泛腫瘤異質(zhì)性血管細(xì)胞整合及鑒定指南

GB/TXXXXX—XXXX泛腫瘤異質(zhì)性血管細(xì)胞整合及鑒定指南范圍本文件給出了基于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)整合與識(shí)別不同功能血管相關(guān)細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)處理方法，包括單細(xì)胞數(shù)據(jù)整合，污染因素去除，批次矯正以及細(xì)胞亞型鑒定方法等。本文件適用于腫瘤微環(huán)境、血管生成及內(nèi)皮細(xì)胞研究的科學(xué)家和研究人員使用。本文件適合各級(jí)醫(yī)院腫瘤科、病理科等相關(guān)科室臨床醫(yī)師以及從事臨床教學(xué)、科研等工作者使用。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。Tumorvasculatureatsingle-cellresolutionUnderstandingtumourendothelialcellheterogeneityandfunctionfromsingle-cellomics術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序single-cellRNAsequencing;scRNA-seq單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是一種測(cè)序技術(shù)，用于捕獲和定量分析單個(gè)細(xì)胞的mRNA分子。這種技術(shù)允許研究人員在單細(xì)胞水平上研究基因表達(dá)，從而提供了對(duì)細(xì)胞間異質(zhì)性、細(xì)胞發(fā)育軌跡和細(xì)胞間相互作用的深入理解。內(nèi)皮細(xì)胞endothelialcells；ECs內(nèi)皮細(xì)胞是覆蓋血管內(nèi)表面的一層扁平細(xì)胞，形成了血管壁的內(nèi)襯。這些細(xì)胞在動(dòng)脈、靜脈、毛細(xì)血管以及淋巴管中均有分布，構(gòu)成了血管內(nèi)皮??。血管內(nèi)皮細(xì)胞vascularendothelialcells；VECs血管內(nèi)皮細(xì)胞是位于血管內(nèi)壁的內(nèi)皮細(xì)胞，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)血管的通透性、血液流動(dòng)以及血管的收縮和擴(kuò)張。血管內(nèi)皮細(xì)胞在維持血管完整性和功能中起關(guān)鍵作用，參與血管生成、炎癥反應(yīng)和血管舒張等過程。動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞arterialendothelialcells；ArtECs動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞是指覆蓋在動(dòng)脈血管內(nèi)壁的單層扁平細(xì)胞，屬于內(nèi)皮細(xì)胞的一種。它們?cè)诰S持血管功能和結(jié)構(gòu)的完整性方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。靜脈內(nèi)皮細(xì)胞venousendothelialcells；VenECs靜脈內(nèi)皮細(xì)胞是覆蓋在靜脈血管內(nèi)壁的單層扁平細(xì)胞，屬于內(nèi)皮細(xì)胞的一種。它們?cè)谡{(diào)節(jié)血液回流、維持血管通透性和血管生物學(xué)功能方面起重要作用。毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞capillaryendothelialcells；CapECs毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞是指覆蓋在毛細(xì)血管內(nèi)壁的單層細(xì)胞。這些細(xì)胞在微循環(huán)系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)血液與組織之間的物質(zhì)交換。淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞lymphaticendothelialcells；LECs淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞是覆蓋在淋巴管內(nèi)壁的細(xì)胞，屬于內(nèi)皮細(xì)胞的一種。它們?cè)谡{(diào)節(jié)淋巴液流動(dòng)、免疫監(jiān)視和維持組織液平衡方面起重要作用。壁細(xì)胞muralcell；MCs壁細(xì)胞是一類存在于血管壁和微血管壁的支持細(xì)胞，包括平滑肌細(xì)胞和周細(xì)胞。它們?cè)诰S持血管的結(jié)構(gòu)完整性和功能穩(wěn)定性方面起著關(guān)鍵作用。周細(xì)胞pericytes；PCs周細(xì)胞是一種位于毛細(xì)血管和小靜脈周圍的間質(zhì)細(xì)胞，嵌入在內(nèi)皮細(xì)胞基底膜內(nèi)。它們的主要特征是具有突起狀結(jié)構(gòu)，可以延伸到血管壁上，與內(nèi)皮細(xì)胞形成物理和功能上的聯(lián)系。