DB34∕T 2723-2016 農(nóng)田雜草馬唐對(duì)草甘膦抗性檢測(cè)技術(shù)規(guī)程

農(nóng)田雜草馬唐對(duì)草甘膦抗性檢測(cè)技術(shù)規(guī)程ofofpracticefordetectionofglyphosate-resistantcrabgrass(DigitariaSanguinalisHYPERLINK27發(fā)布2016-09-2016-10-27實(shí)施27發(fā)布安徽省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由安徽省農(nóng)業(yè)委員會(huì)提出。本標(biāo)準(zhǔn)由安徽省農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：李淑英、朱加保、路獻(xiàn)勇、程福如、馬艷、馬小艷、鄭曙峰、劉方志。1農(nóng)田雜草馬唐對(duì)草甘膦抗性檢測(cè)技術(shù)規(guī)程本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了農(nóng)田雜草馬唐(DigitariaSanguinalis(L.)Scop.)對(duì)除草劑草甘膦抗性的基本檢測(cè)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于農(nóng)田禾本科雜草對(duì)除草劑草甘膦抗性的監(jiān)測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。培養(yǎng)皿測(cè)定法PetriDishScreeningAssay.將雜草種子平鋪于加有不同濃度梯度草甘膦的培養(yǎng)皿內(nèi)，通過測(cè)定草甘膦對(duì)雜草種子的發(fā)芽率、胚根長、胚芽鞘長的影響而進(jìn)行的生物測(cè)定方法。整株植物測(cè)定法Wholeplantpotassays將雜草種子盆栽，在適宜溫濕度條件下培養(yǎng)。當(dāng)雜草培養(yǎng)到適宜時(shí)期，設(shè)置不同劑量草甘膦對(duì)雜草進(jìn)行莖葉處理，通過測(cè)定草甘膦對(duì)雜草生物量的影響而進(jìn)行的生物測(cè)定方法。3.3莽草酸測(cè)定法ShikimicAcidBioassaywithWholePlants將雜草種子盆栽，在適宜溫濕度條件下培養(yǎng)。當(dāng)雜草培養(yǎng)到適宜時(shí)期，設(shè)置不同劑量草甘膦對(duì)雜草進(jìn)行莖葉處理，通過測(cè)定草甘膦對(duì)雜草體內(nèi)莽草酸累積量的影響而進(jìn)行的生物測(cè)定方法。胚根長度從與種子連接處到胚根頂端。2——量取30mLTritonX4.80.3%高錳酸鉀4.101mol/L氫氧化鈉4.120.1%高碘酸5.1電子天平(感量0.1mg);5.11量筒(100mL,250mL,500mL,1000mL);5.12離心管(1.5mL,2mL,10mL);35.15光照培養(yǎng)箱；5.16人工氣候箱：——設(shè)定溫度為白天30℃黑夜25℃、相對(duì)濕度(RH)60±10%、光照周期12h:12h(L:D)。6生物試材6.1試驗(yàn)土壤采用有機(jī)質(zhì)含量≤3%、pH中性、通透性良好、過篩的風(fēng)干壤土，試驗(yàn)前在120℃干燥箱內(nèi)烘6h,滅活土壤內(nèi)雜草種子。6.2雜草種子采集各試驗(yàn)樣點(diǎn)成熟的馬唐種子。經(jīng)過挑選以后將種子放入牛皮紙袋中晾干，保證種子發(fā)芽率在80%以上，放置于4℃低溫冰箱中保存。種子的田間采集區(qū)域不小于100m×50m,每隔20Km取樣1次，然后將每個(gè)地區(qū)或縣域內(nèi)所取樣本混合保存。同時(shí)在沒有施用過草甘膦地區(qū)采集馬唐種子，作為敏感對(duì)照。7試驗(yàn)步驟7.1雜草種子處理首先將供試馬唐種子用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的高錳酸鉀溶液浸泡消毒10min,用無菌水清洗3次。