造成培養(yǎng)失敗，若組織塊不易貼壁可預(yù)先在瓶壁涂一薄層血清、胎汁或鼠尾膠原等。開始培養(yǎng)時培養(yǎng)基不宜多，以保持組織塊濕潤即可，培養(yǎng)24小時后再補液，培養(yǎng)初期移動和觀察時要輕拿輕放，開始幾天盡量不去搬動，以利貼壁和生長，培養(yǎng)3~～5天時可換液，一方面補充營養(yǎng)，一方面去除代謝產(chǎn)物和漂浮小塊所產(chǎn)生的毒性作用。注意事項組織塊接種后1-3天，由于游出細胞數(shù)量較少，組織塊粘貼不牢固，在觀察和移動過程中要注意輕拿輕放，盡量不要引起液體的流動而產(chǎn)生對組織塊的沖擊力使其漂浮。原代培養(yǎng)3-5天后，需換液一次，因為已漂浮的組織塊和很多細胞碎片含有有毒物質(zhì)，影響原代細胞的生長，要及時清除。2.消化培養(yǎng)法消化培養(yǎng)法是采用組織消化分散法將細胞間質(zhì)包括基質(zhì)、纖維等妨礙細胞生長的物質(zhì)去除，使細胞分散，形成懸液，從而易用于從外界吸收養(yǎng)分和排出代謝產(chǎn)物。優(yōu)點：快速得到大量活細胞，細胞也能在短時間內(nèi)生長成片，適用于培養(yǎng)大量組織，原代細胞產(chǎn)量高。缺點：步驟繁瑣、易污染，一些消化酶價格昂貴，實驗成本高。消化培養(yǎng)法的基本步驟操作方法①按消化分離法獲得細胞②在消化過程中，可隨時吸取少量消化液在鏡下觀察，如發(fā)現(xiàn)組織已分散成細胞團或單個細胞，則終止消化。如有組織塊，可用孔徑適當?shù)暮Y網(wǎng)將其濾掉。大組織可加入新的消化液繼續(xù)消化。③將已過濾的消化液以800-1000r/min低速離心后，棄上清液，加含血清的培養(yǎng)液，輕輕吹打形成懸浮液。細胞計數(shù)后，接種細胞培養(yǎng)瓶，置5%CO2溫箱培養(yǎng)。④某些特殊類型細胞，如內(nèi)皮細胞、骨髓細胞等，需用特殊消化手段和步驟進行。（二）動物細胞傳代培養(yǎng)技術(shù)1.原代培養(yǎng)的首次傳代使原代細胞經(jīng)分散接種的過程稱之為傳代。每進行一次分離再培養(yǎng)稱之為傳一代，傳至5～10代以內(nèi)的細胞通常稱為次代培養(yǎng)細胞，傳至10～20代以上的細胞，通常確定為傳代細胞（或稱傳代細胞系）。傳代細胞系的建立，關(guān)鍵是初代培養(yǎng)的首次傳代。應(yīng)注意如下幾點：（1）細胞生長密度不高時，或未能達到覆蓋整個瓶底時不能急于傳代。（2）原代培養(yǎng)的貼壁細胞多為混雜細胞，形態(tài)各異，往往是上皮樣細胞和成纖維樣細胞并存，采用胰蛋白酶消化時要掌握好消化時間，因成纖維細胞易于脫壁，上皮細胞不易脫壁，因此，可根據(jù)需要選用適當?shù)南瘯r間及時中止消化。在早先傳代時，其消化時間比一般已建系的細胞相對長一些。（3）吹打已消化的細胞要輕巧，既不能聽到有明顯的吹打聲，又不能有大量泡沫在懸液中形成，以盡可能減少對細胞的機械損傷。（4）首次傳代時細胞接種數(shù)量要多一些，以利于細胞的生存和繁殖。如果消化分離的細胞懸液有組織塊，也一并傳入到培養(yǎng)瓶，盡量減少細胞損失。（5）首次傳代培養(yǎng)時的pH不能高，寧可偏低一些。此外，小牛血清濃度可適當加大至15%~20%左右。2.細胞傳代方法（1）貼壁生長的消化傳代①吸棄或倒掉瓶內(nèi)陳舊培養(yǎng)液。②在培養(yǎng)瓶內(nèi)加入適量消化液。③消化2～5min后吧培養(yǎng)瓶放置于顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細胞質(zhì)回縮、細胞間隙增大后，應(yīng)立即停止消化。④吸除或倒掉消化液。⑤用吸管吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，按順序反復(fù)吹打瓶壁細胞，從培養(yǎng)瓶底部一邊開始到另一邊結(jié)束，以確保所有底部都被吹到。⑥計數(shù)后，按要求的接種量接種在新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。（2）懸浮細胞的傳代①直接傳代使懸浮細胞慢慢沉淀瓶底，吸掉1/2～1/3的上清液，用吸管吹打形成細胞懸浮液后再傳代。②離心收集細胞后傳代將細胞連同培養(yǎng)液一并轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以8001000r/min離心5min，棄上清液，加入新的培養(yǎng)液到離心管內(nèi)，用吸管輕輕吹打使之形成細胞懸液，然后傳代接種。懸浮細胞多采用此法。3.細胞系的維持(1)細胞檔案細胞檔案要記錄好，如組織來源、生物學(xué)特性（由形態(tài)、生長繁殖曲線、染色體核型情況、代謝特性、分化特性、病毒敏感性、致瘤特性、有無支原體和潛存病毒等）、培養(yǎng)基的要求、傳代換液時間、擴增時間（分裂指數(shù)），細胞的特殊遺傳標志（標記染色體）等，這些記錄對于保證細胞的正常生長，保持細胞的一致和經(jīng)長期培養(yǎng)細胞特性的變異比較，都有十分重要的意義。(2)遵從細胞生長的規(guī)律性細胞系的傳代、換液方法一般都有自身的規(guī)律性，因而在繼續(xù)傳代時，要注意保持其穩(wěn)定的規(guī)律性，這樣可以減少由于傳代時細胞密度的頻繁增減或換液時間的不規(guī)律而導(dǎo)致細胞生長特性的改變，給以后的實驗帶來影響。(3)防止細胞間交叉感染多種細胞系維持傳代，要嚴格操作程序，對所用的試劑各系不能交叉。每傳5代后，細胞種子均應(yīng)凍存。