T-LNSI 007-2024 人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞庫

ICS11.020CCSC05I 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 4縮略詞 5建設(shè)要求 6管理要求 7通則 8技術(shù)要求 9數(shù)據(jù)管理 10檢驗方法 11檢驗規(guī)則 12使用說明 14包裝、儲存及運輸 15不合格產(chǎn)品的處理 T/LNSI007-2024本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化的文件結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由沈陽艾米奧生物工程技術(shù)研發(fā)中心有限公司、沈陽市再生生物醫(yī)學(xué)重點實驗室提出。本文件由遼寧省免疫學(xué)會歸口。本文件起草單位：沈陽艾米奧生物工程技術(shù)研發(fā)中心有限公司、中國醫(yī)科大學(xué)干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究室、沈陽市再生生物醫(yī)學(xué)重點實驗室、沈陽市干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)重點實驗室、遼寧艾米奧干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究院、遼寧省細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會、遼寧省生物技術(shù)協(xié)會、沈陽市干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新聯(lián)盟、沈陽藥科大學(xué)、中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院、中國醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院、中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院、艾米奧國際干細(xì)胞醫(yī)院。本文件主要起草人：龐希寧、龐然、施萍、單風(fēng)平、王莉莎、赫甡、宋揚、徐東芬、荊晶、姜雯宇、高航、謝光麟、邵錫柱、王竟、孟濤、蘇航、張美玲、聶宏光、郎宏鑫、劉曉玉、王喜良、張濤、趙峰、張殿寶、王瑞、李彩虹、李宏圖、潘長偉、孔娟、王哲、王蔚、殷軍、郭然、張寧、李曉航、王嬌。本標(biāo)準(zhǔn)的制訂基于相關(guān)技術(shù)的綜合考慮，旨在推動行業(yè)的發(fā)展和規(guī)范化。在編寫過程中，團體成員充分研究了現(xiàn)有技術(shù)和專利信息，并積極尋求相關(guān)權(quán)益方的支持和參與。特此聲明，在編寫本標(biāo)準(zhǔn)期間，我們已經(jīng)采取了合理的努力來促進(jìn)并保護(hù)涉及的知識產(chǎn)權(quán)。鑒于技術(shù)的不斷創(chuàng)新和發(fā)展，如果其他相關(guān)專利或權(quán)益未在本標(biāo)準(zhǔn)中明確聲明，請權(quán)益人及時聯(lián)系標(biāo)準(zhǔn)制定團體，以便進(jìn)行進(jìn)一步的溝通和許可。本標(biāo)準(zhǔn)中使用的專利聲明如下：[CN2013100323661]：[沈陽艾米奧生物工程技術(shù)研發(fā)中心有限公司]，[CN]，[人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞庫的構(gòu)建方法]。以上聲明是為了更好地保護(hù)知識產(chǎn)權(quán)，遵循了國家相關(guān)法律法規(guī)和知識產(chǎn)權(quán)的規(guī)定。我們鼓勵所有使用本標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)方與專利權(quán)人合作，以確保公平的利益分配和技術(shù)發(fā)展。1T/LNSI007-2024人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞庫本文件規(guī)定了人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞庫的構(gòu)建過程，其中包括制備、凍存、復(fù)蘇等的規(guī)范性操作和推薦方法。本文件適用于醫(yī)療機構(gòu)等構(gòu)建人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞儲備庫。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。T/CSCB0009-2022《人干細(xì)胞研究倫理審查技術(shù)規(guī)范》GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T5458液氮生物容器GB50457醫(yī)藥工業(yè)潔凈廠房設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)WS213丙型肝炎診斷WS279梅毒診斷WS293-2019《艾滋病和艾滋病病毒感染診斷標(biāo)準(zhǔn)》干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則（試行）中華人民共和國藥典（2020年版）全國臨床檢驗操作規(guī)程3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1羊膜amnioticmembrane2T/LNSI007-2024子宮內(nèi)包被胎兒的一層薄膜。