單基因遺傳病臨床全外顯子組測序性能驗(yàn)證及室內(nèi)質(zhì)控規(guī)程

1T/SZASXXXX—XXXX單基因遺傳病臨床全外顯子組測序性能驗(yàn)證及室內(nèi)質(zhì)控規(guī)程本文件規(guī)范了臨床全外顯子組測序性能驗(yàn)證及室內(nèi)質(zhì)量控制（室內(nèi)質(zhì)控）的過程，涵蓋檢測性能和室內(nèi)質(zhì)控的要求、性能確認(rèn)的過程、方法和評估要求等。本文件旨在為檢測服務(wù)提供商及提供相關(guān)檢測的各類檢測機(jī)構(gòu)，在開展全外顯子組測序?qū)θ祟惢蚪M進(jìn)行單基因遺傳病變異檢測時的質(zhì)量控制程序提供規(guī)范性建議，包含但不局限于運(yùn)行前性能確認(rèn)及運(yùn)行中室內(nèi)質(zhì)控的流程及要求，覆蓋范圍包括但不限于實(shí)驗(yàn)操作、數(shù)據(jù)分析、結(jié)果判讀以及報告出具過程。適用于以大規(guī)模并行測序技術(shù)為技術(shù)路線的單基因遺傳性疾病全外顯子組測序，適用于該類型檢測服務(wù)提供商及提供相關(guān)檢測的各類檢測機(jī)構(gòu)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T19703—2020/ISO15194:2009體外診斷醫(yī)療器械生物源性樣品中量的測量有證參考物質(zhì)及支持文件內(nèi)容的要求GB/T35890—2018高通量測序數(shù)據(jù)序列格式規(guī)范GB/T42751—2023信息技術(shù)生物特征識別高通量測序基因分型系統(tǒng)規(guī)范GA/T1693—2020法庭科學(xué)DNA二代測序檢驗(yàn)規(guī)范T/CHIA21.2—2021組學(xué)樣本處理與數(shù)據(jù)分析標(biāo)準(zhǔn)第2部分：全外顯子組測序數(shù)據(jù)分析T/SZAS13—2019基因組學(xué)數(shù)據(jù)集3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1高通量測序high-throughputsequencing能夠一次并行對大量核酸分子進(jìn)行平行序列測定的技術(shù)，通常一次測序反應(yīng)能產(chǎn)生不低于100M堿基對的測序數(shù)據(jù)。[來源：GB/T42751—2023，3.1]3.2外顯子組exome個體基因組中能夠編碼產(chǎn)生蛋白質(zhì)氨基酸序列的DNA區(qū)域的總和，在人類基因組中往往呈不連續(xù)的片段分布，占整個人類基因組的1～2%。3.3全外顯子組測序wholeexomesequencing,WES利用探針雜交富集外顯子區(qū)域的DNA序列，然后通過高通量測序，主要識別和研究與疾病、種群進(jìn)化相關(guān)的編碼區(qū)及其調(diào)控區(qū)域相關(guān)遺傳突變的技術(shù)手段。[來源：T/CHIA21.2—2021，3.3，有修改]3.4臨床全外顯子組測序clinicalwholeexomesequencing;cWES2T/SZASXXXX—XXXX利用序列捕獲技術(shù)將外顯子區(qū)域捕獲并富集后進(jìn)行高通量基因測序，針對公共數(shù)據(jù)庫（如OMIM數(shù)據(jù)庫）中明確致病的基因，對獲得的全外顯子組數(shù)據(jù)進(jìn)行單基因遺傳病相關(guān)的變異校正及解讀信息注釋，從而獲得與受檢者相關(guān)的遺傳病變異信息的檢測方法。3.5性能確認(rèn)validation性能確認(rèn)是指對未經(jīng)確認(rèn)或自建的檢驗(yàn)程序，以及明顯修改過的檢驗(yàn)程序，通過提供客觀證據(jù)對特定的預(yù)期用途或應(yīng)用要求已得到滿足的認(rèn)定。臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)相應(yīng)臨床需要和目前技術(shù)水平制定檢驗(yàn)程序分析性能標(biāo)準(zhǔn)（可接受的性能指標(biāo)限值），作為確認(rèn)結(jié)果解釋的主要依據(jù)。3.6Barcode一段特征性的脫氧核苷酸段片段，在多樣本混合測序時，充當(dāng)識別特定樣本來源的唯一編號。[來源：GA/T1693—2020,3.10]3.7Q20測序數(shù)據(jù)中，堿基識別質(zhì)量值大于20的堿基占所有堿基的比例。注：堿基識別質(zhì)量值為20時，表示堿基的正確率為99%以上。Q20≥95%，[來源：T/SZAS13—2019,3.1.12，有修改]3.8Q30測序數(shù)據(jù)中，堿基識別質(zhì)量值大于30的堿基占所有堿基的比例。注：堿基識別質(zhì)量值為30時，表示堿基的正確率為99.9%以上。Q30≥85%[來源：T/SZAS13—2019,3.1.13，有修改]3.9平均測序深度averagesequencingdepth測序得到的落在目標(biāo)區(qū)域的堿基數(shù)與目標(biāo)區(qū)域長度的比值。3.10覆蓋度coverageratio捕獲芯片的覆蓋度指捕獲范圍占參考序列總區(qū)域的百分比。而外顯子組測序數(shù)據(jù)中的覆蓋度則是指將測序序列比對到參考序列上時，所有被比對到的區(qū)域占捕獲芯片范圍總區(qū)域的百分比。3.11單核苷酸變異singlenucleotidevariation;SNV在基因組水平，由單個核苷酸位點(diǎn)的變異（替代、插入或缺失）所引起的脫氧核糖核苷酸序列變異。[來源：T/SZAS13—2019,3.1.2，有修改]3.12插入缺失型變異insertionanddeletion;InDel在基因組的某個位置上所發(fā)生的小片段序列的插入或者缺失，插入或缺失片段的長度在50bp以下。[來源：T/SZAS13—2019,3.1.3]3.13拷貝數(shù)變異copynumbervariation;CNV大片段缺失和大片段重復(fù)又叫拷貝數(shù)變異，即連續(xù)較長的序列發(fā)生了缺失或者重復(fù)，與插入缺失型變異的區(qū)別在于變異的長度更長。3.14線粒體變異mitochondrialmutation線粒體DNA（mtDNA）發(fā)生的變異，這些變異可以導(dǎo)致線粒體功能障礙或疾病。3.15雜合性缺失lossofheterozygosity;LOH3T/SZASXXXX—XXXX包含拷貝數(shù)減少的雜合性缺失（copylosses-LOH,CL-LOH）和拷貝數(shù)中性雜合性缺失（copyneutral-LOH，CN-LOH）兩種情況。在一對同源染色體上，位于相同基因座的兩個等位基因中的一個發(fā)生缺失，導(dǎo)致的雜合狀態(tài)喪失，即CL-LOH；由同源重組等多種機(jī)制造成的，未發(fā)生拷貝數(shù)變化的等位基因失衡，則為CN-LOH。3.16短串聯(lián)重復(fù)序列shorttandemrepeats;STR短串聯(lián)重復(fù)序列是由2到6個核苷酸組成的序列，在基因組中串聯(lián)重復(fù)出現(xiàn)。3.17染色體非整倍體aneuploidy在正常的染色體組中，丟失或增加了一條或幾條完整的染色體，如單體（丟失單條染色體）和三體（額外增加一條染色體）。3.18靈敏度sensitivity靈敏度，又稱查全率或召回率，它是針對真實(shí)結(jié)果而言的，是指實(shí)際為陽性的結(jié)果，被正確檢測到的概率，其公式為：靈敏度=TP/(TP+FN)×100%。TP指與標(biāo)準(zhǔn)變異數(shù)據(jù)集基因變異位點(diǎn)一致的檢測基因變異位點(diǎn)個數(shù)。FN指標(biāo)準(zhǔn)變異數(shù)據(jù)集中包含、但未被檢出的基因變異位點(diǎn)個數(shù)，即漏檢的個數(shù)。