番茄病毒鑒定技術規(guī)程

1番茄病毒鑒定技術規(guī)程本文件規(guī)定了番茄病毒鑒定中的術語與定義、檢測對象、抽樣、取樣部位、鑒定方法和判定規(guī)則等本文件適用于內蒙古侵染番茄的病毒種類的鑒定。2規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1番茄Solanumlycopersicum茄科茄屬一年生或多年生草本植物，原產于南美洲，如今在世界各地廣泛栽培。3.2逆轉錄-聚合酶鏈式反應Reversetranscription-polymerasechainreaction（RT-PCR）聚合酶鏈式反應Polymerasechainreaction（PCR）提取番茄樣品的總RNA（總DNA對于RNA病毒，以其中的mRNA為模板，利用逆轉錄酶反轉錄合成cDNA，再以cDNA為模板使用侵染番茄的病毒特異性引物進行聚合酶鏈式反應；對于DNA，以總DNA稀釋液（按濃度比例稀釋）為模板使用侵染番茄的病毒特異性引物進行聚合酶鏈式反應。4檢測對象主要鑒定病毒種類：1)苜?；ㄈ~病毒（Alfalfamosaicvirus，AMV）2)蠶豆萎蔫病毒2（Beanbroadwiltvirus2，BBWV2）3)辣椒脈斑駁病毒（Chilliveinalmottlevirus，ChiVMV）4)黃瓜花葉病毒（Cucumbermosaicvirus，CMV）5)鳳果花葉病毒（Pepinomosaicvirus，PepMV）6)車前草花葉病毒（Plantagoasiaticamosaicvirus，PlAMV）7)辣椒輕斑駁病毒（Peppermildmottlevirus，PMMoV）8)馬鈴薯S病毒（PotatoVirusS，PVS）9)馬鈴薯X病毒（PotatoVirusX，PVX）210)菠菜潛隱病毒（Spinachlatentvirus，SpLV）11)南方番茄病毒（Southerntomatovirus，STV）12)番茄不孕病毒（Tomatoaspermyvirus，TAV）13)番茄黑環(huán)病毒（Tomatoblackringvirus，TBRV）14)煙草蝕紋病毒（Tobaccoetchvirus，TEV）15)煙草輕型綠花葉病毒（Tobaccomildgreenmosaicvirus，TMGMV）16)煙草花葉病毒（Tobaccomosaicvirus，TMV）17)番茄褐色皺紋果病毒（Tomatobrownrugosefruitvirus，ToBRFV）18)番茄叢矮病毒（Tomatobushystuntvirus，ToBSV）19)番茄褪綠病毒（Tomatochlorosisvirus，ToCV）20)番茄斑駁花葉病毒（Tomatomottlemosaicvirus，ToMMV）21)番茄花葉病毒（Tomatomosaicvirus，ToMV）22)番茄斑萎病毒（Tomatospottedwiltvirus，TSWV）23)蕪菁黃化病毒（Turnipyellowsvirus，TuYV）24)煙草脈帶花葉病毒（Tobaccoveinbandingmosaicvirus，TVBMV）25)番茄環(huán)紋斑點病毒（Tomatozonatespotvirus，TZSV）26)番茄黃化曲葉病毒（Tomatoyellowleafcurlvirus，TYLCV）27)中國番木瓜曲葉病毒（PapayaleafcurlChinavirus，PaLCuCNV）確定依據：參考國內外番茄病毒研究相關論文確定。5抽樣采用5點取樣法隨機抽取。1000株以內抽檢10株(含1000株)；1000株～10000株(含10000株),10000株按上述方法抽樣，之后每增加1000株增檢20株，不足1000株按1000株計。6取樣部位疑似病毒病感染的番茄植株，癥狀如花葉、皺縮、畸形、黃化、壞死等。取番茄植株莖稈和葉柄放置于自封袋內，4℃保存不超過24h或液氮預冷后立即放置于-80℃長期保存?zhèn)溆?，其成熟果實保留種子備用。7鑒定方法7.1逆轉錄聚合酶鏈式反應法（RT-PCR法）、聚合酶鏈式反應法（PCR法）7.1.1試劑盒RNA提取試劑盒(DNA提取試劑盒)：選擇適合提取含有多糖多酚材料的RNA（DNA）試劑盒。反轉錄試劑盒：使用市售的商品反轉錄試劑盒，按照說明進行操作。PCR擴增試劑盒：使用市售的商品PCR擴增試劑盒，按照說明進行操作。7.1.2引物侵染番茄的病毒特異性檢測引物（如表1）。