傳代時均應(yīng)作好記錄，培養(yǎng)瓶上要有明顯標記，標記細胞系名稱和傳代的代數(shù)及傳代時間。(4)及時凍存防丟失細胞種子的及時凍存不僅可防止污染丟失，而且還可防止因盲目傳代而造成細胞變異，此外還可提供不同代次的細胞同時進行對比試驗。（5）細胞系（或株）的鑒定和管理三、動物細胞培養(yǎng)的環(huán)境要求主要有細胞生長的支持物、氣體交換、培養(yǎng)溫度、pH值、滲透壓及其他因素等方面。1.支持物（1）玻璃很便宜，容易洗滌，且不損失支持生長的性質(zhì)，可方便地用于干熱和濕熱滅菌，透光性好，強堿可使玻璃對培養(yǎng)產(chǎn)生不良影響，但用酸洗中和后即可。（2）塑料制品細胞培養(yǎng)用的塑料用品要用γ射線、化學(xué)藥品或電弧處理使之產(chǎn)生帶電荷的表面，具有可濕潤性。（3）微載體材料有聚苯乙烯、交聯(lián)葡萄糖、聚丙烯酰胺、纖維素衍生物、幾丁質(zhì)、明膠等。優(yōu)點是使貼壁細胞可以像懸浮培養(yǎng)那樣進行。2.氣體交換（1）氧氣氧參與三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生能量供給細胞生長、增殖以及合成各種成分。一些細胞在缺氧情況下，借糖酵解也可獲取能量，但多數(shù)細胞缺氧不能生存。在開放培養(yǎng)時，一般置細胞于95％空氣加5％二氧化碳的混合氣體環(huán)境中培養(yǎng)。（2）二氧化碳二氧化碳既是細胞代謝產(chǎn)物，也是細胞所需成分，它主要與維持培養(yǎng)基的pH有直接關(guān)系。動物細胞大多數(shù)需要輕微的堿性條件，pH值約在7.2～7.4，在細胞生長過程中，隨細胞數(shù)量的增多和代謝活動的加強，二氧化碳不斷被釋放，培養(yǎng)液變酸，pH值發(fā)生變化。由于NaHCO3容易分解為二氧化碳，很不穩(wěn)定，致使緩沖系統(tǒng)難以精確地控制。故這一緩沖系統(tǒng)適合密閉培養(yǎng)。3.培養(yǎng)溫度哺乳動物及人源細胞最適培養(yǎng)溫度為35℃～37℃，對低溫耐受力比高溫強。39℃以上受損→死亡；不低于0℃時（0℃～34℃），細胞能生存，但代謝降低、分裂延緩。溫度調(diào)節(jié)的范圍最大不超過±0.5℃。4.pH值合適的pH值是細胞生存的必要條件之一，動物細胞合適的pH值一般在7.2～7.4，低于6.8或高于7.6都對細胞產(chǎn)生不利影響，嚴重時可導(dǎo)致細胞退變或死亡。維持細胞生存環(huán)境中的pH值至關(guān)重要，最常用的方法是加磷酸緩沖液，緩沖液中碳酸氫鈉具有調(diào)節(jié)CO2的作用。由于容易從環(huán)境中逸出，故只適用于封閉式培養(yǎng)。為克服碳酸氫鈉的缺點，有時采用羥乙基哌嗪乙烷硝酸（HEPES），它對細胞無作用，主要防止pH值迅速波動，具有較強的穩(wěn)定培養(yǎng)基pH值的能力。5.滲透壓細胞必須生活在等滲環(huán)境中，大多數(shù)培養(yǎng)細胞對滲透壓有一定耐受性。人血漿滲透壓290mOsm/kg,可視為培養(yǎng)人體細胞的理想滲透壓。鼠細胞滲透壓在320mOsm/kg左右。對于大多數(shù)哺乳動物細胞，滲透壓在260～320mOsm/kg的范圍都適宜。四、動物細胞生物反應(yīng)器（一）生物反應(yīng)器的分類目前，動物細胞培養(yǎng)用生物反應(yīng)器主要包括：轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)器、塑料袋增殖器、填充床反應(yīng)器、多層板反應(yīng)器、螺旋膜反應(yīng)器、管式螺旋反應(yīng)器、陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀反應(yīng)器、流化床反應(yīng)器、中空纖維及其它膜式反應(yīng)器、攪拌反應(yīng)器、氣升式反應(yīng)器等。按其培養(yǎng)細胞的方式不同，這些反應(yīng)可分為以下三類。懸浮培養(yǎng)用反應(yīng)器，如攪拌反應(yīng)器、中空纖維反應(yīng)器、陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀反應(yīng)器、氣升式反應(yīng)器。貼壁培養(yǎng)用反應(yīng)器，如攪拌反應(yīng)器（微載體培養(yǎng)）、玻璃珠床反應(yīng)器、中空纖維反應(yīng)器、陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀反應(yīng)器。包埋培養(yǎng)用反應(yīng)器，如流化床反應(yīng)器、固化床反應(yīng)器。1.攪拌罐生長反應(yīng)器這是最經(jīng)典、最早被采用的一種生物反應(yīng)器。此類反應(yīng)器與傳統(tǒng)的微生物生物反應(yīng)器類似，針對動物細胞培養(yǎng)的特點，采用了不同的攪拌器及通氣方式。通過攪拌器的作用使細胞和養(yǎng)分在培養(yǎng)液中均勻分布，使養(yǎng)分充分被細胞利用，并增大氣液接觸面，有利于氧的傳遞。現(xiàn)已開發(fā)的有：籠式通氣攪拌器、雙層籠式通氣攪拌器、槳式攪拌器等。