胎膜的最內(nèi)層，是人體最厚的一層基底膜。3.2人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞humanamnioticmesenchymalstemcells一類來源于人羊膜間充質(zhì)，貼壁培養(yǎng)后呈成纖維細(xì)胞樣形態(tài)（紡錘形和梭形）、可在體外自我更新并具有成骨、成脂、成軟骨等分化能力的間充質(zhì)干細(xì)胞。3.3人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞庫humanamnioticmesenchymalstemcellbank用于儲存人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的專門機構(gòu)。3.4凍存的細(xì)胞cryopreservedcells性而進(jìn)行長期儲存的細(xì)胞。3.5非凍存的細(xì)胞non-cryopreservedcells是指未經(jīng)過深低溫冷凍儲存的活細(xì)胞。4縮略語下列縮略適用于本文件。CD——分化簇（ClusterofDifferentiation）DNA——脫氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）EBV——皰疹病毒（Epstein-BarVirus）HBV——乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus）HCMV——人巨細(xì)胞病毒（HumanCytomegalovirus）HCV——丙型肝炎病毒（HepatitisCVirus）HIV——人類免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus）HLA-DR——人類白細(xì)胞抗原-DR（HumanLeukocyteAntigen-DR）HTLV——人類嗜T細(xì)胞病毒（HumanT-lymphotropicVirus）IDO——吲哚胺2,3-雙加氧酶（Indoleamine2,3-dioxygenase）IFN-γ——干擾素-γ（Interferon-γ)TNF-α——腫瘤壞死因子-α（TumorNecrosisFactor-α)PCR——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction）STR——短串聯(lián)重復(fù)序列（ShortTandemRepeat）3T/LNSI007-2024TP——梅毒螺旋體（TreponemaPallidum）5建設(shè)要求5.1總體原則范》的要求。5.2機構(gòu)設(shè)置5.2.1人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞庫或其所屬機構(gòu)應(yīng)是依法成立并能夠承擔(dān)相應(yīng)法律責(zé)任的法人或其他組5.2.2人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞庫應(yīng)遵循《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》的要求，設(shè)置與質(zhì)量管理、技術(shù)運作相匹配的職能部門。5.2.3人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞庫應(yīng)建立統(tǒng)一領(lǐng)導(dǎo)、分級管理、職責(zé)明確的管理機構(gòu)，并有明確的組織架構(gòu)圖。5.2.4人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞庫管理機構(gòu)應(yīng)有相匹配的人員配置，關(guān)鍵人員應(yīng)至少包括最高管理者、醫(yī)學(xué)負(fù)責(zé)人、技術(shù)負(fù)責(zé)人、質(zhì)量負(fù)責(zé)人等。5.2.5人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞庫關(guān)鍵人員職責(zé)及能力要求應(yīng)符合《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則（試行）》的相關(guān)要求6管理要求6.1設(shè)備管理6.1.1設(shè)備采購及驗收6.1.1.1設(shè)備采購前應(yīng)完成性能需求、用途及設(shè)備供應(yīng)商的調(diào)研，保證設(shè)備符合預(yù)期細(xì)胞制備及檢測要求。6.1.1.2設(shè)備采購應(yīng)簽訂采購合同。6.1.1.3儀器設(shè)備在安裝驗收合格后，應(yīng)配置唯一識別碼，安裝調(diào)試記錄納入設(shè)備確認(rèn)文件中。6.1.2設(shè)備計量4T/LNSI007-20246.1.2.1具有測量功能的設(shè)備應(yīng)在檢定/校準(zhǔn)合格后方可投入使用。6.1.2.2設(shè)備檢定/校準(zhǔn)應(yīng)由有資質(zhì)的計量單位執(zhí)行，所有檢定/校準(zhǔn)的結(jié)果和數(shù)據(jù)須經(jīng)設(shè)備使用部門確認(rèn)。6.1.2.3設(shè)備經(jīng)修理、更新升級或搬運后，應(yīng)對其性能是否滿足使用要求進(jìn)行重新確認(rèn)。6.1.3設(shè)備使用6.1.3.1設(shè)備現(xiàn)場應(yīng)配有操作規(guī)程。