平滑肌細(xì)胞smoothmusclecells；SMCs平滑肌細(xì)胞是內(nèi)臟器官中的關(guān)鍵細(xì)胞，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)管腔和空腔器官的收縮和舒張。它們的結(jié)構(gòu)、功能和調(diào)節(jié)機(jī)制使其在維持內(nèi)臟器官的正常功能中扮演著重要角色。血管生成angiogenesis血管生成是指從現(xiàn)有血管中生成新血管的生物學(xué)過程。這個(gè)過程在許多生理和病理情況下都非常重要，包括胚胎發(fā)育、傷口愈合、月經(jīng)周期以及腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移等。泛腫瘤單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)收集與整理為了使本標(biāo)準(zhǔn)更加全面與適用，前期收集了涵蓋31種癌癥類型的scRNA-seq數(shù)據(jù)，包括372名患者和437個(gè)樣本。經(jīng)過數(shù)據(jù)處理和細(xì)胞注釋過程，本標(biāo)準(zhǔn)最終收錄了183,977個(gè)血管細(xì)胞（見表1）。這些scRNA-seq數(shù)據(jù)主要涉及7種技術(shù)平臺(tái)：10xGenomicsChromium、BDRhapsody、DropSeq、Microwell-seq、SeekOneDDChip、Seq-well和Singleron。對(duì)于可獲得原始scRNA-seq數(shù)據(jù)集，我們量化了基因表達(dá)計(jì)數(shù)矩陣；否則，我們下載了CPM/TPM矩陣并用于下游分析?？偣灿兴姆N技術(shù)生成的數(shù)據(jù)集需要從原始數(shù)據(jù)開始處理，包括10xGenomicsChromium、BDRhapsody、Singleron和SeekOneDDChip。原始數(shù)據(jù)處理10xGenomicsChromium平臺(tái)：FASTQ文件使用CellRangertoolkit（v.6.1.2）進(jìn)行比對(duì)和定量分析，初步過濾后的UMI矩陣由CellRanger流程生成，并用于下游分析。BDRhapsody平臺(tái)：FASTQ文件通過BDRhapsody?分析流程（BDBiosciences）進(jìn)行處理，并在CWL-runner中實(shí)現(xiàn)。唯一分子標(biāo)識(shí)符（UniqueMolecularIndentifier，UMI）計(jì)數(shù)使用BDBiosciences開發(fā)的遞歸替換誤差校正（recursivesubstitutionerrorcorrection，RSEC）算法進(jìn)行校正，以糾正測(cè)序和PCR錯(cuò)誤。條形碼寡核苷酸結(jié)合抗體（單細(xì)胞多重試劑盒；BDBiosciences）用于通過BDRhapsody分析流程推斷樣本來源。Singleron平臺(tái)：使用SCOPE-tools將FASTQ測(cè)序數(shù)據(jù)映射到人類基因組。首先，對(duì)讀段1進(jìn)行過濾并提取細(xì)胞條形碼和UMI，將其添加到讀段2的ID中。然后，利用cutadapt對(duì)讀段2進(jìn)行修剪。接著，使用STAR將修剪后的讀段2比對(duì)到參考基因組上。使用featureCounts將已比對(duì)的讀數(shù)定位到基因的基因組位置。最后，合并具有相同細(xì)胞條形碼、UMI和基因的讀數(shù)，得到每個(gè)細(xì)胞每個(gè)基因的UMI數(shù)量。SeekOneDDChip平臺(tái)：使用SeekOneTools（BeijingSeekGeneBioSciences）處理FASTQ原始數(shù)據(jù)，處理過程與CellRanger流程相似，最終輸出每個(gè)細(xì)胞在不同基因上的UMI值。注：所有讀段都比對(duì)到GRCh38版本的參考基因組中（ensembleversion99）。質(zhì)量控制與數(shù)據(jù)過濾首先，我們對(duì)每個(gè)單細(xì)胞數(shù)據(jù)集應(yīng)用Seurat管道ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA20，根據(jù)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的基因數(shù)目、UMI數(shù)目，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行過濾ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA20。然后，我們使用CellCycleScoring函數(shù)計(jì)算線粒體和核糖體UMI計(jì)數(shù)的百分比，以及S期和G2M期的評(píng)分。接著，我們過濾掉線粒體UMI計(jì)數(shù)超過30%的細(xì)胞，并使用Scrublet的默認(rèn)參數(shù)去除潛在的雙細(xì)胞ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA21。