3.19精確率precision精確率，又稱查準(zhǔn)率，它是針對檢出結(jié)果而言的，是在所有檢出為陽性的結(jié)果中，實(shí)際為陽性的比例，其公式為：精確率=TP/(TP+FP)×100%。TP指與標(biāo)準(zhǔn)變異數(shù)據(jù)集基因變異位點(diǎn)一致的檢測基因變異位點(diǎn)個數(shù)。FP指與標(biāo)準(zhǔn)變異數(shù)據(jù)集基因變異位點(diǎn)不一致的檢測基因變異位點(diǎn)個數(shù)，即誤報的結(jié)果。3.20參考品referencematerial;RM在一項(xiàng)或多項(xiàng)特性上具有足夠的均勻性和穩(wěn)定性，用于校準(zhǔn)、給其他物質(zhì)賦值或提供質(zhì)量保證的物質(zhì)。[來源：GB/T19703—2020/ISO15194:2009，3.4，有修改]3.21測序片段reads高通量平臺產(chǎn)生的含有堿基序列和質(zhì)量值的序列片段。[來源：GB/T35890—2018，3.1]3.22基因型質(zhì)量值genotypequality;GQPhred格式的質(zhì)量值，表示在該位點(diǎn)該基因型存在的可能性，該值越高，則Genotype結(jié)果正確的可能性越大。4檢測性能要求4.1樣本質(zhì)量控制要求4.1.1各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)綜合考慮檢測范圍及目的，確定應(yīng)包含的樣本類型，如外周血、羊水、流產(chǎn)組織及基因組DNA等。4.1.2各樣本類型的運(yùn)輸流程，應(yīng)綜合考慮樣本采集器儲存條件及樣本本身的特性，且應(yīng)包含采樣器無破裂、漏液等可能造成的交叉污染和樣本降解、樣本量不足等問題的質(zhì)量要求，應(yīng)包含受檢者簽署的知情同意書、樣本編碼及送檢信息清晰完整的要求，確保無混樣風(fēng)險。4.1.3樣本質(zhì)量控制要求應(yīng)綜合考慮樣本特性，進(jìn)行充分測試，評估各樣本類型的建議采樣量，以及各類型樣本在檢測流程中的結(jié)果準(zhǔn)確性及穩(wěn)定性。建議采樣量應(yīng)為文庫構(gòu)建環(huán)節(jié)DNA投入量的3～4倍，各樣本類型的建議采樣量可參考附錄A。4.2DNA提取質(zhì)量要求4T/SZASXXXX—XXXX4.2.1提取試劑的批號、名稱、外觀應(yīng)符合說明書標(biāo)示，有效期應(yīng)在規(guī)定范圍內(nèi)。4.2.2提取后的DNA質(zhì)量要求如下：a)DNA總量應(yīng)為文庫構(gòu)建環(huán)節(jié)DNA投入量的2倍以上；b)電泳檢測DNA主帶明顯，無明顯降解；c)DNA吸光值A(chǔ)260/280比值為1.7～1.9。4.2.3大批量自動化提取時應(yīng)包含污染質(zhì)控，即空白對照提取濃度＜1ng/μL。4.3文庫構(gòu)建及雜交捕獲質(zhì)量要求4.3.1文庫構(gòu)建及雜交捕獲試劑的批號、名稱、外觀應(yīng)符合說明書標(biāo)示，有效期應(yīng)在規(guī)定范圍內(nèi)。雜交后的文庫DNA總量應(yīng)為測序上機(jī)環(huán)節(jié)投入量的2倍以上，文庫的片段大小、體積、濃度等均需要符合相應(yīng)平臺的上機(jī)標(biāo)準(zhǔn)。其中，MGI測序平臺建議文庫總量≥600ng；Illumina測序平臺建議文庫濃度≥1nM且文庫體積≥20μL。文庫片段大小建議在200bp～500bp。4.3.2室內(nèi)質(zhì)控參考品應(yīng)在建庫環(huán)節(jié)加入，與臨床樣本一同參與建庫及后續(xù)的全部實(shí)驗(yàn)流程。