2.氣升式生物反應(yīng)器1979年首次應(yīng)用氣升式生物反應(yīng)器成功的進行了動物細胞的懸浮培養(yǎng)。其優(yōu)點：罐內(nèi)液體流動溫和均勻，產(chǎn)生剪切力小，對細胞損傷較??；可直接噴射空氣供氧，因而氧傳遞率較高；液體循環(huán)量大，細胞和養(yǎng)分都能均勻分布于培養(yǎng)液中；結(jié)構(gòu)簡單，利于密封并降低了造價。常用的氣升式反應(yīng)器有三種：內(nèi)循環(huán)式氣升式、外循環(huán)式氣升式、內(nèi)外循環(huán)式氣升式生物反應(yīng)器。3.鼓泡式生物反應(yīng)器與氣升式反應(yīng)器相類似，是利用氣體鼓泡來進行供氧及混合，其設(shè)計原理與氣升式生物反應(yīng)器也相同。4.中空纖維生物反應(yīng)器用途較廣，既可用于懸浮細胞的培養(yǎng)，又可用于貼壁細胞的培養(yǎng)。原理：模擬細胞在體內(nèi)生長的三維狀態(tài)，利用反應(yīng)器內(nèi)數(shù)千根中空纖維的縱向布置，提供細胞近似生理條件的體外生長微環(huán)境，使細胞不斷生長。中空纖維是一種細微的管狀結(jié)構(gòu)，管壁為極薄的半透膜，富含毛細管，培養(yǎng)時纖維管內(nèi)灌流充以氧氣的無血清培養(yǎng)液，管外壁則供細胞黏附生長，營養(yǎng)物質(zhì)通過半透膜從管內(nèi)滲透出來供細胞生長；對于血清等大分子營養(yǎng)物，必須從管外灌入，否則會被半透膜阻隔不能被細胞利用；細胞的代謝廢物也可通過半透膜滲入管內(nèi)，避免了過量代謝物對細胞的毒害作用。優(yōu)點是：占地空間少；細胞產(chǎn)量高，細胞密度可達109數(shù)量級；生產(chǎn)成本低，且細胞培養(yǎng)維持時間長，適用于長期分泌的細胞。中空纖維細胞培養(yǎng)反應(yīng)器流程5.微載體培養(yǎng)技術(shù)（microcarrierculturetechnique）及反應(yīng)器微載體：是指直徑在60-250μm，能適用于貼壁細胞生長的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各種合成的聚合物組成。微載體的表面帶少量正電荷，能促進細胞貼壁。微載體培養(yǎng)法:將動物細胞吸附于微載體表面，微載體(帶著細胞)懸浮于培養(yǎng)基中，使細胞在微載體表面長成單層的培養(yǎng)方法。微載體培養(yǎng)兼具懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點，是目前公認的最有發(fā)展前途的一種動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)。微載體培養(yǎng)原理：是將對細胞無害的顆粒-微載體加入到培養(yǎng)容器的培養(yǎng)液中，作為載體，使細胞在微載體表面附著生長，同時通過持續(xù)攪動使微載體始終保持懸浮狀態(tài)。微載體培養(yǎng)優(yōu)點

（1）表面積/體積（S/V）大，因此單位體積培養(yǎng)液的細胞產(chǎn)率高；（2）把懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)融合在一起，兼有兩者的優(yōu)點；（3）可用簡單的顯微鏡觀察細胞在微珠表面的生長情況；（4）簡化了細胞生長各種環(huán)境因素的檢測和控制，重現(xiàn)性好；（5）培養(yǎng)基利用率較高；

（6）放大容易；

（7）細胞收獲過程不復(fù)雜；（8）勞動強度?。唬?）培養(yǎng)系統(tǒng)占地面積和空間小。微載體培養(yǎng)操作要點培養(yǎng)初期：保證培養(yǎng)基與微球體處于穩(wěn)定的PH與溫度水平，接種細胞（對數(shù)生長期，而非穩(wěn)定期）至終體積1/3的培養(yǎng)液中，以增加細胞與微載體接觸的機會。不同的微載體所用濃度及接種細胞密度是不同的。常使用2-3g/L的微載體含量，更高的微載體濃度需要控制環(huán)境或經(jīng)常換液。貼壁階段（3-8d）后，緩慢加入培養(yǎng)液至工作體積，并且增加攪拌速度保證完全均質(zhì)混合。培養(yǎng)維持期：進行細胞計數(shù)（胞核計數(shù)）、葡萄糖測定及細胞形態(tài)鏡檢。隨意細胞增殖，微球變得越來越重，需增加攪拌速率。經(jīng)過3d左右，培養(yǎng)液開始呈酸性，需換液：停止攪拌，讓微珠沉淀5min，棄掉適宜體積的培養(yǎng)液，緩慢加入新鮮培養(yǎng)液（37℃），重新開始攪拌。收獲細胞：排干培養(yǎng)液，至少用緩沖液漂洗一遍，然后加入相應(yīng)的酶，快速攪拌（75-125r/min）20-30min，然后解離收集細胞及其產(chǎn)品。微載體培養(yǎng)的放大：可以通過增加微載體的含量或培養(yǎng)體積進行放大。微載體培養(yǎng)系統(tǒng)（二）生物反應(yīng)器的設(shè)計和放大設(shè)計的總體原則包括以下幾個方面。①結(jié)構(gòu)嚴密，能耐受蒸汽滅菌，采用對生物催化劑無害和耐蝕材料制作，內(nèi)壁光滑無死角，內(nèi)部附件盡量減少，以維持純種培養(yǎng)需要；②有良好的氣-液接觸和液-固混和性能和熱量交換性能，使質(zhì)量與熱量傳遞有效地進行；③保證產(chǎn)物質(zhì)量和產(chǎn)量前提下，盡量節(jié)省能源消耗；④減少泡沫產(chǎn)生，或附有消沫裝置以提高裝料系數(shù)，并有必要可靠的參數(shù)檢測和控制儀表并能與計算機聯(lián)機。