主要細(xì)胞亞群注釋與血管細(xì)胞提取使用“LogNormalize”方法對(duì)基因計(jì)數(shù)表達(dá)矩陣進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，比例因子為10,000，并通過FindVariableFeatures函數(shù)使用“vst”方法識(shí)別前2,000個(gè)高變異基因。隨后，使用SCTransform函數(shù)對(duì)高變異基因表達(dá)矩陣進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，應(yīng)用回歸方法去除線粒體和核糖體基因百分比、細(xì)胞周期和供體的影響。接著，使用RunPCA函數(shù)進(jìn)行主成分分析，然后用R包harmony中的RunHarmony函數(shù)對(duì)前30個(gè)主成分進(jìn)行技術(shù)和樣本效應(yīng)校正ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA22。通過FindNeighbors函數(shù)構(gòu)建SNN圖，并使用基于“harmonyreduction”的FindClusters函數(shù)中的“Louvain算法”對(duì)細(xì)胞進(jìn)行聚類。對(duì)于所有數(shù)據(jù)集，分辨率參數(shù)設(shè)置為2.0，以產(chǎn)生足夠細(xì)化的聚類ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA23。接下來，根據(jù)經(jīng)典標(biāo)記物的表達(dá)對(duì)血管細(xì)胞群進(jìn)行注釋，內(nèi)皮細(xì)胞（endothelialcells，ECs）使用PECAM1，壁細(xì)胞（muralcell，MCs，包括平滑肌細(xì)胞/周細(xì)胞）使用RGS5、PDGFRB、ACTA2和TAGLN。然后，我們使用FindAllMarkers函數(shù)識(shí)別每個(gè)血管群中的差異表達(dá)基因。發(fā)現(xiàn)某些群高表達(dá)編碼熱休克蛋白的基因，可能與先前描述的組織解離操作有關(guān)ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA23-25。我們統(tǒng)計(jì)了在解離相關(guān)群中復(fù)發(fā)率超過30%的標(biāo)記基因，將其定義為解離誘導(dǎo)基因，并進(jìn)一步使用AddModuleScore函數(shù)計(jì)算解離誘導(dǎo)基因評(píng)分。此外，識(shí)別出一些污染群，顯示出黑素細(xì)胞（PMEL、MLANA和TYRP1）、上皮細(xì)胞（EPCAM）、紅細(xì)胞（HBB、HBA1和HBA2）、髓系細(xì)胞（CD163、CD14和LYZ）、T/NK細(xì)胞（CD2、CD3D、PTPRC和KLRD1）以及B/漿細(xì)胞（CD79A和MS4A1）的特征。這些與解離相關(guān)和污染的群被排除在后續(xù)分析之外。表1.泛腫瘤單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)腫瘤類型縮寫測(cè)序技術(shù)患者數(shù)量樣本數(shù)量細(xì)胞數(shù)量AcralMelanomaAM10x5,BDRhapsody,Singleron193012,770BreastCancerBC10x,10x5,10x3,Singleron19193,851BasalCellCarcinomaBCC10x5,10x3,BDRhapsody,Singleron15219,363BladderCancerBLCASingleron999,688CholangiocarcinomaCHOL10x3684,077CutaneousNeurofibromacNF10x333,128ColorectalCancerCRC10x3,10x526322,668CutaneousSquamousCellCarcinomacSCC10x3,BDRhapsody,Singleron56840CervicalSquamousCellCarcinomaCSCSingleron232,782CutaneousTCellLymphomaCTCL10x5152831,283EndometrialCancerEC10x3552,543EpendymomaEPN10x322261EsophagealCarcinomaESCADropSeq525415,807GlioblastomaGBM10x,Microwell-seq,Singleron78972GastricCancerGC10x528286,213GastrointestinalStromalTumorGIST10x512185HepatocellularCarcinomaHCC10x315155,593HeadandNeckSquamousCellCarcinomaHNSCCBDRhapsody,Singleron,SeekOneDDChip16216,593MeningiomasMEN10x3374,482MelanomaMELBDRhapsody,Singleron9123,610NeuroendocrineTumorNET10x310127,255Non-smallCellLungCancerNSCLC10x3,BDRhapsody,Singleron17182,549OvarianCancerOC10x3,DropSeq31317,442