大批量自動化提取時應(yīng)包含污染質(zhì)控（即空白對照每板或每批次實(shí)驗(yàn)需包含空白對照、陽性質(zhì)控品及陰性質(zhì)控品各一個，空白對照提取濃度應(yīng)＜1ng/μL，陰陽性質(zhì)控品質(zhì)量要求同4.3.1。4.4測序質(zhì)量要求不同的測序平臺有不同的合格閾值，不同平臺可參考測序試劑盒或測序平臺說明書，制定能保證分析成功率的測序數(shù)據(jù)合格指標(biāo)，以保證測序質(zhì)量和靶區(qū)覆蓋深度。測序的Q30應(yīng)不低于85%。4.5信息分析質(zhì)量要求測序下機(jī)后的數(shù)據(jù)建議關(guān)注以下關(guān)鍵指標(biāo)：平均測序深度、20×覆蓋度、Q30和污染比例，這些指標(biāo)的實(shí)測值應(yīng)不低于各平臺設(shè)置的最低要求且非胎兒樣本性別應(yīng)與送檢信息一致。其中，目標(biāo)區(qū)域的平均測序深度應(yīng)根據(jù)檢測策略對基因變異判定所需的數(shù)據(jù)深度的需求而定。其余指標(biāo)的建議合格標(biāo)準(zhǔn)為：測序下機(jī)原始數(shù)據(jù)經(jīng)過濾后，Q30應(yīng)不低于85%，20×覆蓋度應(yīng)不低于97.5%，生信環(huán)節(jié)提示無污染且非胎兒樣本性別與基本送檢信息一致。4.6遺傳解讀質(zhì)量要求4.6.1變異注釋所選用的數(shù)據(jù)庫應(yīng)至少包括人群頻率數(shù)據(jù)庫、疾病數(shù)據(jù)庫、表型數(shù)據(jù)庫，以及預(yù)測結(jié)果數(shù)據(jù)庫。所有數(shù)據(jù)庫均需要定期更新，公共數(shù)據(jù)庫應(yīng)至少一年檢查一次更新。（建議選用的數(shù)據(jù)庫參見附錄A。）4.6.2變異注釋的信息需至少包括：變異基本信息（染色體坐標(biāo)、合子狀態(tài)、基因名稱、轉(zhuǎn)錄本、HGVS命名等）、群體數(shù)據(jù)（該位點(diǎn)在正常人群和本地樣本中的頻率）、基因元件與功能影響、基因相關(guān)的疾病信息、疾病數(shù)據(jù)庫收錄情況、軟件計算與預(yù)測結(jié)果等。4.6.3位點(diǎn)篩選主要考慮三要素：所涉及疾病的相關(guān)特異性表型與臨床主訴吻合、符合疾病遺傳模式，以及致病性達(dá)到報告篩選標(biāo)準(zhǔn)，解讀參考信息參見附錄A。4.6.4針對不同的變異類型，各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)在臨床大樣本量驗(yàn)證數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，對擬報告位點(diǎn)建立起低質(zhì)量位點(diǎn)判斷閾值，以界定經(jīng)篩選后的擬報告變異位點(diǎn)，哪些應(yīng)進(jìn)行額外的金標(biāo)準(zhǔn)方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)補(bǔ)充（如Sanger、qPCR、MLPA等）。低質(zhì)量位點(diǎn)閾值示例參見附錄A。5性能確認(rèn)要求5.1性能確認(rèn)時機(jī)5.1.1實(shí)驗(yàn)室建立起cWES檢測程序后，檢測程序常規(guī)應(yīng)用前應(yīng)先進(jìn)行性能確認(rèn)。在此基礎(chǔ)上，正常收樣的檢測實(shí)驗(yàn)室建議每年至少進(jìn)行一次性能確認(rèn)。5.1.2任何可能嚴(yán)重影響cWES檢測程序性能的情況發(fā)生前，如發(fā)生試劑升級、試劑替換、實(shí)驗(yàn)流程變更、生信流程變更、解讀流程變更及重要技術(shù)操作人員變更等情況，以及在出現(xiàn)重大技術(shù)性差錯、重大不符合、客戶反復(fù)投訴等情況下，應(yīng)在檢測程序重新啟用前進(jìn)行性能確認(rèn)。