巢式PCR的文檔資料

巢式PCR1.增效PCR（boosterPCR）當(dāng)擴(kuò)增少于1000拷貝的模板DNA時(shí)會(huì)遇到兩個(gè)問題：一是形成引物二聚體，一是非特異擴(kuò)增，消耗了引物和酶，而特異擴(kuò)增片段產(chǎn)量降低。對(duì)于這種情況，可設(shè)置二步PCR，先用較低濃度的引物進(jìn)行初級(jí)PCR，此時(shí)由于引物少，形成引物二聚體的可能減少，但它并不影響靶序列的擴(kuò)增，只是由于引物少產(chǎn)量不高。約經(jīng)15～20個(gè)循環(huán)后補(bǔ)充引物量，以初級(jí)PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行擴(kuò)增，靶序列的產(chǎn)量將相應(yīng)增加。2.巢式PCR此時(shí)也是進(jìn)行二步PCR，與上面不同的是，第二級(jí)PCR需另行設(shè)置反應(yīng)體系，并應(yīng)用另外的PCR引物，此時(shí)引物的位置位于初級(jí)PCR引物的內(nèi)側(cè)，用初級(jí)PCR產(chǎn)物做模板，進(jìn)行第二步PCR，這樣只有初級(jí)PCR中特異的擴(kuò)增片段才能被二級(jí)引物擴(kuò)增。除了達(dá)到增效PCR同樣的目的外，還提高了最終產(chǎn)物的特異性。巢式PCR：利用兩套PCR引物對(duì)進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)組成，在第一輪擴(kuò)增中，外引物用以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，此產(chǎn)物在在內(nèi)引物的存在下進(jìn)行第二輪擴(kuò)增巢式RT-PCR,這種方法的特點(diǎn)是需要設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，一對(duì)引物擴(kuò)增稍長片段，在這一擴(kuò)增范圍內(nèi)再設(shè)計(jì)一對(duì)引物，擴(kuò)增的產(chǎn)物是以第一對(duì)引物的產(chǎn)物為模版3.RT-PCRRT-PCR是以mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶作用合成cDNA。使微量的mRNA（pg水平）迅速擴(kuò)增（達(dá)ng～ug水平），大大提高mRNA的檢出靈敏度。應(yīng)用于基因表達(dá)與調(diào)控的研究。4.基因芯片（又稱DNA芯片，生物芯片，DNA探針微列陣），它集成了大量的密集排列的基因探針，通過與被檢測(cè)基因的堿基序列進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)，實(shí)雙鏈DNA合成后，利用核酸酶S1切去回折處單鏈DNA，但會(huì)使cDNA失去5‘端部分序列?，F(xiàn)在較少用RNaseH部分水解雜交鏈中的RNA鏈，但留下一些小片段RNA，作為合成cDNA第二鏈的引物。還需要加入DNA連接酶連接合成片段末端轉(zhuǎn)移酶在cDNA第一鏈3’端添加一種寡聚寡聚核苷酸尾巴，然后以配對(duì)的寡聚物作為引物合成第二鏈6.DNA測(cè)序： DNA的序列分析的兩種基本方法：化學(xué)法 Maxam-Gilbert酶法 Sanger，雙脫氧終止法 現(xiàn)在全自動(dòng)測(cè)序仍然沿用Sanger氏酶法，但是在標(biāo)記上作了改進(jìn)雙脫氧終止法： 雙脫氧核苷酸(ddNTP)的脫氧核糖的3‘位置的-OH缺失。 當(dāng)它與其他正常核苷酸混合在同一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)體系中時(shí)，在DNA多聚酶的作用下，雖然它也能夠象正常核苷酸一樣參與DNA合成，以其5'位置的磷酸基，與上位脫氧核苷酸的3'位置的-OH結(jié)合，但是，由于它自身3'位置-OH的缺失，至使下位核苷酸的5'磷酸基無法與之結(jié)合過程：設(shè)計(jì)4種反應(yīng)體系：都含有正常的4種dNTP（其中一種用同位素標(biāo)記）單鏈DNA模板（即待測(cè)DNA）引物和DNA聚合酶I每組分別各加入一種ddNTP如果是dNTP摻入其中，DNA互補(bǔ)鏈則將繼續(xù)延伸下去；如果是ddNTP摻入其中，DNA互補(bǔ)鏈的合成則到此終止。由于雙脫氧核苷酸的摻入是隨機(jī)的，故各個(gè)新生DNA片段的長度互不相同通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（能分辨出小至一個(gè)堿基長度差的DNA片段），將混合產(chǎn)物中不同長度DNA片段分離開，再通過放射自顯影，根據(jù)片段尾部的雙脫氧核苷酸讀出該DNA的堿基排列順序DNA自動(dòng)測(cè)序：基于Sanger雙脫氧鏈終止法的原理，只不過用四種不同的熒光染料分別標(biāo)記ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP。這四種熒光染料在激