單基因遺傳病臨床全外顯子組測序性能驗證及室內質控規(guī)程

1T/SZASXXXX—XXXX單基因遺傳病臨床全外顯子組測序性能驗證及室內質控規(guī)程本文件規(guī)范了臨床全外顯子組測序性能驗證及室內質量控制（室內質控）的過程，涵蓋檢測性能和室內質控的要求、性能確認的過程、方法和評估要求等。本文件旨在為檢測服務提供商及提供相關檢測的各類檢測機構，在開展全外顯子組測序對人類基因組進行單基因遺傳病變異檢測時的質量控制程序提供規(guī)范性建議，包含但不局限于運行前性能確認及運行中室內質控的流程及要求，覆蓋范圍包括但不限于實驗操作、數(shù)據(jù)分析、結果判讀以及報告出具過程。適用于以大規(guī)模并行測序技術為技術路線的單基因遺傳性疾病全外顯子組測序，適用于該類型檢測服務提供商及提供相關檢測的各類檢測機構。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T19703—2020/ISO15194:2009體外診斷醫(yī)療器械生物源性樣品中量的測量有證參考物質及支持文件內容的要求GB/T35890—2018高通量測序數(shù)據(jù)序列格式規(guī)范GB/T42751—2023信息技術生物特征識別高通量測序基因分型系統(tǒng)規(guī)范GA/T1693—2020法庭科學DNA二代測序檢驗規(guī)范T/CHIA21.2—2021組學樣本處理與數(shù)據(jù)分析標準第2部分：全外顯子組測序數(shù)據(jù)分析T/SZAS13—2019基因組學數(shù)據(jù)集3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1高通量測序high-throughputsequencing能夠一次并行對大量核酸分子進行平行序列測定的技術，通常一次測序反應能產(chǎn)生不低于100M堿基對的測序數(shù)據(jù)。[來源：GB/T42751—2023，3.1]3.2外顯子組exome個體基因組中能夠編碼產(chǎn)生蛋白質氨基酸序列的DNA區(qū)域的總和，在人類基因組中往往呈不連續(xù)的片段分布，占整個人類基因組的1～2%。3.3全外顯子組測序wholeexomesequencing,WES利用探針雜交富集外顯子區(qū)域的DNA序列，然后通過高通量測序，主要識別和研究與疾病、種群進化相關的編碼區(qū)及其調控區(qū)域相關遺傳突變的技術手段。[來源：T/CHIA21.2—2021，3.3，有修改]3.4臨床全外顯子組測序clinicalwholeexomesequencing;cWES2T/SZASXXXX—XXXX利用序列捕獲技術將外顯子區(qū)域捕獲并富集后進行高通量基因測序，針對公共數(shù)據(jù)庫（如OMIM數(shù)據(jù)庫）中明確致病的基因，對獲得的全外顯子組數(shù)據(jù)進行單基因遺傳病相關的變異校正及解讀信息注釋，從而獲得與受檢者相關的遺傳病變異信息的檢測方法。3.5性能確認validation性能確認是指對未經(jīng)確認或自建的檢驗程序，以及明顯修改過的檢驗程序，通過提供客觀證據(jù)對特定的預期用途或應用要求已得到滿足的認定。臨床實驗室應根據(jù)相應臨床需要和目前技術水平制定檢驗程序分析性能標準（可接受的性能指標限值），作為確認結果解釋的主要依據(jù)。3.6Barcode一段特征性的脫氧核苷酸段片段，在多樣本混合測序時，充當識別特定樣本來源的唯一編號。[來源：GA/T1693—2020,3.10]3.7Q20測序數(shù)據(jù)中，堿基識別質量值大于20的堿基占所有堿基的比例。