通常細胞生長所需要的氧氣控制在30%～70%。氧氣傳遞速率（oxygentransferrate,OTR）OTR=KLa(C*－CL)KLa為氧的傳遞系數(shù)；C*為相當氣相氧分壓的溶氧濃度，CL為培養(yǎng)液中溶氧濃度。影響供氧的因素總體上講是KLa和C*－CL值。要增大C*－CL，無非是增大C*值或降低CL值。增大C*的措施，有適當增加反應(yīng)器中操作壓力和增大氣相中的氧分壓兩個方法。影響KLa的因素大致可分為三個方面：一是反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)，包括相對幾何尺寸的比例；二是操作條件，如攪拌功率或循環(huán)泵功率的輸入量，通氣量等；三是培養(yǎng)或發(fā)酵液的物理化學(xué)性質(zhì)，如流變特性，特別是其粘度或顯示粘度、表面張力、擴散系數(shù)、細胞形態(tài)、泡沫程度等。五、動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)（一）動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)方法（二）大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的操作方式（一）動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)方法（1）貼壁培養(yǎng)生長時必須要有給以貼附的支持物表面，細胞依靠自身分泌的或培養(yǎng)基中提供的貼附因子才能在該表面上生長和繁殖，細胞在表面上生長時有兩種形態(tài)，成纖維樣細胞型和上皮樣細胞型。成纖維樣細胞型主要來源于中胚層組織細胞心肌細胞、平滑肌細胞成骨細胞等，上皮樣細胞型主要來源于外胚層和內(nèi)胚層組織細胞，皮膚細胞、腸管上皮細胞，在培養(yǎng)過程中，隨著培養(yǎng)條件的變化細胞形態(tài)也會發(fā)生改變。（2）懸浮培養(yǎng)生長不依賴支持物表面，在培養(yǎng)液中懸浮生長，如淋巴細胞等。（3）固定化培養(yǎng)根據(jù)生長條件的不同可貼壁也可懸浮生長，中國地鼠卵巢細胞。（二）大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的操作方式深層培養(yǎng)可分為：分批式、流加式、半連續(xù)式、連續(xù)式和灌注式五種。1.分批式培養(yǎng)2.流加式培養(yǎng)3.半連續(xù)式培養(yǎng)4.連續(xù)式培養(yǎng)5.灌注式培養(yǎng)1.分批式培養(yǎng)（batchculture）分批式培養(yǎng)是細胞規(guī)模培養(yǎng)發(fā)展進程中較早期采用的方式，也是其它操作方式的基礎(chǔ)。該方式采用機械攪拌式生物反應(yīng)器，將細胞擴大培養(yǎng)后，一次性轉(zhuǎn)入生物反應(yīng)器內(nèi)進行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中其體積不變，不添加其它成分，待細胞增長和產(chǎn)物形成積累到適當?shù)臅r間，一次性收獲細胞、產(chǎn)物、培養(yǎng)基的操作方式。

特點:操作簡單。培養(yǎng)周期短，染菌和細胞突變的風險小。直觀反映細胞生長代謝的過程。因培養(yǎng)期間細胞生長代謝是在一個相對固定的營養(yǎng)環(huán)境，不添加任何營養(yǎng)成分，因此可直觀的反映細胞生長代謝的過程,是動物細胞工藝基礎(chǔ)條件或"小試"研究常用的手段；可直接放大。由于培養(yǎng)過程工藝簡單，對設(shè)備和控制的要求較低，設(shè)備的通用性強，反應(yīng)器參數(shù)的放大原理和過程控制，比較其它培養(yǎng)系統(tǒng)較易理解和掌握，在工業(yè)化生產(chǎn)中分批式培養(yǎng)操作是傳統(tǒng)的、常用的方法，其工業(yè)反應(yīng)器規(guī)模可達12000L。分批培養(yǎng)過程中，細胞的生長分為五個階段：延滯期、對數(shù)生長期、減速期、平穩(wěn)期和衰退期。典型的分批培養(yǎng)隨時間變化的過程曲線2.流加式培養(yǎng)（feedingculture）流加式培養(yǎng)是在批式培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，采用機械攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)，懸浮培養(yǎng)細胞或以懸浮微載體培養(yǎng)貼壁細胞，細胞初始接種的培養(yǎng)基體積一般為終體積的1/2～1/3，在培養(yǎng)過程中根據(jù)細胞對營養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗和需求，流加濃縮的營養(yǎng)物或培養(yǎng)基，從而使細胞持續(xù)生長至較高的密度，目標產(chǎn)品達到較高的水平，整個培養(yǎng)過程沒有流出或回收，通常在細胞進入衰亡期或衰亡期后進行終止回收整個反應(yīng)體系，分離細胞和細胞碎片，濃縮、純化目標蛋白。流加培養(yǎng)是當前動物細胞培養(yǎng)中占有主流優(yōu)勢的培養(yǎng)工藝，也是近年來動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)研究的熱點。流加培養(yǎng)中的關(guān)鍵技術(shù)是基礎(chǔ)培養(yǎng)基和流加濃縮的營養(yǎng)培養(yǎng)基。流加的總體原則是維持細胞生長相對穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境。