OsteosarcomaOS10x314143,645PancreaticCancerPDACSingleron33245ProstateCancerPCaSeq-well15152,567PheochromocytomaPHEOSeekOneDDChip668,423PenileSquamousCellCarcinomaPSCCBDRhapsody,Singleron483,259RenalCellCarcinomaRCC10x3141420,419ThyroidCarcinomaTC10x,10x3,Microwell-seq14165,041UvealMelanomaUVM10x51168血管細(xì)胞整合與主要細(xì)胞群體鑒定細(xì)胞和基因篩選首先，整合由多個(gè)平臺(tái)生成的異質(zhì)性血管細(xì)胞。篩選過程中，去除了在少于100個(gè)細(xì)胞中表達(dá)的基因，以及表達(dá)少于200個(gè)基因或多于4000個(gè)基因的細(xì)胞?；虮磉_(dá)矩陣標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)整合后的基因表達(dá)矩陣進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，檢測(cè)出前2000個(gè)高變異基因。為減少線粒體基因和核糖體基因百分比、細(xì)胞周期、解離誘導(dǎo)基因特征、技術(shù)和供體的影響，使用ScaleData函數(shù)對(duì)高變異基因計(jì)數(shù)矩陣進(jìn)行Z-score標(biāo)準(zhǔn)化。批次效應(yīng)消除為消除批次效應(yīng)，利用R包simspec中的cluster_sim_spectrum函數(shù)計(jì)算聚類相似譜（ClusterSimilaritySpectrum，CSS）ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>He</Author><Year>2020</Year><RecNum>122</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">26</style></DisplayText><record><rec-number>122</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="5zsxdxaabp9ft7eerz5xed2l229xpwpxsef0"timestamp="1717824943">122</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>He,Z.</author><author>Brazovskaja,A.</author><author>Ebert,S.</author><author>Camp,J.G.</author><author>Treutlein,B.</author></authors></contributors><auth-address>DepartmentofBiosystemsScienceandEngineering,ETHZurich,Basel,Switzerland.zhisong.he@bsse.ethz.ch. MaxPlanckInstituteforEvolutionaryAnthropology,Leipzig,Germany. InstituteofMolecularandClinicalOphthalmology,Basel,Switzerland.grayson.camp@iob.ch. UniversityofBasel,Basel,Switzerland.grayson.camp@iob.ch. DepartmentofBiosystemsScienceandEngineering,ETHZurich,Basel,Switzerland.barbara.treutlein@bsse.ethz.ch. MaxPlanckInstituteforEvolutionaryAnthropology,Leipzig,Germany.barbara.treutlein@bsse.ethz.ch.</auth-address><titles><title>CSS:clustersimilarityspectrumintegrationofsingle-cellgenomicsdata</title><secondary-title>GenomeBiol</secondary-title></titles><periodical><full-title>GenomeBiol</full-title></periodical><pages>224</pages><volume>21</volume><number>1</number><edition>2020/09/02</edition><keywords><keyword>Genomics/*methods</keyword><keyword>Humans</keyword><keyword>*SequenceAnalysis,RNA</keyword><keyword>*Single-CellAnalysis</keyword><keyword>UnsupervisedMachineLearning</keyword></keywords><dates><year>2020</year><pub-dates><date>Sep1</date></pub-dates></dates><isbn>1474-760X(Electronic) 1474-7596(Print) 1474-7596(Linking)</isbn><accession-num>32867824</accession-num><urls><related-urls><url>/pubmed/32867824</url></related-urls></urls><custom2>PMC7460789</custom2><electronic-resource-num>10.1186/s13059-020-02147-4</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>26，并采用默認(rèn)參數(shù)。