6.1.3.2設(shè)備應(yīng)有明確的狀態(tài)標(biāo)識。6.1.3.3設(shè)備使用人員應(yīng)及時填寫使用記錄。6.1.4設(shè)備維護(hù)維修6.1.4.1儀器設(shè)備均應(yīng)按照維護(hù)規(guī)程進(jìn)行維護(hù)保養(yǎng)，并予以記錄。6.1.4.2應(yīng)建立完善的儀器設(shè)備維修程序，內(nèi)部維修人員應(yīng)經(jīng)廠家工程師培訓(xùn)考核后方可執(zhí)行維修工作，委外維修應(yīng)保留維修記錄。6.1.5儲存設(shè)備管理6.1.5.1人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞庫的液氮安全應(yīng)符合GB/T5458的規(guī)定。6.1.5.2應(yīng)定期檢查液氮容量，并建立相應(yīng)的檢查登記制度。6.1.5.3工作人員在操作中接觸到液氮時，需使用防護(hù)面罩和防凍手套，并做好其它防凍措施。6.2物料管理6.2.1采購6.2.1.1應(yīng)建立完善的供應(yīng)商篩選、登記、考察、年度資格評審程序。新增或變更物料供應(yīng)商應(yīng)進(jìn)行質(zhì)量審計或評估，并對新物料開展試驗驗證，確認(rèn)符合細(xì)胞產(chǎn)品工藝要求。6.2.1.2應(yīng)按照《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》的相關(guān)要求審查生產(chǎn)商、經(jīng)銷商提供的資質(zhì)說明及證明材料。6.2.2驗收應(yīng)制定物料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，建立物料接收、檢驗、放行程序。檢驗合格的物料方可放行入庫；檢驗不合格的物料，應(yīng)將信息及時反饋至供應(yīng)商，在未換貨之前應(yīng)放置在指定區(qū)域并加以標(biāo)識。5T/LNSI007-20246.2.3庫存管理應(yīng)配置與產(chǎn)能相匹配的物料存放區(qū)，關(guān)鍵物料（包括采集運輸容器、制備、凍存、檢測等所用物料）應(yīng)按廠家說明書和具體的技術(shù)要求進(jìn)行儲存。應(yīng)對未經(jīng)檢驗或臨時緊急采購的物料進(jìn)行單獨管控。6.2.4使用6.2.4.1物料應(yīng)嚴(yán)格按照其說明書進(jìn)行使用，不得超范圍使用。6.2.4.2物料使用過程中應(yīng)及時填寫記錄，確保其可追溯性。6.3環(huán)境控制6.3.1潔凈區(qū)凈化環(huán)境檢測應(yīng)采用第三方檢測和自檢相結(jié)合的方式進(jìn)行，第三方檢測應(yīng)由具有資質(zhì)的省級以上專業(yè)機構(gòu)進(jìn)行。6.3.2第三方檢測項目應(yīng)符合GB50457的要求。檢測周期不得低于兩年一次。6.3.3自檢項目應(yīng)符合GB50457的要求。6.4記錄控制6.4.1應(yīng)建立和保持記錄管理程序，對記錄的標(biāo)識、存放、檢索、保留和處置加以規(guī)范。6.4.2記錄內(nèi)容應(yīng)覆蓋整個管理體系，包括質(zhì)量記錄、技術(shù)記錄，每項記錄信息應(yīng)充分。6.4.3所有記錄的存放條件應(yīng)有安全保護(hù)措施，對電子儲存的記錄也應(yīng)采取與書面記錄同等措施以防止未經(jīng)授權(quán)的侵入或修改，電子記錄應(yīng)加以備份。6.5文件管理6.5.1應(yīng)建立控制干細(xì)胞庫管理體系的內(nèi)部和外部文件的程序。6.5.2應(yīng)依據(jù)制定的文件管理程序，對文件的編制、審核、批準(zhǔn)、發(fā)布、標(biāo)識、變更、和廢止等各個環(huán)節(jié)實施控制。6.6.3保密文件應(yīng)按保密制度嚴(yán)格管控，不得隨意借閱、復(fù)印。6.7.4應(yīng)對文件時效性進(jìn)行定期檢查，防止使用無效或作廢文件。7通則7.1方案制定人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞庫研究項目啟動前應(yīng)當(dāng)制訂工作方案。工作方案的內(nèi)容包括但不限于：目標(biāo)與任6T/LNSI007-2024務(wù)、操作流程、工作條件、生物安全等級、操作人員資質(zhì)、供體選擇要求、人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)、參考文獻(xiàn)等。7.2知情同意人羊膜組織的獲取，在充分尊重、告知人體組織提供者權(quán)益的前提下簽署知情同意書，告知內(nèi)容包括但不限于：組織的處置方案及可能涉及的應(yīng)用場景。宜對組織提供者的個人信息進(jìn)行隱私保護(hù)，嚴(yán)禁泄露可識別供體及親屬身份的信息，如：姓名、肖像、證件、社會關(guān)系等。7.3隱私保護(hù)應(yīng)當(dāng)對樣本提供者的個人信息采取保密措施。8技術(shù)要求8.1原材料和輔料8.1.1應(yīng)符合T/CSCB0009-2022要求。8.1.2應(yīng)建立供者細(xì)胞采集的供者評估與篩選標(biāo)準(zhǔn)、采集方法、運輸標(biāo)準(zhǔn)和交接標(biāo)準(zhǔn)，保證供者和細(xì)胞的安全。8.1.3供體應(yīng)篩查HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、HCMV和TP，并記錄結(jié)果。