營養(yǎng)成分過剩會產(chǎn)生大量的代謝副產(chǎn)物造成營養(yǎng)利用效率下降而成為無效的利用，營養(yǎng)成分缺乏會導(dǎo)致細胞生長抑制或死亡。流加工藝中的營養(yǎng)成分主要有以下三大類。葡萄糖葡萄糖是細胞的供能物質(zhì)和主要的碳源物質(zhì)，當其濃度較高是會產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物乳酸，因而需要進行其濃度控制，以足夠維持細胞生長而不至于產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物的濃度為佳。谷氨酰胺谷氨酰胺是細胞的供能物質(zhì)和主要的氮源物質(zhì)，然而當其濃度較高是會產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物氨，因而也需要進行其濃度控制，以足夠維持細胞生長而不至于產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物的濃度為佳；大規(guī)模培養(yǎng)中細胞凋亡主要由于營養(yǎng)物質(zhì)的耗竭或代謝產(chǎn)物的堆積引起，如谷氨酰胺的耗竭是最常見的凋亡原因，而且凋亡一旦發(fā)生，補加谷氨酰胺已不能逆轉(zhuǎn)凋亡。另外，動物細胞在無血清、無蛋白培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)時，細胞變得更為脆弱，更容易發(fā)生凋亡。氨基酸、維生素及其他主要包括營養(yǎng)必需氨基酸、營養(yǎng)非必需氨基酸、一些特殊的氨基酸如羥脯氨酸、羧基谷氨酸和磷酸絲氨酸；此外還包括其他營養(yǎng)成分如膽堿、生長刺激因子。添加的氨基酸形式多為左旋氨基酸，因而多以鹽或前體的形式替代單分子氨基酸，或者添加四肽或短肽的形式。在進行添加時，不溶性氨基酸如胱氨酸、酪氨酸和色氨酸只在中性pH值部分溶解，可采用泥漿的形式進行脈沖式添加；其他的可溶性氨基酸以溶液的形式用蠕動泵進行緩慢連續(xù)流加。流加式培養(yǎng)分為單一補料分批式培養(yǎng)和反復(fù)補料分批式培養(yǎng)。單一補料分批式培養(yǎng)是在培養(yǎng)開始時投入一定量的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，培養(yǎng)到一定時期，開始連續(xù)補加濃縮營養(yǎng)物質(zhì)，直到培養(yǎng)液體積達到生物反應(yīng)器的最大操作容積，停止補加，最后將細胞培養(yǎng)液一次全部放出。該操作方式受到反應(yīng)器操作容積的限制，培養(yǎng)周期只能控制在較短的時間內(nèi)。反復(fù)補料分批式培養(yǎng)是在單一補料分批式操作的基礎(chǔ)上，每個一定時間按一定比例放出一部分培養(yǎng)液，是培養(yǎng)液體積始終不超過反應(yīng)器的最大操作容積，從而在理論上可以延長培養(yǎng)周期，直至培養(yǎng)效率下降，才將培養(yǎng)液全部放出。

3.半連續(xù)式培養(yǎng)（semi-continuousculture）半連續(xù)式培養(yǎng)又稱為重復(fù)分批式培養(yǎng)或換液培養(yǎng)。采用機械攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)，懸浮培養(yǎng)形式。在細胞增長和產(chǎn)物形成過程中，每間隔一段時間，從中取出部分培養(yǎng)物，再用新的培養(yǎng)液補足到原有體積，使反應(yīng)器內(nèi)的總體積不變。半連續(xù)式培養(yǎng)時，培養(yǎng)物的體積逐步增加，可進行多次收獲，細胞可持續(xù)指數(shù)生長，并可保持產(chǎn)物和細胞在較高的濃度水平，培養(yǎng)過程可延續(xù)到很長時間。該操作方式的優(yōu)點是操作簡便，生產(chǎn)效率高，可長時期進行生產(chǎn)，反復(fù)收獲產(chǎn)品，可使細胞密度和產(chǎn)品產(chǎn)量一直保持在較高的水平。在動物細胞培養(yǎng)和藥品生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用。4.連續(xù)式培養(yǎng)（continuousculture）是一種常見的懸浮培養(yǎng)模式，采用機械攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)。該模式是將細胞接種與一定體積的培養(yǎng)基后，為了防止衰退期的出現(xiàn)，在細胞達最大密度之前，以一定速度向生物反應(yīng)器連續(xù)添加新鮮培養(yǎng)基；同時，含有細胞的培養(yǎng)物以相同的速度連續(xù)從反應(yīng)器流出，以保持培養(yǎng)體積的恒定。理論上講，該過程可無限延續(xù)下去。優(yōu)點：反應(yīng)器的培養(yǎng)狀態(tài)可以達到恒定，細胞在穩(wěn)定狀態(tài)下生長。連續(xù)式培養(yǎng)不足是容易造成污染，細胞的生長特性以及分泌產(chǎn)物容易變異，對設(shè)備、儀器的控制技術(shù)要求較高。連續(xù)式培養(yǎng)的特點主要表現(xiàn)在細胞維持持續(xù)指數(shù)增長，產(chǎn)物體積不斷增長，可控制衰退期與下降期。5.灌流式培養(yǎng)（perfusionculture）灌流式培養(yǎng)是把細胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細胞增長和產(chǎn)物形成過程中，不斷地將部分培養(yǎng)基取出，同時又連續(xù)不斷地灌注新的培養(yǎng)基。