5.2性能確認(rèn)樣本要求5T/SZASXXXX—XXXX5.2.1性能確認(rèn)樣本來源應(yīng)參照以下原則選擇用于臨床全外顯子組測序性能確認(rèn)的樣本：a)性能確認(rèn)樣本可使用過往臨床樣本或參考品。選擇的臨床樣本應(yīng)有可信的參比方法提供的位點(diǎn)數(shù)據(jù)，即使用金標(biāo)準(zhǔn)方法（如：使用Sanger驗(yàn)證SNV變異）、行業(yè)公認(rèn)方法或經(jīng)確認(rèn)性能符合要求滿足臨床預(yù)期用途的方法（如：通過ISO15189認(rèn)可實(shí)驗(yàn)室使用的相同檢測方法）檢測過；b)除了臨床樣本，性能確認(rèn)還推薦使用位點(diǎn)準(zhǔn)確可信的獨(dú)立第三方參考品，即由與檢測程序提供方或試劑盒制造商無關(guān)的第三方制造，獨(dú)立開發(fā)，不受儀器或試劑制造商的影響的第三方參考物質(zhì)。參考品應(yīng)足夠均勻和穩(wěn)定，能證明測量系統(tǒng)處于統(tǒng)計控制下時，能提供期望的可信結(jié)果。5.2.2性能確認(rèn)樣本種類用于臨床全外顯子組測序性能確認(rèn)的樣本應(yīng)符合以下要求：a)性能確認(rèn)樣本應(yīng)包含參考序列參考品、特定位點(diǎn)陰性及陽性參考品或臨床明確診斷陽性樣本。參考序列參考品需使用有公開參考序列信息的通用參考品（如NA12878和炎黃一號），或經(jīng)多個二代測序平臺交叉驗(yàn)證過，有可信外顯子組數(shù)據(jù)可供參考比對的參考品；b)陽性參考品或臨床明確診斷陽性樣本選取時，變異類型應(yīng)覆蓋制造商說明書聲明的檢測范圍外顯子CNV、CNV及染色體非整倍體等。如為檢測范圍內(nèi)未包含的變異類型，在選取陽性參考品時無需包含；c)特定位點(diǎn)陰性指挑選臨床已知致病或疑似致病位點(diǎn)至少100個，選取經(jīng)多個二代測序平臺交叉驗(yàn)證或金標(biāo)準(zhǔn)方法驗(yàn)證過，在挑選出的位點(diǎn)上無致病變異的參考品或臨床樣本。挑選的已知位點(diǎn)應(yīng)盡可能覆蓋所有染色體，且應(yīng)覆蓋涉及疾病的不同遺傳模式。注1：因cWES檢測范圍廣，陽性參考品或陽性臨床樣本，同樣可能檢出其他致病或疑似致病位點(diǎn)，因此性能確認(rèn)時僅關(guān)注經(jīng)驗(yàn)證過的準(zhǔn)確可信的陽性變異位點(diǎn)，對于其他檢出位點(diǎn)，不予計注2：因cWES檢測范圍廣，表型正常人群同樣會攜帶多個致病或疑似致病的遺傳病變異位點(diǎn)，因此cWES檢測中并無性能確認(rèn)時僅關(guān)注挑選出的位點(diǎn)，對于其他檢出的致病或疑似致病位點(diǎn)，不予計5.3性能確認(rèn)評估要求5.3.1準(zhǔn)確性評估選取參考序列參考品至少1種、特定位點(diǎn)陰性參考品或臨床樣本至少5種、陽性參考品或臨床樣本至少每種變異類型各1種，且陽性參考品或臨床樣本總數(shù)不少于10種（其余要求參見5.2）。性能確認(rèn)樣本使用待確認(rèn)的檢測程序進(jìn)行檢測，準(zhǔn)確性評估合格要求為：a)各實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)均需達(dá)到檢測程序的質(zhì)控指標(biāo)；b)參考序列參考品：SNV靈敏度≥98%，SNV精確率≥95%；InDel靈敏度≥84%，InDel精確率≥74%；c)陽性參考品的陽性變異全部檢出，陽性變異為制造商說明書聲明的檢測范圍內(nèi)的變異類型，如SNV、InDel、線粒體變異、雜合性缺失（LOH）、短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）、外顯子CNV、CNV及染色體非整倍體等；d)特定位點(diǎn)陰性參考品或臨床樣本，經(jīng)驗(yàn)證過的位點(diǎn)上全部無陽性變異檢出。