8.2采集與培養(yǎng)方法8.2.1樣本采集8.2.1.1人羊膜組織樣本采集應(yīng)由專業(yè)的醫(yī)護(hù)人員完成。8.2.1.2羊膜的采集場所應(yīng)達(dá)到Ⅲ級潔凈手術(shù)室要求。8.2.2樣本運輸8.2.2.1樣本運輸人員應(yīng)是經(jīng)過培訓(xùn)合格的專門人員。8.2.2.2羊膜樣本的運輸溫度為2℃~8℃,樣本離體時間不宜超過24h。8.2.2.3樣本運輸過程應(yīng)受控并建立記錄檔案。8.2.3樣本接收8.2.3.1接收樣本時應(yīng)先檢查容器外觀有無破損，并記錄。7T/LNSI007-20248.2.3.2檢查《樣本采集信息記錄表》的信息是否齊全，確認(rèn)無誤后對樣本進(jìn)行唯一性標(biāo)識。8.2.3.3用75%的醫(yī)用酒精對容器外表面進(jìn)行消毒，依據(jù)樣本接收標(biāo)準(zhǔn)，對檢測達(dá)標(biāo)后的樣本進(jìn)行接收；檢測不達(dá)標(biāo)的樣本拒收后進(jìn)行銷毀，并做好相應(yīng)記錄。8.2.4分離及提取人羊膜組織樣本剪至片狀，用胰酶消化法去除羊膜上皮細(xì)胞。然后將人羊膜組織剪碎，用膠原酶消化法分離人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞。進(jìn)行人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)。8.2.5人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)根據(jù)細(xì)胞的生長情況換液和傳代。8.2.6人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞凍存凍存細(xì)胞程序降溫后置液氮中保存。8.2.7人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇取出凍存管進(jìn)行快速融化、離心洗滌后進(jìn)行培養(yǎng)。8.2.8人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞溶液人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞溶液應(yīng)為均質(zhì)狀態(tài)，無絮狀沉淀，細(xì)胞存活率≥90％。8.3關(guān)鍵質(zhì)量屬性8.3.1細(xì)胞形態(tài)細(xì)胞貼壁培養(yǎng)時呈紡錘形和梭形的成纖維細(xì)胞態(tài)，形態(tài)均一。8.3.2染色體核型正常核型應(yīng)為46,XX或46,XY。8.3.3細(xì)胞存活率未凍存細(xì)胞存活率≥90%且凍存復(fù)蘇后細(xì)胞存活率≥70%。8.3.4細(xì)胞標(biāo)志蛋白CD105、CD73、CD90陽性率均≥95%；CD11b、CD19、CD31、CD34、CD45、HLA-DR陽性率8T/LNSI007-2024≤2%。8.3.5免疫調(diào)節(jié)經(jīng)炎癥因子（IFN-γ或者IFN-γ聯(lián)合TNF-α)誘導(dǎo)后表達(dá)吲哚胺2,3-雙加氧酶（IDO）。與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)能抑制T淋巴細(xì)胞增殖及分泌IFN-γ、TNF-α。8.3.6三系分化具有成骨、成脂和成軟骨的分化潛能。8.3.7成瘤性免疫缺陷動物（如小鼠）體內(nèi)成瘤試驗結(jié)果為陰性。8.3.8微生物真菌、細(xì)菌、支原體、HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、HCMV、TP為陰性。8.4過程控制8.4.1擴增、凍存、復(fù)蘇等過程控制應(yīng)符合T/CSCB0009-2022要求。8.4.2細(xì)胞STR檢測結(jié)果應(yīng)與供體細(xì)胞保持一致。9數(shù)據(jù)管理9.1數(shù)據(jù)采集將凍存后的人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的詳細(xì)信息（包括供者姓名、年齡、住院號、新生兒性別和化驗檢查信息等）輸入電腦數(shù)據(jù)庫，建立完善的數(shù)據(jù)檔案備查詢。9.2人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞庫構(gòu)建按人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞提取日期進(jìn)行保存，建立可供檢索的人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞信息檔案，即構(gòu)建出人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞儲備庫。9.2.1入庫9.2.1.1干細(xì)胞產(chǎn)品入庫前應(yīng)有雙人復(fù)核，確認(rèn)信息無誤。9.2.1.2干細(xì)胞入庫過程應(yīng)記錄完整，確保信息的可追溯性。9T/LNSI007-20249.2.2深低溫儲存9.2.2.1干細(xì)胞產(chǎn)品應(yīng)保存在-130℃及以下。9.2.2.2干細(xì)胞產(chǎn)品標(biāo)簽及記錄應(yīng)標(biāo)明保存溫度及儲存效期。9.2.2.3處于儲存狀態(tài)的干細(xì)胞產(chǎn)品未經(jīng)批準(zhǔn)不得隨意變更儲存位置和狀態(tài)。