與半連續(xù)式操作的不同之處在于取出部分培養(yǎng)基時，絕大部分細胞均保留在反應(yīng)器內(nèi)，而半連續(xù)培養(yǎng)在取培養(yǎng)物時同時也取出了部分細胞。灌流式培養(yǎng)具有很大的優(yōu)點。細胞截流系統(tǒng)可使細胞或酶保留在反應(yīng)器內(nèi)，維持較高的細胞密度，一般可達107～109個/ml，從而較大的提高了產(chǎn)品的產(chǎn)量；連續(xù)灌流系統(tǒng)，使細胞穩(wěn)定的處在較好的的營養(yǎng)環(huán)境中，有害代謝廢物濃度積累較低；反應(yīng)速率容易控制，培養(yǎng)周期較長，可提高生產(chǎn)率，目標產(chǎn)品回收率高；產(chǎn)品在罐內(nèi)停留時間短，可及時回收到低溫下保存，有利于保持產(chǎn)品的活性。灌流式培養(yǎng)常使用的生物反應(yīng)器主要有兩種形式：攪拌式生物反應(yīng)器、固定床或流化床生物反應(yīng)器。攪拌式生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)細胞，必須具有細胞截流裝置，細胞截留系統(tǒng)開始多采用微孔膜過濾或旋轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)，最近開發(fā)的有各種形式的沉降系統(tǒng)或透析系統(tǒng)。它采用的中空纖維半透膜，透過小分子量的產(chǎn)物和底物，截流細胞和分子量較大的產(chǎn)物，在連續(xù)灌流過程中將絕大部分細胞截留在反應(yīng)器內(nèi)；近年來中空纖維生物反應(yīng)器被廣泛應(yīng)用于產(chǎn)物分泌性動物細胞的生產(chǎn)，主要用于培養(yǎng)雜交瘤細胞生產(chǎn)單克隆抗體。固定床是在反應(yīng)器中裝配固定的籃筐，中間裝填聚脂纖維載體，細胞可附著在載體上生長，也可固定在載體纖維之間，靠攪拌中產(chǎn)生的負壓，迫使培養(yǎng)基不斷流經(jīng)填料，有利于營養(yǎng)成分和氧的傳遞，這種形式的灌流速度較大，細胞在載體中高密度生長。流化床生物反應(yīng)器是通過流體的上升運動使固體顆粒維持在懸浮狀態(tài)進行反應(yīng)，適合于固定化細胞的培養(yǎng)。6.細胞工廠(cellfactory)培養(yǎng)細胞工廠培養(yǎng)是一種設(shè)計精巧的細胞培養(yǎng)裝置。它在有限的空間內(nèi)利用了最大限度的培養(yǎng)表面，從而節(jié)省了大量的廠房空間，并可節(jié)省貴重的培養(yǎng)液。更重要的是，它可有效地保證操作的無菌性，從而避免因污染而帶來的原料、勞務(wù)和時間損失。它是對傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的革命。第二節(jié)植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)一、植物細胞培養(yǎng)技術(shù)概述二、植物細胞培養(yǎng)流程和方法三、植物細胞生物反應(yīng)器四、植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)一、植物細胞培養(yǎng)技術(shù)概述1.植物細胞形態(tài)2.植物細胞基本結(jié)構(gòu)3.植物細胞培養(yǎng)的概念4.植物細胞培養(yǎng)特性5.植物細胞培養(yǎng)所需營養(yǎng)物質(zhì)6.植物細胞培養(yǎng)的主要條件植物細胞培養(yǎng)是在離體條件下，將愈傷組織或其他易分散的組織置于液體培養(yǎng)基中進行震蕩培養(yǎng)，得到分散成游離的懸浮細胞，通過繼代培養(yǎng)使細胞增殖，從而獲得大量細胞群體的一種技術(shù)。根據(jù)培養(yǎng)對象，植物細胞培養(yǎng)主要有單細胞培養(yǎng)，單倍體培養(yǎng)，原生質(zhì)體培養(yǎng)等。按照培養(yǎng)系統(tǒng)可分為懸浮培養(yǎng)、液體培養(yǎng)、固體培養(yǎng)、固定化培養(yǎng)等。植物細胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展1902年，德國植物學(xué)家哈貝蘭特依據(jù)細胞學(xué)說認為，高等植物的器官和組織可以分離成單個細胞，而每一個分離出來的細胞都具有進一步分裂和發(fā)育的能力。1904年，亨寧（Henning）成功地進行了胡蘿卜和辣菜根的離體胚的生長。1927年，溫特（Went）發(fā)現(xiàn)了生長素吲哚乙酸（IAA）能促進細胞的生長。20世紀30年代，人們發(fā)現(xiàn)通過細胞或組織培養(yǎng)可使植物再生。1939年，高特里特（Gautheret）、諾伯科特（Nobercourt）和懷特（White）分別成功地培養(yǎng)了煙草、蘿卜和楊樹等細胞，并形成部分組織。至此，植物細胞培養(yǎng)才真正開始。1956年，Roetier等首先申請了用植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)生物化學(xué)物質(zhì)的專利。70年代后，引入外源基因的植物細胞可以產(chǎn)生人們所需要的產(chǎn)物。