具體步驟如下：=1\*romani.將每個(gè)供體的細(xì)胞進(jìn)行分組，基于預(yù)先計(jì)算的前20個(gè)主成分應(yīng)用Louvain聚類，分辨率設(shè)置為0.6。=2\*romanii.計(jì)算每個(gè)供體中每個(gè)聚類的高變異基因平均表達(dá)量。=3\*romaniii.計(jì)算每個(gè)供體中細(xì)胞和聚類之間的Spearman相關(guān)系數(shù)。=4\*romaniv.對(duì)于每個(gè)細(xì)胞，將其與不同供體中不同聚類的相關(guān)性進(jìn)行Z-score轉(zhuǎn)換，這些相關(guān)性被連接起來，形成了最終的CSS維度ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA27,28。=5\*romanv.在CSS維度上執(zhí)行UMAP可視化。血管相關(guān)細(xì)胞的主要群落注釋根據(jù)經(jīng)典基因表達(dá)，ECs被注釋為淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞（lymphaticendothelialcells，LECs）和血管內(nèi)皮細(xì)胞（vascularendothelialcells，VECs），其中血管內(nèi)皮細(xì)胞包括動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（arterialendothelialcells，ArtECs）、靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（venousendothelialcells，VenECs）和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞（capillaryendothelialcells，CapECs）。此外，我們檢測(cè)到正在經(jīng)歷內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（endothelial-to-mesenchymaltransition，EndoMT）的VECs，這些細(xì)胞共表達(dá)內(nèi)皮和間充質(zhì)標(biāo)記物。此外，在相應(yīng)的癌旁組織中，還鑒定出兩種特定組織的內(nèi)皮細(xì)胞，包括腎小球細(xì)胞（renalglomerularcells，RGCs）和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（liversinusoidalECs，LSECs）（表2，圖1）。表2.血管相關(guān)細(xì)胞標(biāo)記基因細(xì)胞分類細(xì)胞亞分類標(biāo)記基因內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞（LECs）LYVE1,PROX1動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（ArtECs）SEMA3G靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（VenECs）ACKR1毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞（CapECs）RGCC壁細(xì)胞（MCs）周細(xì)胞（PCs）RGS5,PDGFRB平滑肌細(xì)胞（SMCs）ACTA2,TAGLN內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞（EndoMT）PDGFRB+EndoMT-IPECAM1，PDGFRBDCN+EndoMT-IIPECAM1，DCN組織特異性正常內(nèi)皮細(xì)胞腎小球細(xì)胞（RGCs）EMCN，SOST，PLAT肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（LSECs）CLEC4G，CLEC1B圖1.泛腫瘤血管相關(guān)單細(xì)胞圖譜。(a)血管相關(guān)細(xì)胞的UMAP降維可視化結(jié)果，不同細(xì)胞類型使用不同的顏色進(jìn)行了標(biāo)注。(b)熱圖展示了不同血管相關(guān)細(xì)胞的經(jīng)典基因表達(dá)水平。整合效果量化通過計(jì)算局部逆辛普森指數(shù)（LocalInverseSimpson’sIndex，LISI）來量化整合效果，使用R包LISI中的compute_lisi函數(shù)（/immunogenomics/LISI）。