表1已報道的侵染番茄的病毒特異性檢測引物病毒引物名稱引物序列（5’→3’）目標片段（bp）VirusPrimernamePrimersequenceTargetfragmentAMVdFAMVAMVdRBBWV2dFBBWV2BBWV2dRChiVMVdFChiVMVChiVMVdRCMVPep3PepMVPep4PlAMV-cpupPLAMVPlAMV-cpdwPMMoVdFPMMoVPMMoVdRS3FPVSS4RPVXdFPVXPVXdRSpLVdFSpLVSpLVdRSTVdFSTVSTVdRTAVTBRV-FTBRVTBRV-RTEV-FTEVTEV-RTMGMVdFTMGMVTMGMVdRGTGCGTATAGATGCCGGTTC900GAGCGAATAGGACTTCATACCAGRTATATGCTTGGGCAAGCGCATG490CATGAACATTCCCCATCTCCACGTGGGAAARGCNCCNTAYAT790CGCGCTAATGACATATCGGTGTTTATTTACAAGAGCGTACGG632GGTTCGAARRWATAACCGGGATGAGGTTGTCTGGTGAA624AATTCCGTGCACAACTATCCGCGGCCGCCACACTACTC932GGCCCACCAGACTTTCACTCCTCTTCCGAGAGAATCTGAGAC703CGTGTTTCCAAACTTCAGCCAAGTTTGAGATAGGTAGGCCCTCGAGGGGTCATACTGAAAGTTGTAGTGCGCGAGGTTTACCAATC790GTGGTTTGCCGCGAACGATTCGCACTCTCCTCAGCCTTTG1077TCTGACGAGCATCATATAGTTTCCTGATGGAGGATATCTACTGTCATT582ACAAGATGTTTAAAGCCGTGTCCATGGCCCAAAACGGTACGG657TCACACCGGGAGCGTTGAAGCGCTAGAAGTGAGCCTATG730TCAGCTAGGAGTTTCGCAGTGATGGATGGTGAGGAG347GTGCCGTTCAGTGTCTTGAGGAAATTGAGGATAATGTAAGTG700ACGCCATACCACAGTATACAC4TMVToBRFVToBSVToCVToMMVToMVTSWVTuYVTVBMVTZSVTYLCVTYLCVPaLCuCNVTMVdFTMVdRToBRFV-FToBRFV-RToBSVFToBSVR1ToCVdFToCVdRToMMVdFToMMVdRToMVdFToMVdRTSWVdFTSWVdRTuYV-F2TuYV-R2PIPO-FPIPO-RTZSVdFTZSVdRTYLCV-1TYLCV-2TYLCV-FTYLCV-RSC249FGATTCGTTTTAAATATGTCTTAC600CTTCGATTTAAGTGGAGGGACTTCCAAACGTGTACGCAC604GTCGAGAGATATGTCGAATAGATCCATACCAATCATACCGCTGTT78TAGTTCATTGCCAAAAGCCTTGAGCTTCCGAAACTCCGTCTTG439TGTCGAAAGTACCGCCACCCTGGAGAAGACTGGGTCTAGTTCGGTAAGTTCAATGGGACCTTCTCAAGAATGTTACACGGGAAG980CGCATTCTCCGTAATTTTGATCTCACTGTAATGTTCCATAGCAA861AGAGCAATYGTGTCAATTTTATTCGCCGCYTGTTTCTCAGTTCTGRACTAACCACGAGTAAAGAAGCTCAATACCATGGAATCTATCAACAGGATTTGG235GAACTAGTAAGTTGTCCTGTGCATATTGTGGTTAAAAAGACAGATCATTGCT852CTACTTGCCAACATGTCTAACGTCTAATCATTTCCACGCCCGTCTCG648GGTTCTCATACTTGGCTGCCTCCTCGGGATCCACTTCTAAATG2800CGGGATCCCACATATTGCAAGACTCCCCAGATACATTAGGGTACG2800SC249RTGTTTGACGTGACTACTTGGGGAC7.1.3操作方法7.1.3.1總RNA（總DNA）提取7.1.3.1.1提取方法5按照RNA提取試劑盒（DNA提取試劑盒）操作說明書步驟提取。7.1.3.1.2判定規(guī)則提取的RNA（DNA）質量判定參照DB6111/T172—2021執(zhí)行。DNA判定采用電泳法檢測，RNA有兩條條帶，條帶清晰明亮，微量分光光度計測得OD260/OD280比值1.8至2.2，以此為模板進行后續(xù)試驗或置于-80℃條件下封口保存。不符合以上指標的需重新提取。7.1.3.2逆轉錄按照反轉錄試劑盒操作說明書步驟進行逆轉錄。7.1.3.3病毒檢測7.1.3.3.1PCR擴增7.1.3.3.1.1PCR反應體系在PCR反應管中依次加入10μL2×M5Hiper超光速mix、上下游引物各1.0μL、模板2.0μL、無酶水6.0μL，PCR反應體系為20μL。病毒特異性檢測上下游引物見表1。7.1.3.3.1.2PCR反應程序按PCR擴增試劑盒操作說明書步驟進行聚合酶鏈式反應，待測病毒特異性檢測引物退火溫度按指定值進行輸入，延伸時長可根據片段大小適當調整，采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測PCR產物。7.1.3.4電泳檢測制備1%的瓊脂糖凝膠，每個泳道加入5.0μL