9.2.2.4干細(xì)胞產(chǎn)品的儲存應(yīng)注意以下事項：——儲存區(qū)不應(yīng)存放可對干細(xì)胞產(chǎn)品產(chǎn)生不良影響的物料及試劑；——對于浸沒在液氮中的干細(xì)胞產(chǎn)品應(yīng)采用避免發(fā)生交叉污染的措施——干細(xì)胞產(chǎn)品應(yīng)確保其標(biāo)識清晰易認(rèn)。9.2.2.5應(yīng)制定凍存的干細(xì)胞產(chǎn)品穩(wěn)定性考察計劃，定期對儲存系統(tǒng)穩(wěn)定性及干細(xì)胞產(chǎn)品活性進(jìn)行監(jiān)測。9.2.3出庫9.2.3.1應(yīng)建立干細(xì)胞產(chǎn)品出庫相關(guān)制度。9.2.3.2干細(xì)胞產(chǎn)品應(yīng)經(jīng)質(zhì)量評價及負(fù)責(zé)人審核確認(rèn)后方可出庫。9.2.4非凍存的干細(xì)胞產(chǎn)品9.2.4.1確認(rèn)根據(jù)客戶要求制備的干細(xì)胞產(chǎn)品，應(yīng)經(jīng)客戶及相關(guān)負(fù)責(zé)人確認(rèn)。9.2.4.2發(fā)放9.2.4.3干細(xì)胞產(chǎn)品應(yīng)經(jīng)過質(zhì)量評價，產(chǎn)品合格并經(jīng)負(fù)責(zé)人審核確認(rèn)后發(fā)放。9.2.4.4發(fā)放時應(yīng)有雙人復(fù)核細(xì)胞產(chǎn)品及發(fā)放信息，并確保細(xì)胞產(chǎn)品包裝容器的完整性。10檢驗方法10.1細(xì)胞形態(tài)二維培養(yǎng)條件下，用明視場細(xì)胞顯微鏡×40倍進(jìn)行觀察。10.2染色體核型按照《中華人民共和國藥典（2020年版）》中“生物制品生產(chǎn)檢定用動物細(xì)胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)程”項檢驗。T/LNSI007-202410.3細(xì)胞存活率按照附錄A的方法檢驗。10.4細(xì)胞表面標(biāo)志物按照附錄B的方法檢驗。10.5免疫調(diào)節(jié)10.5.1誘導(dǎo)IDO表達(dá)按照附錄C的方法檢驗。10.5.2抑制T淋巴細(xì)胞增殖按照附錄D的方法檢驗。10.5.3抑制T淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ、TNF-α按照附錄E的方法檢驗。10.6三系分化10.6.1成骨分化按照附錄F的方法檢驗。10.6.2成脂分化按照附錄G的方法檢驗。10.6.3成軟骨分化按照附錄H的方法檢驗。10.7成瘤性按照附錄I的方法檢驗。10.8微生物10.8.1真菌按照《中華人民共和國藥典（2020年版）》中“1101無菌檢查法”項檢測。T/LNSI007-202410.8.2細(xì)菌按照《中華人民共和國藥典（2020年版）》中“1101無菌檢查法”項檢測。10.8.3支原體按照《中華人民共和國藥典（2020年版）》中“3301無菌檢查法”項檢測。10.8.4HBV按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程（2020年版）》核酸法檢驗。10.8.5HCV按照WS213核酸法檢驗。10.8.6HIV按照WS293-2019核酸法檢驗。10.8.7HTLV按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》核酸法檢驗。10.8.8EBV按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》核酸法檢驗。10.8.9HCMV按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》核酸法檢驗。10.8.10TP按照WS273核酸法檢驗。11檢驗規(guī)則11.1抽樣方法和數(shù)量11.1.1在一個生產(chǎn)周期中，同一生產(chǎn)線、同一來源、同一代次、同一方法制備出來的產(chǎn)品為一批。11.1.2在同一批的產(chǎn)品中隨機抽取3個最小包裝單元。T/LNSI007-202411.2出廠檢驗11.2.1每批產(chǎn)品應(yīng)進(jìn)行出廠檢驗，并附檢驗報告。11.2.2出廠檢驗項目應(yīng)包括8.3規(guī)定的所有項目。11.3復(fù)核檢驗根據(jù)需要，應(yīng)由第三方專業(yè)細(xì)胞檢驗機構(gòu)/實驗室進(jìn)行復(fù)核檢驗，檢驗項目應(yīng)包括第8章規(guī)定的所有項目。11.4判定規(guī)則11.4.1出廠檢驗項目全部符合8.3規(guī)定，判定為合格品；有1項及以上不符合本文件規(guī)定，則判為不合格品。11.4.2復(fù)核檢驗項目全部符合8.3規(guī)定，判定為合格品；有1項及以上不符合本文件規(guī)定，則判為不合格品。12使用說明應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：a）產(chǎn)品名稱；b）細(xì)胞代次；c）細(xì)胞數(shù)量；d）生產(chǎn)日期；e）生產(chǎn)批號；f）生產(chǎn)組織；g）儲存條件；h）運輸條件；i）使用方法；j）執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)號；k）生產(chǎn)地址；l）聯(lián)系方式；T/LNSI007-2024n）注意事項。注：根據(jù)用戶需求，可標(biāo)注內(nèi)毒素含量。13標(biāo)簽應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：c）細(xì)胞數(shù)量；e）生產(chǎn)組織；f）生產(chǎn)日期。