然后在9cm培養(yǎng)皿內(nèi)放2層濾紙，每皿放入50粒馬唐種子，置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)催芽，培養(yǎng)周期和溫度設(shè)為白天30℃12h、黑夜25℃12h,當(dāng)種子露白時(shí)待用。7.2雜草幼苗處理試驗(yàn)土壤定量裝至盆缽的4/5處。采用盆缽底部滲灌方式，使土壤完全濕潤。將預(yù)處理的供試雜草種子均勻撒播于土壤表面，覆土0.5～1.0cm左右，播種后移入人工氣候箱常規(guī)培養(yǎng)。以盆缽底部滲灌方式補(bǔ)水。雜草出苗后進(jìn)行間苗，當(dāng)馬唐長至3-4葉期時(shí)定苗，每缽保留長勢(shì)一致的10棵幼苗。7.3藥液配制rOCN準(zhǔn)確稱取一定量的草甘膦原藥，癰丙酮或其它合適的有機(jī)溶劑溶解，并加夾10%(m/v)用量的TritonX-100,配制成母液備用。7.4處理方法7.4.1培養(yǎng)皿測(cè)定法選20粒經(jīng)預(yù)處理露白的馬唐種子均勻擺放于墊有2張濾紙的培養(yǎng)皿(直徑9cm)內(nèi)，種子的胚根與胚芽的方向要保持一致。將草甘膦母液用0.1%TritonX-100水溶液按照等比梯度配制成5-7個(gè)系列濃度，向培養(yǎng)皿內(nèi)加入5mL系列濃度的草甘膦藥液，使種子充分浸入藥液中，每處理設(shè)6次重復(fù)，并設(shè)不含藥劑的Triton水溶液作空白對(duì)照。4將處理后的培養(yǎng)皿置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)，在12h光照30℃、12h黑暗25℃的條件下培養(yǎng)。同時(shí)保持培養(yǎng)皿內(nèi)濕潤。7.4.2整株植物測(cè)定法標(biāo)定噴霧設(shè)備參數(shù)(噴霧壓力和噴頭類型),校正噴液量；當(dāng)馬唐長到株高10-15cm(4-6葉、2-3個(gè)分蘗)時(shí)，將草甘膦母液用0.1%TritonX-100水溶液按照等比梯度配制成9-11個(gè)系列濃度，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)從低劑量到高劑量順序進(jìn)行噴霧處理。每處理設(shè)6次重復(fù)，并設(shè)不含藥劑的處理作空白對(duì)照。處理后待試材表面藥液自然風(fēng)干，移入人工氣候箱常規(guī)培養(yǎng)。以盆缽底部滲灌方法補(bǔ)水。7.4.3莽草酸測(cè)定法馬唐幼苗的藥劑處理方法同整株植物測(cè)定法。噴藥6d后剪取馬唐植株上部莖葉(倒2、倒3葉)待用。首先稱取新鮮葉片(0.45g-1.25g)加液氮充分研磨，然后按1g新鮮組織加4mL0.25mol/LHCl再次研磨；研磨后放入10mL離心管中平衡后10000g、4℃離心15min。取200μL離心上清液加入2mL0.1%高碘酸，于37℃溫浴2.5-3h,以充分氧化莽草酸；然后加入2mL1mol/LNaOH和1.2mL0.1mol/L甘氨酸充分混勻，終止反應(yīng)；最后用紫外可見光分光光度計(jì)在380nm處測(cè)定吸光度。每克新鮮組織的莽草酸積累量用莽草酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)定。莽草酸標(biāo)準(zhǔn)曲線：將莽草酸標(biāo)準(zhǔn)樣品10.0mg溶于1.0mL0.25mol/LHCl中，分別從中取0、酸稀釋液加入2mL0.1%高碘酸，于37℃溫浴2.5-3h,以充分氧化莽草酸；然后加入2mL1mol/LNaOH和1.2mL0.1mol/L甘氨酸充分混勻，終止反應(yīng)；于紫外可見光分光光度計(jì)380nm處測(cè)定吸光度。通過回歸分析建立莽草酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。