注：堿基識別質量值為20時，表示堿基的正確率為99%以上。Q20≥95%，[來源：T/SZAS13—2019,3.1.12，有修改]3.8Q30測序數(shù)據(jù)中，堿基識別質量值大于30的堿基占所有堿基的比例。注：堿基識別質量值為30時，表示堿基的正確率為99.9%以上。Q30≥85%[來源：T/SZAS13—2019,3.1.13，有修改]3.9平均測序深度averagesequencingdepth測序得到的落在目標區(qū)域的堿基數(shù)與目標區(qū)域長度的比值。3.10覆蓋度coverageratio捕獲芯片的覆蓋度指捕獲范圍占參考序列總區(qū)域的百分比。而外顯子組測序數(shù)據(jù)中的覆蓋度則是指將測序序列比對到參考序列上時，所有被比對到的區(qū)域占捕獲芯片范圍總區(qū)域的百分比。3.11單核苷酸變異singlenucleotidevariation;SNV在基因組水平，由單個核苷酸位點的變異（替代、插入或缺失）所引起的脫氧核糖核苷酸序列變異。[來源：T/SZAS13—2019,3.1.2，有修改]3.12插入缺失型變異insertionanddeletion;InDel在基因組的某個位置上所發(fā)生的小片段序列的插入或者缺失，插入或缺失片段的長度在50bp以下。[來源：T/SZAS13—2019,3.1.3]3.13拷貝數(shù)變異copynumbervariation;CNV大片段缺失和大片段重復又叫拷貝數(shù)變異，即連續(xù)較長的序列發(fā)生了缺失或者重復，與插入缺失型變異的區(qū)別在于變異的長度更長。3.14線粒體變異mitochondrialmutation線粒體DNA（mtDNA）發(fā)生的變異，這些變異可以導致線粒體功能障礙或疾病。3.15雜合性缺失lossofheterozygosity;LOH3T/SZASXXXX—XXXX包含拷貝數(shù)減少的雜合性缺失（copylosses-LOH,CL-LOH）和拷貝數(shù)中性雜合性缺失（copyneutral-LOH，CN-LOH）兩種情況。在一對同源染色體上，位于相同基因座的兩個等位基因中的一個發(fā)生缺失，導致的雜合狀態(tài)喪失，即CL-LOH；由同源重組等多種機制造成的，未發(fā)生拷貝數(shù)變化的等位基因失衡，則為CN-LOH。3.16短串聯(lián)重復序列shorttandemrepeats;STR短串聯(lián)重復序列是由2到6個核苷酸組成的序列，在基因組中串聯(lián)重復出現(xiàn)。3.17染色體非整倍體aneuploidy在正常的染色體組中，丟失或增加了一條或幾條完整的染色體，如單體（丟失單條染色體）和三體（額外增加一條染色體）。3.18靈敏度sensitivity靈敏度，又稱查全率或召回率，它是針對真實結果而言的，是指實際為陽性的結果，被正確檢測到的概率，其公式為：靈敏度=TP/(TP+FN)×100%。TP指與標準變異數(shù)據(jù)集基因變異位點一致的檢測基因變異位點個數(shù)。FN指標準變異數(shù)據(jù)集中包含、但未被檢出的基因變異位點個數(shù)，即漏檢的個數(shù)。3.19精確率precision精確率，又稱查準率，它是針對檢出結果而言的，是在所有檢出為陽性的結果中，實際為陽性的比例，其公式為：精確率=TP/(TP+FP)×100%。TP指與標準變異數(shù)據(jù)集基因變異位點一致的檢測基因變異位點個數(shù)。FP指與標準變異數(shù)據(jù)集基因變異位點不一致的檢測基因變異位點個數(shù)，即誤報的結果。