14包裝、儲存及運輸14.1包裝非凍存細(xì)胞應(yīng)選擇對人羊膜上皮干細(xì)胞關(guān)鍵質(zhì)量屬性無影響的袋或瓶中，應(yīng)選用100毫升0.9%生理鹽水袋或瓶。14.2儲存14.2.1應(yīng)符合T/CSCB0009-2022要求。14.2.2應(yīng)在低于-130℃環(huán)境下儲存。14.3運輸14.3.1應(yīng)符合T/CSCB0009-2022要求，應(yīng)建立運輸和轉(zhuǎn)運程序，以確保干細(xì)胞產(chǎn)品運輸?shù)陌踩浴?4.3.2凍存的細(xì)胞應(yīng)在干冰或低于-130℃條件下運輸，非凍存細(xì)胞建議在2℃~8℃下運輸。14.3.3用于運輸和轉(zhuǎn)運干細(xì)胞產(chǎn)品的容器，其材質(zhì)應(yīng)防漏、抗震、抗壓力變化，并應(yīng)對其安全性進(jìn)行定期檢查。14.3.4干細(xì)胞產(chǎn)品在運輸或轉(zhuǎn)運前應(yīng)制定詳細(xì)計劃，并明確以下信息：——確保運輸路徑和時間最短；——有緊急情況下可替換運輸方式的應(yīng)急計劃；T/LNSI007-2024——干細(xì)胞產(chǎn)品不應(yīng)通過X射線設(shè)備檢查；——能夠連續(xù)監(jiān)控轉(zhuǎn)運容器的溫度。14.3.5干細(xì)胞產(chǎn)品運輸和轉(zhuǎn)運過程應(yīng)有記錄。15不合格產(chǎn)品的處理15.1.不符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的干細(xì)胞產(chǎn)品，按照醫(yī)療廢物處理，應(yīng)按照T/CSCB0009-2022中的規(guī)定處理。15.2儲存干細(xì)胞產(chǎn)品的處理應(yīng)經(jīng)醫(yī)學(xué)負(fù)責(zé)人批準(zhǔn)同意后方可執(zhí)行。15.3因干細(xì)胞產(chǎn)品不合格而導(dǎo)致的退貨及召回，應(yīng)按照《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》執(zhí)行。T/LNSI007-2024（規(guī)范性）細(xì)胞存活率檢測細(xì)胞計數(shù)法A.1儀器和設(shè)備A.1.1明視場顯微鏡。A.1.2血球計數(shù)板。A.2試劑除特殊說明外，所用試劑均為分析純，檢測用水均為18.2MΩ去離子水。A.2.1磷酸鹽緩沖液：pH為7.4。A.2.2臺盼藍(lán)染液：使用時，用磷酸鹽緩沖液（A.2.1）稀釋至0.4%（質(zhì)量濃度）。A.3檢測步驟A.3.1細(xì)胞懸液制備收集待檢測細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液（A.2.1）配制細(xì)胞懸液，稀釋至合適的濃度。每個血球計數(shù)板（A.1.2）的1mm2的方格中的細(xì)胞數(shù)量應(yīng)為20個~50個細(xì)胞。如果高于200個細(xì)胞，則需要進(jìn)行稀釋。A.3.2細(xì)胞染色按1:1的體積比將臺盼藍(lán)染液（A.2.2）與細(xì)胞懸液（A.3.1）混合均勻。A.3.3細(xì)胞計數(shù)將蓋玻片蓋在血球計數(shù)板（A.1.2）計數(shù)槽上，取10μL混合液（A.3.2）滴在一側(cè)計數(shù)室的蓋玻片邊緣，另取10μL混合液，滴在另一側(cè)計數(shù)室的蓋玻片邊緣，使混合液充滿蓋玻片和計數(shù)板之間，靜止30s，將計數(shù)板置明視場顯微鏡（A.1.1）下對被染色的細(xì)胞和細(xì)胞總數(shù)分別進(jìn)行計數(shù)。對16×25規(guī)格的計數(shù)室，按對角線位，取左上、右上、左下、右下4個1mm2的中格（即100個小格）計數(shù)。對25×16規(guī)格的計數(shù)室，按對角線位，取左上、右上、左下、右下和中央5個中格（即80個小格）計數(shù)。當(dāng)遇到位于大格線上的細(xì)胞，一般只計數(shù)大方格的上方和左線上的細(xì)胞（或只計數(shù)下方和右方線上的細(xì)胞）。按步驟A.3.2~A.3.3在重復(fù)測定一個樣品。T/LNSI007-2024A.3.4細(xì)胞存活率計算A.4計算與分析細(xì)胞存活率按式（A.1）進(jìn)行計算：X=（M―S）/M×100％.........................................（A.1）式中：X—細(xì)胞存活率；M—細(xì)胞總數(shù)；S—染色的細(xì)胞數(shù)。計算兩次計數(shù)細(xì)胞存活率結(jié)果的平均值，記為細(xì)胞平均存活率。A.5精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算數(shù)平均值的10%。T/LNSI007-2024（規(guī)范性）細(xì)胞標(biāo)志蛋白檢測流式細(xì)胞法B.1儀器和設(shè)備B.1.1流式細(xì)胞儀。B.1.2水平離心機。B.1.3電子天平。B.2試劑本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實驗用水均為GB/T6682規(guī)定的一級水。B.2.1磷酸鹽緩沖液：pH7.4。B.2.2牛血清白蛋白（BSA）：純度≥98%。B.2.3疊氮鈉（NaN3）。B.2.4抗人CK19、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD31、CD34、CD45、CD49d抗體及同型對照抗體。B.2.5按照相應(yīng)要求使用電子天平（B.1.3）配置流式檢測所需的液體：洗滌液、抗體稀釋液。B.3樣品保存洗滌液和標(biāo)記后的樣品于2℃~8℃保存。