該指標(biāo)反映了細(xì)胞鄰域中數(shù)據(jù)集的有效數(shù)量。較高的LISI值表示鄰域中由更多的數(shù)據(jù)集提供，從而降低批次效應(yīng)。經(jīng)過不同的處理過程，可以觀察到LISI水平逐步提高，這表明數(shù)據(jù)整合效果良好（圖2）。圖2.血管細(xì)胞的數(shù)據(jù)整合。(a)UMAP圖展示了整合步驟后血管細(xì)胞的分布（從原始計(jì)數(shù)到Z-score標(biāo)準(zhǔn)化再到CSS）。經(jīng)過CSS處理后，不同平臺(tái)生成的細(xì)胞明顯聚類。(b)UMAP圖展示了各細(xì)胞類型的選定標(biāo)記基因表達(dá)。(c)箱線圖展示了每個(gè)整合步驟后的LISI值（n=116,958個(gè)細(xì)胞）。對(duì)于箱線圖，中心線表示中位數(shù)，箱體范圍表示上四分位數(shù)和下四分位數(shù)，須線延伸至1.5倍四分位距。血管細(xì)胞鑒定魯棒性分析在本研究中，我們對(duì)血管細(xì)胞鑒定和整合的魯棒性進(jìn)行了多方面的詳細(xì)分析。以下是主要分析點(diǎn)：數(shù)據(jù)整合方法選擇我們采用了CSS算法進(jìn)行數(shù)據(jù)整合，而非廣泛使用的Harmony方法。Harmony因可能導(dǎo)致過度矯正而著稱，從而可能掩蓋生物學(xué)上真實(shí)存在的差異。CSS通過不同樣本中細(xì)胞聚類的相似性來表征每個(gè)細(xì)胞，生成無(wú)監(jiān)督的無(wú)參考數(shù)據(jù)表示。批次矯正性能比較我們對(duì)CSS與BBKNN和Harmony等已知方法的批次矯正性能進(jìn)行了詳細(xì)比較（圖3a）。觀察到使用不同批次矯正方法后，內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EndoMT-ECs）細(xì)胞類型的分布明顯不同（圖3b）。在我們的研究中，EndoMT-ECs被注釋為兩種類型：PDGFRB+的EndoMT-I和DCN+的EndoMT-II（圖3c）。LISI分析通過計(jì)算局部LISI，進(jìn)一步量化了不同方法的單細(xì)胞整合效果（圖3d）。結(jié)果表明，CSS在整合單細(xì)胞數(shù)據(jù)時(shí)，相較于BBKNN和Harmony是一種相對(duì)溫和的方法，能夠更好地減少批次效應(yīng)而不過度矯正。血管細(xì)胞獨(dú)立聚類現(xiàn)象分析獨(dú)特屬性和內(nèi)皮細(xì)胞異質(zhì)性：除了ArtECs，VenECs，CapECs外，還有一些特定器官的EC群體，如維持肝星狀細(xì)胞在靜止?fàn)顟B(tài)的LSECs，從而抑制肝內(nèi)血管收縮和纖維化的發(fā)展ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA29；以及具有獨(dú)特窗孔特征的RGCs，能夠處理大量的過濾ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA30。因此，考慮到這些細(xì)胞的獨(dú)特屬性和內(nèi)皮細(xì)胞的異質(zhì)性，數(shù)據(jù)整合后獨(dú)立的LSECs和RGCs群體可以作為潛在批次效應(yīng)被校正的指示。數(shù)據(jù)來源和樣本組成分析：我們分析了LSECs和RGCs的數(shù)據(jù)來源、樣本組成和樣本類型（圖3d）。LSECs主要來源于多份樣本的相鄰非腫瘤組織，這些樣本來自兩個(gè)已發(fā)表的數(shù)據(jù)集：Lu等人的肝癌研究ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA31和Zhang等人的肝內(nèi)膽管癌研究ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA32。RGCs主要來自一個(gè)樣本的相鄰非腫瘤組織（GSM4735369，83%）。此外，GSM4735369僅貢獻(xiàn)了我們的圖譜中的RGCs（圖3f）。因此，我們可以認(rèn)為這是一個(gè)樣本特定的RGCs群體。獨(dú)立數(shù)據(jù)集驗(yàn)證：為了進(jìn)一步確認(rèn)這兩個(gè)細(xì)胞群體的身份，我們進(jìn)行了獨(dú)立的數(shù)據(jù)整合測(cè)試。我們使用了兩個(gè)單細(xì)胞數(shù)據(jù)集，每個(gè)數(shù)據(jù)集都有預(yù)定義的肝臟和腎臟組織的細(xì)胞類型。一個(gè)數(shù)據(jù)集用于LSECs（來自MacParland等人）ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA33，另一個(gè)用于RGCs（來自Zhang等人）ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA34。結(jié)果顯示，新加入的細(xì)胞能夠與我們的LSECs和RGCs聚合（圖3g）。此外，LSEC和RGC相關(guān)的細(xì)胞標(biāo)志物（RGC:EMCN、SOST和PLAT；LSEC:CLEC4G和CLEC1C）在我們的LSECs和RGCs中高度表達(dá)，進(jìn)一步支持了我們定義的細(xì)胞身份。