3.20參考品referencematerial;RM在一項或多項特性上具有足夠的均勻性和穩(wěn)定性，用于校準、給其他物質賦值或提供質量保證的物質。[來源：GB/T19703—2020/ISO15194:2009，3.4，有修改]3.21測序片段reads高通量平臺產(chǎn)生的含有堿基序列和質量值的序列片段。[來源：GB/T35890—2018，3.1]3.22基因型質量值genotypequality;GQPhred格式的質量值，表示在該位點該基因型存在的可能性，該值越高，則Genotype結果正確的可能性越大。4檢測性能要求4.1樣本質量控制要求4.1.1各實驗室應綜合考慮檢測范圍及目的，確定應包含的樣本類型，如外周血、羊水、流產(chǎn)組織及基因組DNA等。4.1.2各樣本類型的運輸流程，應綜合考慮樣本采集器儲存條件及樣本本身的特性，且應包含采樣器無破裂、漏液等可能造成的交叉污染和樣本降解、樣本量不足等問題的質量要求，應包含受檢者簽署的知情同意書、樣本編碼及送檢信息清晰完整的要求，確保無混樣風險。4.1.3樣本質量控制要求應綜合考慮樣本特性，進行充分測試，評估各樣本類型的建議采樣量，以及各類型樣本在檢測流程中的結果準確性及穩(wěn)定性。建議采樣量應為文庫構建環(huán)節(jié)DNA投入量的3～4倍，各樣本類型的建議采樣量可參考附錄A。4.2DNA提取質量要求4T/SZASXXXX—XXXX4.2.1提取試劑的批號、名稱、外觀應符合說明書標示，有效期應在規(guī)定范圍內。4.2.2提取后的DNA質量要求如下：a)DNA總量應為文庫構建環(huán)節(jié)DNA投入量的2倍以上；b)電泳檢測DNA主帶明顯，無明顯降解；c)DNA吸光值A260/280比值為1.7～1.9。4.2.3大批量自動化提取時應包含污染質控，即空白對照提取濃度＜1ng/μL。4.3文庫構建及雜交捕獲質量要求4.3.1文庫構建及雜交捕獲試劑的批號、名稱、外觀應符合說明書標示，有效期應在規(guī)定范圍內。雜交后的文庫DNA總量應為測序上機環(huán)節(jié)投入量的2倍以上，文庫的片段大小、體積、濃度等均需要符合相應平臺的上機標準。其中，MGI測序平臺建議文庫總量≥600ng；Illumina測序平臺建議文庫濃度≥1nM且文庫體積≥20μL。文庫片段大小建議在200bp～500bp。4.3.2室內質控參考品應在建庫環(huán)節(jié)加入，與臨床樣本一同參與建庫及后續(xù)的全部實驗流程。大批量自動化提取時應包含污染質控（即空白對照每板或每批次實驗需包含空白對照、陽性質控品及陰性質控品各一個，空白對照提取濃度應＜1ng/μL，陰陽性質控品質量要求同4.3.1。4.4測序質量要求不同的測序平臺有不同的合格閾值，不同平臺可參考測序試劑盒或測序平臺說明書，制定能保證分析成功率的測序數(shù)據(jù)合格指標，以保證測序質量和靶區(qū)覆蓋深度。測序的Q30應不低于85%。4.5信息分析質量要求測序下機后的數(shù)據(jù)建議關注以下關鍵指標：平均測序深度、20×覆蓋度、Q30和污染比例，這些指標的實測值應不低于各平臺設置的最低要求且非胎兒樣本性別應與送檢信息一致。其中，目標區(qū)域的平均測序深度應根據(jù)檢測策略對基因變異判定所需的數(shù)據(jù)深度的需求而定。其余指標的建議合格標準為：測序下機原始數(shù)據(jù)經(jīng)過濾后，Q30應不低于85%，20×覆蓋度應不低于97.5%，生信環(huán)節(jié)提示無污染且非胎兒樣本性別與基本送檢信息一致。