相關(guān)抗體遵照說明書保存。B.4檢測步驟B.4.1樣品準(zhǔn)備收集細(xì)胞，使用水平離心機（B.1.2）300g離心4min，棄上清。然后，用洗滌液清洗1次，使用水平離心機（B.1.2）300g離心4min，棄上清。B.4.2抗體孵育按照抗體說明書進(jìn)行稀釋使用?？贵w孵育結(jié)束后用洗滌液清洗兩遍，使用水平離心機（B.1.2）300g離心4min，棄上清。T/LNSI007-2024B.4.3過濾上機用洗滌液重懸細(xì)胞，然后通過40μm濾網(wǎng)轉(zhuǎn)移到流式管中，按流式細(xì)胞儀（B.1.1）應(yīng)用手冊上機檢測。B.4.4圈門設(shè)定原則首先根據(jù)細(xì)胞大小和顆粒度設(shè)門圈出目標(biāo)細(xì)胞分群1，排除死細(xì)胞和其他雜細(xì)胞，然后根據(jù)Isotype對照組熒光強度，在分群1的基礎(chǔ)上畫出陽性細(xì)胞群2，排除沒有被熒光抗體標(biāo)記的陰性細(xì)胞。抗體Isotype作為陰性對照。B.5結(jié)果分析得到的檢測結(jié)果用軟件綜合分析，具體參考其軟件使用說明。T/LNSI007-2024（規(guī)范性）誘導(dǎo)IDO表達(dá)檢測PCR法C.1儀器和設(shè)備C.1.1核酸含量測定儀。C.1.2PCR擴增儀。C.1.3電泳儀。C.1.4凝膠成像儀。C.2試劑本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實驗用水均為GB/T6682規(guī)定的一級水。C.2.1人重組IFN-γ和人重組TNF-α。C.2.2RNA提取試劑盒。C.2.3RNA逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒。C.2.4PCR引物。C.2.5TaqDNA聚合酶。C.2.6Ladder內(nèi)標(biāo)。C.3檢測步驟C.3.1IFN-γ或IFN-γ+TNF-α處理根據(jù)附錄A方法測定，計算人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞懸液活細(xì)胞濃度。按細(xì)胞（1×105~4×105）個/cm2接種，在人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)體系中添加IFN-γ（10ng/mL~30ng/mL）或IFN-γ（10ng/mL~30ng/mL）+TNF-α（10ng/mL~30ng/mL），正常培養(yǎng)12h~36h。同時設(shè)立未使用IFN-γ或IFN-γ+TNF-α處理的人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞為對照組，培養(yǎng)同樣時間。C.3.2人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞總RNA提取根據(jù)RNA提取試劑盒產(chǎn)品說明進(jìn)行，并使用核酸含量測定儀（C.1.1）進(jìn)行核酸含量測定。C.3.3逆轉(zhuǎn)錄PCRT/LNSI007-2024根據(jù)RNA逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒產(chǎn)品說明書進(jìn)行，使用PCR擴增儀（C.1.2）獲得cDNA，并擴增IDO基因。C.3.4PCR產(chǎn)物電泳根據(jù)電泳應(yīng)用手冊進(jìn)行電泳檢測。C.3.5凝膠成像根據(jù)凝膠成像儀應(yīng)用手冊，使用電泳儀（C.1.3），進(jìn)行電泳檢測。C.4結(jié)果分析使用凝膠成像儀（C.1.4）進(jìn)行成像，未使用IFN-γ或IFN-γ+TNF-α處理的人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞檢測不到IDO條帶，IFN-γ或IFN-γ+TNF-α刺激后檢測到IDO條帶。T/LNSI007-2024（規(guī)范性）抑制T細(xì)胞增殖檢測CFSE標(biāo)記法D.1儀器和設(shè)備D.1.1血球計數(shù)板。D.1.2倒置顯微鏡。D.1.3水平離心機。D.1.4流式細(xì)胞儀。D.2試劑本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實驗用水均為GB/T6682規(guī)定的一級水。D.2.1磷酸緩沖液：pH為7.4。D.2.2消化酶。D.2.3臺盼藍(lán)染液：使用時，用磷酸鹽緩沖液（D.2.1）稀釋至0.4%（質(zhì)量濃度）。D.2.4植物凝集素。D.2.5淋巴細(xì)胞分離液。D.2.6抗體（anti-CD3抗體）。D.2.7羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯（CFSE）染料。D.3檢測步驟D.3.1T細(xì)胞分離及染色D.3.1.1T細(xì)胞分離利用淋巴細(xì)胞分離液（D.2.5分離外周血單核細(xì)胞（PBMC用適量無菌磷酸鹽緩沖液（D.2.1）使用水平離心機（D.1.3）洗滌2次。然后孵育抗體；用適量無菌磷酸鹽緩沖液（D.2.1）使用水平離心機（D.1.3）洗滌2次。重懸細(xì)胞至濃度為5×107細(xì)胞/mL，40μm濾網(wǎng)轉(zhuǎn)移到流式管中，按流式細(xì)胞儀應(yīng)用手冊上機分選。D.3.1.2T細(xì)胞染色T/LNSI007-2024根據(jù)附錄A方法測定，使用血球計數(shù)板（D.1.1）及顯微鏡（D.1.2）計算細(xì)胞懸液活細(xì)胞濃度。然后進(jìn)行CFSE標(biāo)記，根據(jù)CFSE產(chǎn)品說明書進(jìn)行。