7.5結(jié)果調(diào)查培養(yǎng)皿測(cè)定法在草甘膦處理后7d測(cè)量馬唐胚根和胚芽鞘的長度。整株植物測(cè)定法在施藥后7d記錄每個(gè)劑量處理的馬唐癥狀級(jí)別(見表1),并于施藥后14d剪取地上部分稱量鮮重，然后放入干燥箱內(nèi)，經(jīng)70℃48h烘干后稱取干重。采用莽草酸測(cè)定法獲得不同濃度藥劑處理后馬唐體內(nèi)莽草酸的累積量。表1/草甘膦對(duì)馬唐毒害癥狀分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)級(jí)別01心葉輕微萎蔫2葉片從葉尖開始紅褐化卷曲，部分葉片出現(xiàn)枯斑，枯葉面積為203部分葉片紅褐花卷曲，植株整體褪綠紅褐化，枯葉面積為40%～70%,植4植株葉片紅褐化嚴(yán)重，枯葉面積達(dá)到70%以上，植株萎蔫，生長停滯。5植株嚴(yán)重萎蔫，枯死面積達(dá)到95%以上，或整株死8數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析58.1.1根據(jù)培養(yǎng)皿測(cè)定法調(diào)查數(shù)據(jù)，按公式(1)計(jì)算各藥劑處理的胚根長或胚芽鞘長占空白對(duì)照的生長百分率(%),計(jì)算結(jié)果保留小數(shù)點(diǎn)后兩位。R=L?/Lo×100.......................................(1)R——生長百分率(%);Lo——對(duì)照馬唐胚根長(或胚芽鞘長)(mm);L?——處理馬唐胚根長(或胚芽鞘長)(mm)。8.1.2根據(jù)整株植物測(cè)定法調(diào)查數(shù)據(jù)，按公式(2)計(jì)算施藥后馬唐的藥害反應(yīng)的藥害綜合指數(shù)I(%)。I=Z(每缽各毒害級(jí)別雜草株數(shù)×毒害級(jí)別)/(每缽總雜草數(shù)×最高毒害級(jí)別)×100%.....(2)8.1.3根據(jù)調(diào)查數(shù)據(jù)，按公式(3)計(jì)算各藥劑處理馬唐的干重占空白對(duì)照的干重百分率。R=G/Go×100%.................................R——干重百分率(%);Go——對(duì)照馬唐干重(g);G?——各處理馬唐干重(g)。8.2.1用DPS(數(shù)據(jù)處理系統(tǒng))、SAS(統(tǒng)計(jì)分析系統(tǒng))或SPSS(社會(huì)科學(xué)統(tǒng)計(jì)程序)標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)軟件按公式(4)對(duì)藥劑濃度與生長百分率R、藥害綜合指數(shù)I或干重百分率R進(jìn)行非線性回歸分析，計(jì)算EDso、EDo值及95%置信限。R——生長百分率或干重百分率R;I——藥害綜合指數(shù)X——草甘膦濃度(mg/L);D——低濃度草甘膦處理下雜草生長百分率；8.2.2用DPS(數(shù)據(jù)處理系統(tǒng))交SAS(統(tǒng)計(jì)分析系統(tǒng))或SPSS或社會(huì)科學(xué)統(tǒng)誅程序)標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)軟件按公式(5)對(duì)藥劑濃度與莽草酸積累量進(jìn)行非線性回歸分析，計(jì)算EDo、ED9o值及95%置信限。U=D+(C-D)/[1+exp[b×(logx-logEDso)]]......................x——草甘膦濃度(mg/L);D——當(dāng)草甘膦濃度為0時(shí)莽草酸積累量；ED?o——當(dāng)莽草酸積累量達(dá)C與D之間的50%時(shí)的草甘膦濃度(mg/L);69抗藥性水平的計(jì)算與評(píng)估9.1抗性倍數(shù)的計(jì)算根據(jù)敏感雜草生物型的ED?o值和測(cè)試雜草生物型的ED?o值，按公式(6)計(jì)算測(cè)試種群的抗性倍RR=T/S