4.6遺傳解讀質量要求4.6.1變異注釋所選用的數(shù)據(jù)庫應至少包括人群頻率數(shù)據(jù)庫、疾病數(shù)據(jù)庫、表型數(shù)據(jù)庫，以及預測結果數(shù)據(jù)庫。所有數(shù)據(jù)庫均需要定期更新，公共數(shù)據(jù)庫應至少一年檢查一次更新。（建議選用的數(shù)據(jù)庫參見附錄A。）4.6.2變異注釋的信息需至少包括：變異基本信息（染色體坐標、合子狀態(tài)、基因名稱、轉錄本、HGVS命名等）、群體數(shù)據(jù)（該位點在正常人群和本地樣本中的頻率）、基因元件與功能影響、基因相關的疾病信息、疾病數(shù)據(jù)庫收錄情況、軟件計算與預測結果等。4.6.3位點篩選主要考慮三要素：所涉及疾病的相關特異性表型與臨床主訴吻合、符合疾病遺傳模式，以及致病性達到報告篩選標準，解讀參考信息參見附錄A。4.6.4針對不同的變異類型，各實驗室應在臨床大樣本量驗證數(shù)據(jù)的基礎上，對擬報告位點建立起低質量位點判斷閾值，以界定經(jīng)篩選后的擬報告變異位點，哪些應進行額外的金標準方法學驗證實驗補充（如Sanger、qPCR、MLPA等）。低質量位點閾值示例參見附錄A。5性能確認要求5.1性能確認時機5.1.1實驗室建立起cWES檢測程序后，檢測程序常規(guī)應用前應先進行性能確認。在此基礎上，正常收樣的檢測實驗室建議每年至少進行一次性能確認。5.1.2任何可能嚴重影響cWES檢測程序性能的情況發(fā)生前，如發(fā)生試劑升級、試劑替換、實驗流程變更、生信流程變更、解讀流程變更及重要技術操作人員變更等情況，以及在出現(xiàn)重大技術性差錯、重大不符合、客戶反復投訴等情況下，應在檢測程序重新啟用前進行性能確認。5.2性能確認樣本要求5T/SZASXXXX—XXXX5.2.1性能確認樣本來源應參照以下原則選擇用于臨床全外顯子組測序性能確認的樣本：a)性能確認樣本可使用過往臨床樣本或參考品。選擇的臨床樣本應有可信的參比方法提供的位點數(shù)據(jù)，即使用金標準方法（如：使用Sanger驗證SNV變異）、行業(yè)公認方法或經(jīng)確認性能符合要求滿足臨床預期用途的方法（如：通過ISO15189認可實驗室使用的相同檢測方法）檢測過；b)除了臨床樣本，性能確認還推薦使用位點準確可信的獨立第三方參考品，即由與檢測程序提供方或試劑盒制造商無關的第三方制造，獨立開發(fā)，不受儀器或試劑制造商的影響的第三方參考物質。參考品應足夠均勻和穩(wěn)定，能證明測量系統(tǒng)處于統(tǒng)計控制下時，能提供期望的可信結果。5.2.2性能確認樣本種類用于臨床全外顯子組測序性能確認的樣本應符合以下要求：a)性能確認樣本應包含參考序列參考品、特定位點陰性及陽性參考品或臨床明確診斷陽性樣本。參考序列參考品需使用有公開參考序列信息的通用參考品（如NA12878和炎黃一號），或經(jīng)多個二代測序平臺交叉驗證過，有可信外顯子組數(shù)據(jù)可供參考比對的參考品；b)陽性參考品或臨床明確診斷陽性樣本選取時，變異類型應覆蓋制造商說明書聲明的檢測范圍外顯子CNV、CNV及染色體非整倍體等。如為檢測范圍內未包含的變異類型，在選取陽性參考品時無需包含；c)特定位點陰性指挑選臨床已知致病或疑似致病位點至少100個，選取經(jīng)多個二代測序平臺交叉驗證或金標準方法驗證過，在挑選出的位點上無致病變異的參考品或臨床樣本。挑選的已知位點應盡可能覆蓋所有染色體，且應覆蓋涉及疾病的不同遺傳模式。