綜上所述，通過采用CSS算法和多種分析方法，我們確保了血管細(xì)胞鑒定的魯棒性，減小了批次效應(yīng)的影響，同時(shí)保留了生物學(xué)上的重要差異，為泛腫瘤異質(zhì)性血管細(xì)胞的整合和研究提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。圖3.數(shù)據(jù)整合和批次效應(yīng)矯正分析。(a)不同方法的UMAP圖，展示了CSS、BBKNN和Harmony的整合效果。(b)不同批次矯正方法下的EndoMT-ECs分布比較。(c)PDGFRB+的EndoMT-I和DCN+的EndoMT-II的UMAP圖。(d)使用不同方法計(jì)算的LISI值比較。(e)LSECs和RGCs的數(shù)據(jù)來源、樣本組成和樣本類型分析。(f)GSM4735369在RGCs群體中的貢獻(xiàn)。(g)獨(dú)立數(shù)據(jù)集的整合驗(yàn)證，展示了LSECs和RGCs的融合情況。(h)LSECs和RGCs相關(guān)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)水平(RGCs:EMCN,SOST和PLAT;LSECs:CLEC4G和CLEC1C)。小結(jié)及展望在本指南中，我們?cè)敿?xì)闡述了基于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，整合和鑒定泛腫瘤異質(zhì)性血管細(xì)胞的方法和流程。通過對(duì)183,977個(gè)血管細(xì)胞的分析，我們成功識(shí)別并分類了多種內(nèi)皮細(xì)胞和壁細(xì)胞，揭示了腫瘤微環(huán)境中血管細(xì)胞的復(fù)雜性和多樣性。這些發(fā)現(xiàn)不僅有助于深入理解內(nèi)皮細(xì)胞在腫瘤進(jìn)展和抗血管生成療法中的關(guān)鍵角色，還為未來的抗血管生成治療提供了新的思路和潛在靶點(diǎn)。隨著單細(xì)胞技術(shù)和數(shù)據(jù)分析方法的不斷進(jìn)步，我們可以期待更高分辨率和更大規(guī)模的數(shù)據(jù)整合與分析，從而更全面地揭示血管細(xì)胞的異質(zhì)性和功能特性。此外，結(jié)合多組學(xué)數(shù)據(jù)和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，我們將能夠更加精準(zhǔn)地描繪血管細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的動(dòng)態(tài)變化和相互作用。這將進(jìn)一步推動(dòng)精準(zhǔn)醫(yī)療和個(gè)性化治療的發(fā)展，為臨床應(yīng)用提供更加堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。我們相信，這些研究成果將促進(jìn)抗血管生成療法的優(yōu)化和創(chuàng)新，提高其在不同腫瘤類型和患者中的療效，最終為癌癥治療帶來新的突破。參考文獻(xiàn)ADDINEN.REFLIST1 Zeng,Q.etal.Understandingtumourendothelialcellheterogeneityandfunctionfromsingle-cellomics.NatRevCancer23,544-564(2023)./10.1038/s41568-023-00591-52 Potente,M.,Gerhardt,H.&Carmeliet,P.Basicandtherapeuticaspectsofangiogenesis.Cell146,873-887(2011)./10.1016/j.cell.2011.08.0393 Eelen,G.,Treps,L.,Li,X.&Carmeliet,P.BasicandTherapeuticAspectsofAngiogenesisUpdated.CircRes127,310-329(2020)./10.1161/CIRCRESAHA.120.3168514 Pober,J.S.&Sessa,W.C.Evolvingfunctionsofendothelialcellsininflammation.NatRevImmunol7,803-815(2007)./10.1038/nri21715 Potente,M.&Makinen,T.Vascularheterogeneityandspecializationindevelopmentanddisease.NatRevMolCellBiol18,477-494(2017)./10.1038/nrm.2017.366 Bergers,G.&Song,S.Theroleofpericytesinblood-vesselformationandmaintenance.NeuroOncol7,452-464(2005)./10.1215/S11528517050002327 Bennett,M.R.,Sinha,S.&Owens,G.K.VascularSmoothMuscleCellsinAtherosclerosis.CircRes118,692-702(2016)./10.1161/CIRCRESAHA.115.3063618 Hanahan,D.HallmarksofCancer:NewDimensions.CancerDiscov12,31-46(2022)./10.1158/2159-8290.CD-21-10599 Jayson,G.C.,Kerbel,R.,Ellis,L.M.