20世紀七十年代末到八十年代初，優(yōu)化細胞生長和次級代謝產(chǎn)物形成的研究能產(chǎn)生大量植物次生代謝產(chǎn)物，如培養(yǎng)紅豆杉細胞生產(chǎn)的抗癌新藥紫杉醇。1.植物細胞形態(tài)多細胞植物其細胞形態(tài)多種多樣，球形、類圓形、橢圓形、角形；具有支持作用的細胞細胞壁常增厚，類圓形、紡錘形；具有輸導(dǎo)作用的細胞管形。細胞大小不一，基本組織細胞體積較大直徑在20～100微米之間，儲藏組織細胞的直徑可達1毫米，最長的細胞是無節(jié)乳管長達數(shù)米至數(shù)十米。2.植物細胞基本結(jié)構(gòu)植物細胞結(jié)構(gòu)示意圖3.植物細胞培養(yǎng)的概念（1）植物組織和細胞培養(yǎng)植物組織和細胞培養(yǎng)是指在無菌和人工控制的營養(yǎng)（培養(yǎng)基）及環(huán)境條件（光照、溫度）下，研究植物的細胞、組織和器官以及控制其生長發(fā)育的技術(shù)。植物無菌培養(yǎng)包括：幼苗及較大植株的培養(yǎng)（植物培養(yǎng)）；從植物體各種器官的外植體增殖而形成的愈傷組織的培養(yǎng)（愈傷組織培養(yǎng)）；能夠保持較好分散性的離體細胞或較小細胞團的液體培養(yǎng)（懸浮培養(yǎng)）；離體器官的培養(yǎng)（器官培養(yǎng)）；未成熟或成熟的胚胎的離體培養(yǎng)（胚胎培養(yǎng)）。（2）懸浮培養(yǎng)：在液體培養(yǎng)基中，能夠保持良好分散性的細胞和小的細胞聚集體的培養(yǎng)。組織化水平較低。（3）細胞培養(yǎng)：利用單個細胞進行液體或固體培養(yǎng)，誘導(dǎo)其增殖及分化。目的是為了得到單細胞無性繁殖系。（4）分生組織培養(yǎng)：又稱生長錐培養(yǎng)，在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)莖端分生組織細胞。（5）外植體：用于植物組織（細胞）培養(yǎng)的器官或組織（的切段），植物的個部位如根、莖、葉、花、果、穗、胚珠、胚乳、花藥和花粉等均可作為外植體進行組織培養(yǎng)。（6）愈傷組織：指從植物受傷部位或組織培養(yǎng)物產(chǎn)生的由分化和未分化細胞組成的一類薄壁組織。愈傷組織通常沒有固定形狀，可使傷口愈合，使表面的細胞呈木栓化而起著保護作用。當植物扦插時，愈傷組織可形成不定根；在植物嫁接時，愈傷組織可使接穩(wěn)和砧木愈合；在植物組織培養(yǎng)中，愈傷組織常可形成不定芽。植物細胞培養(yǎng)的基本過程（7)花粉培養(yǎng)：在無菌條件下取出花藥或從花藥中取出花粉粒（小孢子），置于人工培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，形成花粉胚或花粉愈傷組織，最后長成花粉植株（圖1-4-5）。由于這種植株含有的染色體數(shù)目只相當體細胞的一半，故又稱單倍體植株。單倍體植株經(jīng)過染色體加倍就成為純合的雙倍體植株?；ǚ叟囵B(yǎng)目前已成為植物細胞育種的一種重要手段，并已取得重要成果?；ǚ叟囵B(yǎng)的基本過程(8)原生質(zhì)體培養(yǎng):植株的幼胚、根、莖、葉等組織細胞都能進行培養(yǎng)。首先用纖維素酶或果膠酶除去植物體細胞的細胞壁，去壁的細胞稱為原生質(zhì)體。原生質(zhì)體在良好的培養(yǎng)基上可以生長與分裂，并通過愈傷組織誘導(dǎo)分化長出莖、葉，再長出根而形成植株。原生質(zhì)體培養(yǎng)一方面可以提高變異頻率，另一方面可以為應(yīng)用細胞工程技術(shù)進行遺傳重組提供有用的材料，細胞融合和基因轉(zhuǎn)移都必需在原生質(zhì)體上進行。原生質(zhì)體培養(yǎng)的基本過程（9）器官形成：是指在組織培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)物中芽、根或花等器官的分化與形成?；蛘咴谙刃纬傻男「垦杆傩纬捎鷤M織，然后再形成芽；或者在不同部位分別形成芽和根之后，再形成錐管組織而將二者連成一個軸，最后形成小植株。（10）無性繁殖又叫克隆，指使用母體培養(yǎng)物反復(fù)進行繼代培養(yǎng)時，通過同種外植體而獲得越來越多的無性繁殖后代。（11）突變體：細胞本身發(fā)生遺傳變異或應(yīng)用誘變處理發(fā)生的遺傳變異所得的新細胞。（12）繼代培養(yǎng)：由最初的外植體上切下的新增殖的組織，培養(yǎng)一代稱為“第一代培養(yǎng)”，連續(xù)多代的培養(yǎng)就稱為繼代培養(yǎng)。（13）次級代謝和次級代謝產(chǎn)物次級代謝作用是特殊蛋白質(zhì)內(nèi)源化合物的合成、代謝及分解作用的綜合體現(xiàn)。除了核酸、核苷、核苷酸、氨基酸、蛋白質(zhì)及糖類以外，具有如下特征的成分成為次級代謝產(chǎn)物：有明顯的分類學(xué)區(qū)域界限；其合成需在一定的條件下才能發(fā)生；缺乏明確的生理功能；是生命的多余成分。包括生物堿、黃酮體、萜類、有機酸、木質(zhì)素等。4.植物細胞的培養(yǎng)特性

植物細胞的培養(yǎng)特性主要有：（1）細胞個體較大（較微生物細胞大得多），有纖維細胞壁，細胞抗剪切力差。（2）細胞生長速度較慢，容易被微生物污染，培養(yǎng)時需添加抗生素。（3）細胞培養(yǎng)過程中易聚集成團，較難進行懸浮培養(yǎng)。（4）培養(yǎng)時需供養(yǎng)，但培養(yǎng)液粘度較大，不能耐受強力通風攪拌。（5）植物細胞具有群體效應(yīng)及解除抑制性。（6）細胞培養(yǎng)產(chǎn)物滯留于細胞內(nèi)，產(chǎn)量低。（7）植物細胞具有結(jié)構(gòu)和功能全能性，即培養(yǎng)的細胞可以分化成完整的植株。5.植物細胞培養(yǎng)所需營養(yǎng)物質(zhì)