5.3.2重復(fù)性評估（批內(nèi)穩(wěn)定性）選取參考序列參考品至少1種、陽性參考品或臨床樣本至少2種，批次內(nèi)重復(fù)建庫三次，合格要求為：a)各實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)均應(yīng)達(dá)到檢測程序的質(zhì)控指標(biāo)；b)將所有SNV及InDel檢出結(jié)果按圖1匯總，計算一致性比值作為重復(fù)性評價參數(shù)，該參數(shù)不得低于90%。5.3.3重現(xiàn)性評估（批間穩(wěn)定性）6T/SZASXXXX—XXXX選取參考序列參考品至少1種、陽性參考品或臨床樣本至少2種，分三個批次進(jìn)行重復(fù)建庫，合格要求為：a)各實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)均應(yīng)達(dá)到檢測程序的質(zhì)控指標(biāo)；b)將所有SNV及InDel檢出結(jié)果按圖1匯總，計算一致性比值作為重現(xiàn)性評價參數(shù)，該參數(shù)不得低于90%。圖1一致性比值驗(yàn)證5.3.4結(jié)果判定準(zhǔn)確性評估、重復(fù)性評估及重現(xiàn)性評估均合格，則該實(shí)驗(yàn)室的cWES檢測流程及其程序可被認(rèn)定為性能合格。5.3.5不合格措施如性能確認(rèn)不合格，應(yīng)排查實(shí)驗(yàn)及分析流程，修正檢測程序后重新進(jìn)行性能確認(rèn)。6室內(nèi)質(zhì)控要求6.1室內(nèi)質(zhì)控時機(jī)正常開展臨床全外顯子組測序檢測的實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立室內(nèi)質(zhì)控體系，實(shí)時監(jiān)控檢測程序的穩(wěn)定性，確保檢測流程穩(wěn)定、檢測結(jié)果真實(shí)可信。室內(nèi)質(zhì)控推薦使用第三方參考品，并應(yīng)在每一批臨床樣本檢測中加入，應(yīng)進(jìn)行文庫構(gòu)建環(huán)節(jié)的監(jiān)控，并且該室內(nèi)質(zhì)控品應(yīng)與臨床樣本一同進(jìn)行后續(xù)的全流程檢測實(shí)驗(yàn)及分析。6.2室內(nèi)質(zhì)控品選擇室內(nèi)質(zhì)控品應(yīng)至少包含一種參考序列參考品及一種陽性變異參考品。陽性變異參考品建議每半年至一年進(jìn)行一次更換，盡量覆蓋不同的變異類型，其余要求同5.2.2性能確認(rèn)樣本種類。6.3室內(nèi)質(zhì)控評估要求6.3.1結(jié)果判定室內(nèi)質(zhì)控參考品需與臨床樣本一并進(jìn)行文庫構(gòu)建及后續(xù)全部實(shí)驗(yàn)流程。合格要求為：a)各實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)均應(yīng)達(dá)到檢測程序的質(zhì)控指標(biāo)；b)參考序列參考品：SNV靈敏度≥98%，SNV精確率≥95%；InDel靈敏度≥84%，InDel精確率≥74%；c)陽性參考品的陽性位點(diǎn)全部檢出。6.3.2不合格措施如室內(nèi)質(zhì)控不合格，應(yīng)排查實(shí)驗(yàn)及分析流程，修正檢測程序后重新實(shí)驗(yàn)，該批次臨床樣本結(jié)果以室內(nèi)質(zhì)控合格批次的重測結(jié)果為準(zhǔn)。7T/SZASXXXX—XXXX臨床全外顯子組測序?qū)嶒?yàn)相關(guān)建議A.1cWES建議采樣量以300ng的建庫投入量為例，建議采樣量要求如下：外周血≥2mL，如