&Harris,A.L.Antiangiogenictherapyinoncology:currentstatusandfuturedirections.Lancet388,518-529(2016)./10.1016/S0140-6736(15)01088-010 Garcia,J.etal.Bevacizumab(Avastin(R))incancertreatment:Areviewof15yearsofclinicalexperienceandfutureoutlook.CancerTreatRev86,102017(2020)./10.1016/j.ctrv.2020.10201711 Yang,Y.etal.Anti-VEGF-andanti-VEGFreceptor-inducedvascularalterationinmousehealthytissues.ProcNatlAcadSciUSA110,12018-12023(2013)./10.1073/pnas.130133111012 Cao,Y.VEGF-targetedcancertherapeutics-paradoxicaleffectsinendocrineorgans.NatRevEndocrinol10,530-539(2014)./10.1038/nrendo.2014.11413 Goel,S.,Wong,A.H.&Jain,R.K.Vascularnormalizationasatherapeuticstrategyformalignantandnonmalignantdisease.ColdSpringHarbPerspectMed2,a006486(2012)./10.1101/cshperspect.a00648614 Cao,Y.Off-tumortarget--beneficialsiteforantiangiogeniccancertherapy?NatRevClinOncol7,604-608(2010)./10.1038/nrclinonc.2010.11815 Xue,Y.etal.Anti-VEGFagentsconfersurvivaladvantagestotumor-bearingmicebyimprovingcancer-associatedsystemicsyndrome.ProcNatlAcadSciUSA105,18513-18518(2008)./10.1073/pnas.080796710516 Augustin,H.G.&Koh,G.Y.Organotypicvasculature:Fromdescriptiveheterogeneitytofunctionalpathophysiology.Science357(2017)./10.1126/science.aal237917 Bergers,G.&Hanahan,D.Modesofresistancetoanti-angiogenictherapy.NatRevCancer8,592-603(2008)./10.1038/nrc244218 Jeong,H.W.etal.Single-celltranscriptomicsrevealsfunctionallyspecializedvascularendotheliuminbrain.Elife11(2022)./10.7554/eLife.5752019 Bondareva,O.etal.Single-cellprofilingofvascularendothelialcellsrevealsprogressiveorgan-specificvulnerabilitiesduringobesity.NatMetab4,1591-1610(2022)./10.1038/s42255-022-00674-x20 Hao,Y.etal.Integratedanalysisofmultimodalsingle-celldata.Cell184,3573-3587e3529(2021)./10.1016/j.cell.2021.04.04821 Wolock,S.L.,Lopez,R.&Klein,A.M.Scrublet:ComputationalIdentificationofCellDoubletsinSingle-CellTranscriptomicData.CellSyst8,281-291e289(2019)./10.1016/j.cels.2018.11.00522 Korsunsky,I.etal.Fast,sensitiveandaccurateintegrationofsingle-celldatawithHarmony.NatMethods16,1289-1296(2019)./10.1038/s41592-019-0619-023 Zheng,L.etal.Pan-cancersingle-celllandscapeoftumor-infiltratingTcells.Science374,abe6474(2021)./10.1126/science.abe647424 vandenBrink,S.C.etal.Single-cellsequencingrevealsdissociation-inducedgeneexpressionintissuesubpopulations.NatMethods14,935-936(2017)./10.1038/nmeth.443725 Xue,R.etal.Livertumourimmunemicroenvironmentsubty