植物細胞的培養(yǎng)基主要包括：①無機鹽：根據(jù)工作濃度差異又分為大量元素“N、P、K、Ca、Mg、S”和微量元素“Fe、Mn、Zn、Cu、Mo”等。②碳源：蔗糖、葡萄糖、果糖等。③有機氮源：雖然植物細胞在培養(yǎng)過程中能合成氨基酸，但加入某些氨基酸效果更好。④生長調(diào)節(jié)素：植物生長素、細胞激動素、赤霉素和脫落酸（赤霉素和脫落酸對某些細胞起促進作用，而對另一些細胞則起抑制作用，所以不常用）。⑤維生素：VB1、VB3、VB6、VC、生物素、葉酸、泛酸等。6.植物細胞培養(yǎng)的主要條件成功的植物細胞培養(yǎng)需要特別關(guān)注正確的無菌技術(shù)和溫度控制。①保證操作過程無菌：現(xiàn)在廣泛采用層流櫥作無菌接種設(shè)備。均一的特殊高效無菌過濾的空氣（HEPA）從櫥的后部吹出，當容器打開時起到保護培養(yǎng)物的作用。②溫度：多數(shù)細胞培養(yǎng)物僅在很窄的溫度范圍內(nèi)才能很好地生長。最通常的生長溫度是25℃。③光照：愈傷組織和搖瓶培養(yǎng)物一般在配有燈的暗室中培養(yǎng)即可。高強度光照或持續(xù)低劑量光照會導(dǎo)致培養(yǎng)物變綠（形成少量葉綠體）或褐色（聚合苯的積累），因而抑制代謝產(chǎn)物的積累。再生細胞培養(yǎng)物最好使用冷的日光燈—引起可提供與日光接近的光譜。常用定時器以適用于日夜循環(huán)（16～18h光照，6～8h黑暗）。光能自養(yǎng)細胞的培養(yǎng)屬特例。④通氣：多數(shù)情況下，搖瓶中植物懸浮培養(yǎng)物比微生物培養(yǎng)物的需氧量少。而從搖瓶中取出培養(yǎng)物進行次代培養(yǎng)時，因許多防御系統(tǒng)的激活導(dǎo)致短期內(nèi)耗氧量的劇增，因此誘發(fā)后要迅速提高供氧量，可據(jù)實際情況調(diào)整通氣量。二、植物細胞培養(yǎng)流程和方法1.植物細胞培養(yǎng)流程植物細胞大量培養(yǎng)工藝流程2.植物細胞培養(yǎng)方法植物細胞的培養(yǎng)系統(tǒng)（1）單倍體細胞培養(yǎng)：主要用花藥在人工培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，可以從小孢子直接發(fā)育成胚狀體，然后長成單倍體植株；或者是通過組織誘導(dǎo)分化出芽和根，最終長成植株。（2）原生質(zhì)體培養(yǎng)：脫去全部細胞壁的細胞叫原生質(zhì)體，是一生物工程學(xué)概念。原生質(zhì)體是由質(zhì)膜所包圍的具有生活力的“裸露細胞”。原生質(zhì)體培養(yǎng)：對離體植物的原生質(zhì)體進行培養(yǎng)，形成完整植株的培養(yǎng)技術(shù)。（3）固體培養(yǎng)：凝固劑除特殊研究外，基本都使用瓊脂，濃度一般為2%-3%，細胞在培養(yǎng)基表面生長。（4）液體培養(yǎng)：可分為靜止培養(yǎng)和振蕩培養(yǎng)兩類。靜止培養(yǎng)不需要任何設(shè)備，適合于某些原生質(zhì)體的培養(yǎng)；振蕩培養(yǎng)需要搖床使培養(yǎng)物和培養(yǎng)基保持充分混合，以利于氣體交換。（5）懸浮培養(yǎng)：是指單細胞和小的細胞聚集集團塊懸浮于液體培養(yǎng)基中進行生長的過程，這些細胞不發(fā)生分化。懸浮培養(yǎng)細胞較在固定培養(yǎng)基上生長的愈傷組織的生長和代謝速度快，通過對培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的控制可進行更有效的操作。如加入前體可進行多種生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，加入中間體可提高次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，篩選細胞系可產(chǎn)生完整植株中不存在的化合物。（6）固定化培養(yǎng)：應(yīng)用廣泛、能夠保持細胞活性的固定化方法是將細胞包埋于海藻酸鹽或卡拉膠中。三、植物細胞生物反應(yīng)器植物細胞培養(yǎng)反應(yīng)器示意圖1.機械攪拌式生物反應(yīng)器2.非攪拌式生物反應(yīng)器

非攪拌式生物反應(yīng)器所產(chǎn)生的剪切力小，結(jié)構(gòu)簡單。其主要類型有：鼓泡式生物反應(yīng)器、氣升式生物反應(yīng)器、轉(zhuǎn)鼓式生物反應(yīng)器等。3.固定化細胞生物反應(yīng)器主要包括：填充床生物反應(yīng)器、流化床生物反應(yīng)器、膜生物反應(yīng)器流化床反應(yīng)器固定化細胞膜反應(yīng)器四、植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)（一）植物細胞的大規(guī)模懸浮培養(yǎng)（二）植物細胞或原生質(zhì)體的固定化培養(yǎng)（三）影響植物細胞培養(yǎng)的因素（一）植物細胞的大規(guī)模懸浮培養(yǎng)1.懸浮培養(yǎng)中的植物細胞的特性2.植物細胞培養(yǎng)液的流變特性3.植物細胞培養(yǎng)過程中的氧傳遞4.泡沫和表面黏附性5.懸浮細胞的生長與增殖6.細胞團和愈傷組織的再形成和植株的再生1.懸浮培養(yǎng)中的植物細胞的特性與