注1：因cWES檢測范圍廣，陽性參考品或陽性臨床樣本，同樣可能檢出其他致病或疑似致病位點，因此性能確認時僅關注經(jīng)驗證過的準確可信的陽性變異位點，對于其他檢出位點，不予計注2：因cWES檢測范圍廣，表型正常人群同樣會攜帶多個致病或疑似致病的遺傳病變異位點，因此cWES檢測中并無性能確認時僅關注挑選出的位點，對于其他檢出的致病或疑似致病位點，不予計5.3性能確認評估要求5.3.1準確性評估選取參考序列參考品至少1種、特定位點陰性參考品或臨床樣本至少5種、陽性參考品或臨床樣本至少每種變異類型各1種，且陽性參考品或臨床樣本總數(shù)不少于10種（其余要求參見5.2）。性能確認樣本使用待確認的檢測程序進行檢測，準確性評估合格要求為：a)各實驗環(huán)節(jié)均需達到檢測程序的質控指標；b)參考序列參考品：SNV靈敏度≥98%，SNV精確率≥95%；InDel靈敏度≥84%，InDel精確率≥74%；c)陽性參考品的陽性變異全部檢出，陽性變異為制造商說明書聲明的檢測范圍內的變異類型，如SNV、InDel、線粒體變異、雜合性缺失（LOH）、短串聯(lián)重復序列（STR）、外顯子CNV、CNV及染色體非整倍體等；d)特定位點陰性參考品或臨床樣本，經(jīng)驗證過的位點上全部無陽性變異檢出。5.3.2重復性評估（批內穩(wěn)定性）選取參考序列參考品至少1種、陽性參考品或臨床樣本至少2種，批次內重復建庫三次，合格要求為：a)各實驗環(huán)節(jié)均應達到檢測程序的質控指標；b)將所有SNV及InDel檢出結果按圖1匯總，計算一致性比值作為重復性評價參數(shù)，該參數(shù)不得低于90%。5.3.3重現(xiàn)性評估（批間穩(wěn)定性）6T/SZASXXXX—XXXX選取參考序列參考品至少1種、陽性參考品或臨床樣本至少2種，分三個批次進行重復建庫，合格要求為：a)各實驗環(huán)節(jié)均應達到檢測程序的質控指標；b)將所有SNV及InDel檢出結果按圖1匯總，計算一致性比值作為重現(xiàn)性評價參數(shù)，該參數(shù)不得低于90%。圖1一致性比值驗證5.3.4結果判定準確性評估、重復性評估及重現(xiàn)性評估均合格，則該實驗室的cWES檢測流程及其程序可被認定為性能合格。5.3.5不合格措施如性能確認不合格，應排查實驗及分析流程，修正檢測程序后重新進行性能確認。6室內質控要求6.1室內質控時機正常開展臨床全外顯子組測序檢測的實驗室，實驗室應建立室內質控體系，實時監(jiān)控檢測程序的穩(wěn)定性，確保檢測流程穩(wěn)定、檢測結果真實可信。室內質控推薦使用第三方參考品，并應在每一批臨床樣本檢測中加入，應進行文庫構建環(huán)節(jié)的監(jiān)控，并且該室內質控品應與臨床樣本一同進行后續(xù)的全流程檢測實驗及分析。6.2室內質控品選擇室內質控品應至少包含一種參考序列參考品及一種陽性變異參考品。陽性變異參考品建議每半年至一年進行一次更換，盡量覆蓋不同的變異類型，其余要求同5.2.2性能確認樣本種類。6.3室內質控評估要求6.3.1結果判定室內質控參考品需與臨床樣本一并進行文庫構建及后續(xù)全部實驗流程。合格要求為：a)各實驗環(huán)節(jié)均應達到檢測程序的質控指標；b)參考序列參考品：SNV靈敏度≥98%，SNV精確率≥95%；InDel靈敏度≥84%，InDel精確率≥74%；c)陽性參考品的陽性位點全部檢出。6.3.2不合格措施如室內質控不合格，應排查實驗及分析流程，修正檢測程序后重新實驗，該批次臨床樣本結果以室內質控合格批次的重測結果為準。7T/SZASXXXX—XXXX臨床全外顯子組測序實驗相關建議A.1cWES建議采樣量以300ng的建庫投入量為例，建議采樣量要求如下：外周血≥2mL，如