2024殺鮭氣單胞菌病診斷方法

殺鮭氣單胞菌病診斷方法殺鮭氣單胞菌病診斷方法范圍（AeromonasPCRPCR本文件適用于殺鮭氣單胞菌病的普查和診斷，以及感染殺鮭氣單胞菌病的流行病學(xué)調(diào)查、診斷和出入境魚(yú)類(lèi)檢疫。（GB/T6682 GB/T18088 本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義?？s略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。BHQ1：黑洞淬滅劑1（Blackholequencher1）bp：堿基對(duì)（Basepair）CATB：十六烷基三甲基溴化銨（Cetyltrimethylammoniumbromide）Ct：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（Cyclethreshold）DNA：脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）dNTPs：脫氧核糖核苷三磷酸混合物（Deoxy-ribonucleosidetriphosphatemixture）EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraaceticacid）FAM：6-羧基熒光素（6-carboxy-fluorescein）PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerasechainreaction）qPCR：實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Quantitativerealtimepolymerasechainreaction）TAE：TAE電泳緩沖液（tirs-acetate-ethylenediaminetetraaceticacidbuffer）TSA：胰蛋白胨大豆胨瓊脂TSB：胰蛋白胨大豆肉湯Tris：三羥甲基氨基甲烷（Trishydroxymethylaminomethane）Taq：水生棲熱菌（Thermusaquaticus）vapA：毒力陣列蛋白A（VirulencearrayproteinA）本文件中所有化學(xué)試劑，除非另有規(guī)定，僅使用分析純?cè)噭?。水：符合GB/T6682（TSA）培養(yǎng)基：按A.1血瓊脂培養(yǎng)基：按A.2（TSB）培養(yǎng)基：按A.3電泳緩沖液：按A.41.5%瓊脂糖凝膠：按A.5配制。dNTPs（10mM）：-20保存。Taq（5U/）：-20保存。DNAMarkerDL2000：-20℃4(2%)。氯仿。（5M）。PCR（10μM）：5’-CATGCTGCCAATGGTCGTGG-3’，-20PCR（10μM）：5’-CGCCTTCAGCATTGGATTTC-3’，-20PCR（10μM）：5’-TAAAGCACTGTCTGTTACC-3’，-20PCR（10μM）：5’-GCTACTTCACCCTGATTGG-3’，-20PCR（10μM）：5’-FAM-ACATCAGCAGGCTTCAGAGTCACTG-BHQ1-3’，-20℃保存。PCRPCRPCRB.4。樣品采樣按GB/T18088規(guī)定執(zhí)行。無(wú)菌采集脾臟、肝臟、腎臟樣本。消毒病灶表面，無(wú)菌采集病灶深處的組織，同時(shí)采集腎臟、脾臟、肝臟。8.2分離培養(yǎng)用接種環(huán)（無(wú)菌）蘸取無(wú)菌采集的病料，劃線接種于胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）培養(yǎng)基（或血瓊脂培養(yǎng)基）上，25℃±3℃培養(yǎng)24h~72h。挑取光滑、圓整、凸起、半透明的單個(gè)菌落。有菌落會(huì)出現(xiàn)β-溶血或色素沉著。11min～2min1min～3min95%0.5min～1min10s～30s取干凈的載玻片，滴1滴～2滴生理鹽水。用接種環(huán)挑取9.1中培養(yǎng)好的單菌落涂抹在水滴中，蓋上蓋玻片。400倍～600倍顯微鏡檢。殺鮭氣單胞菌菌體在原位顫動(dòng)，沒(méi)有運(yùn)動(dòng)性。5sCPCRDNADNA100~300mg8.1.24℃10.2.1.12ml700μL2%65℃700μL氯仿000r/min101.5ml212000r/min5minDNA500μL70%10.2.1.2DNA12000r/min5min25min100μLDNA-20℃DNA分別挑取TSA5mLTSB253200rpm16h～241mL1.5mL000rpm/min5min100100℃10min～133minDNA-20℃注：DNA提取也可采用等效的商品化DNA提取試劑盒。2510×PCR2.5μL（101μLμL、DNA（5）0.5、MgCL2（25mmol/L）2.5、DNA225。PCR混液。94℃3min；94℃變性30s，61℃退火30s，72℃延伸20s，35個(gè)循環(huán)。72℃延伸10min。8μLPCR（）2μL1.5%DNAMarkerDL2000V/cm3/4264bpPCR264bpPCRPCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列與NCBI99%264bpPCR按照10.1規(guī)定執(zhí)行。DNA按照10.2規(guī)定執(zhí)行。2510×PCR2.5μL（100.5μL（10）1μLμLDNA（5μLmmol/DNA225μL。注：反應(yīng)體系中各試劑的量可根據(jù)具體情況或不同反應(yīng)總體積進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。亦可使用經(jīng)驗(yàn)證的商品化TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增預(yù)混液。95℃預(yù)變性2min；95℃變性15s，56℃退火30s，72℃延伸20s，40個(gè)循環(huán)；在56℃階段設(shè)置采集熒光。注：PCR反應(yīng)參數(shù)可根據(jù)反應(yīng)體系和不同品牌PCR儀做適當(dāng)調(diào)整。陽(yáng)性對(duì)照Ct值≤35，有典型的擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照和空白對(duì)照無(wú)典型擴(kuò)增曲線或Ct值≥40，試驗(yàn)結(jié)果成立；否則，試驗(yàn)不成立。被檢樣品Ct值≤35，且有典型擴(kuò)增曲線，判定被檢樣品殺鮭氣單胞菌檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；Ct值或Ct值≥4035<Ct40Ct值≥40檢測(cè)結(jié)果符合以下任何一項(xiàng)，判定為疑似感染：——出現(xiàn)典型臨床癥狀；——組織中檢測(cè)到殺鮭氣單胞菌核酸。對(duì)疑似感染殺鮭氣單胞菌病的樣本進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，符合以下任何一項(xiàng)，判定為確診感染：——所分離細(xì)菌，理化鑒定為殺鮭氣單胞菌檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性；——所分離細(xì)菌，普通PCR檢測(cè)為殺鮭氣單胞菌檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性；——所分離細(xì)菌，實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)為殺鮭氣單胞菌檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性。附錄A（）胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）培養(yǎng)基胰酪白15.0大豆白5.0氯化5.0瓊脂15.0將A.1.11000pH7.3±0.2，121℃高壓滅菌15min45℃～50成分胰酪白10.0大豆白5.0氯化3.0瓊15.0滅菌纖羊或50mL～100mL制法將A.2.11000pH7.3±0.2，121℃高壓滅菌15min45℃～501000mL（TSB）成分胰蛋15.0大豆白5.0氯化3.0蒸餾1000制法將A.3.1中的各種成分混勻，完全溶解后，調(diào)節(jié)pH7.3±0.2，121℃高壓滅菌15min，冷卻后備用。成分三羥基基烷（Tris） 4.84乙二四酸鈉（EDTA-Na2） 0.744冰乙酸 1.142蒸餾1000制法將A.4.1中的各種成分混勻，完全溶解后，調(diào)節(jié)pH7.3±0.2，121℃高壓滅菌15min，冷卻后備用。1.5%成分泳沖液 100瓊脂1.5核酸料 0.5制法將A.5.1中的各種成分混勻，加熱完全溶解后，15℃~25℃冷卻至固體，現(xiàn)配現(xiàn)用。附錄B（資料性）疾病概述（theinfectionofAeromonassalmonicida）（Aeromonassalmonicida）γ-鮭氣單胞菌有多個(gè)亞種，包括殺鮭亞種（Aeromonassalmonicidasubsp.salmonicida）、無(wú)色亞種（Aeromonassalmonicidasubsp.achromogenes)、殺日本鮭亞種（Aeromonassalmonicidasubsp.aoucdemoasaoncdasubp.haAermoasaoncdasubp.pectinolytica)（Salmotrutta）（Salvelinusfontinalis）（Squaliuscephalus）（Leuciscusleuciscus）（Anguilla（Thymallus)（Coregonus（Polyodon（Esoxlucius）（Dicentrarchuslabrax）（Petromyzonmarinus）等。（amosaaavenusapnu（Oncorhynchus(Oncorhynchusmykiss)（Salvelinus（Salmo（Thymallus)（Gadus（Hippoglossushippoglossus）（Cyprinuscarpio）（Anguillaanguilla）（Sebastesschlegeli）（Esoxlucius）等。/或粘液從排氣口排出等癥狀。癤瘡?fù)ǔＴ诒巢恳惶?10402030404天至21天～3，60℃下分鐘可殺滅殺鮭氣單胞菌。在被有機(jī)物污染的水中，可以存活長(zhǎng)達(dá)23天。在死魚(yú)體內(nèi)，5℃的溫度下，沙門(mén)氏菌可在內(nèi)臟中存活長(zhǎng)達(dá)6天。附錄C（規(guī)范性）生化特性表C.1殺鮭氣單胞菌各亞種的生化特性表生化特性殺鮭氣單胞菌亞種殺鮭亞種無(wú)色亞種殺日本鮭亞種史氏亞種溶果膠亞種運(yùn)動(dòng)性-----β-溶血+-+--氧化酶+++++