D.3.2T細(xì)胞與人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)D.3.2.1T細(xì)胞增殖根據(jù)附錄A方法測定，使用血球計數(shù)板（D.1.1）及顯微鏡（D.1.2）計算T細(xì)胞懸液活細(xì)胞濃度，按1×106細(xì)胞/mL接種培養(yǎng)，并用（2~5）μg/mL植物凝集素（D.2.4）刺激T細(xì)胞增殖，設(shè)立未用植物凝集素（D.2.4）刺激的T細(xì)胞培養(yǎng)作為對照，培養(yǎng)96h，用于檢測刺激后T細(xì)胞增殖百分比A。D.3.2.2人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞抑制T細(xì)胞增殖利用消化酶消化人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞并制備成單細(xì)胞懸液，根據(jù)附錄A方法測定，計算T細(xì)胞與人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞懸液活細(xì)胞濃度。人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞按2×105細(xì)胞/mL接種，細(xì)胞貼壁后，將T細(xì)胞按5:1（T細(xì)胞：人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞）的比例進(jìn)行共培養(yǎng)，并用（2~5）μg/mL的植物凝集素（D.2.4）刺激T細(xì)胞增殖，培養(yǎng)96h，用于檢測人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞抑制后T細(xì)胞增殖百分比C。D.3.3T細(xì)胞收集并檢測收集培養(yǎng)后的T細(xì)胞，用適量無菌磷酸鹽緩沖液（D.2.1）使用水平離心機（D.1.3）洗滌2次，通過40μm濾網(wǎng)轉(zhuǎn)移到流式管中，按流式細(xì)胞儀（D.1.4）應(yīng)用手冊上機檢測。D.3.4圈門設(shè)定原則首先根據(jù)細(xì)胞大小和顆粒度設(shè)門圈出目標(biāo)細(xì)胞分群1，排除死細(xì)胞和其他雜細(xì)胞，排除沒有被熒光抗體標(biāo)記的陰性細(xì)胞。然后根據(jù)未用植物凝集素刺激的T細(xì)胞的熒光強度，在分群1的基礎(chǔ)上畫出CFSE母代細(xì)胞位置，根據(jù)CFSE母代細(xì)胞位置畫出自代細(xì)胞群2（即為T細(xì)胞增殖的百分比）。D.4結(jié)果分析得到的檢測結(jié)果用軟件綜合分析，具體參考其軟件使用說明。并計算人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞對T增殖的抑制率。抑制率按式（D.1）進(jìn)行計算：Y=（A―C）/A×100％............................................（D.1）式中：T/LNSI007-2024Y—抑制率；A—單獨T細(xì)胞（刺激）CFSE子代細(xì)胞的百分比；C—與人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)T細(xì)胞（刺激）CFSE子代細(xì)胞百分比。T/LNSI007-2024（規(guī)范性）抑制T細(xì)胞分泌檢測胞內(nèi)因子染色法E.1儀器和設(shè)備E.1.1血球計數(shù)板。E.1.2倒置顯微鏡。E.1.3水平離心機。E.1.4流式細(xì)胞儀。E.2試劑本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實驗用水均為GB/T6682規(guī)定的一級水。E.2.1磷酸鹽緩沖液：pH為7.4。E.2.2消化酶。E.2.3臺盼藍(lán)染液：使用時，用磷酸鹽緩沖液（E.2.1）稀釋至0.4%（質(zhì)量濃度）。E.2.4佛波酯（PMA）。E.2.5淋巴細(xì)胞分離液。E.2.6抗體（如：anti-IFN-γ抗體、anti-TNF-α抗體）。E.2.7布雷非德菌素A（BFA）。E.2.8離子霉素。E.2.9皂苷（Saponin）。E.2.104%多聚甲醛。E.3檢測步驟E.3.1T細(xì)胞分離利用淋巴細(xì)胞分離液（E.2.5），分離外周血PBMC，用適量無菌磷酸鹽緩沖液（E.2.1）使用水平離心機離心（E.1.3）洗滌2次。然后，孵育抗體（E.2.6）；用適量無菌磷酸鹽緩沖液（E.2.1）使用水平離心機離心（E.1.3）洗滌2次。重懸細(xì)胞至細(xì)胞濃度為5×107細(xì)胞/mL，40μm濾網(wǎng)轉(zhuǎn)移到流式管中，按流式細(xì)胞儀應(yīng)用手冊上機分選。T/LNSI007-2024E.3.2T細(xì)胞與人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)E.3.2.1T細(xì)胞炎癥因子分泌根據(jù)附錄A方法測定，使用血球計數(shù)板（E.1.1）及顯微鏡（E.1.2）計算T細(xì)胞懸液濃度，按1×106細(xì)胞/mL接種培養(yǎng)，培養(yǎng)48h。結(jié)束培養(yǎng)前4h~6h往培養(yǎng)體系添加50ng/mL佛波酯（E.2.4）、1布雷非德菌素A（E.2.7）和1μg/mL離子霉素（E.2.8用于檢測IFN-γ陽性的T細(xì)胞比例A1，和TNF-α陽性的T細(xì)胞比例A2。E.3.2.2人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞抑制T細(xì)胞炎癥因子分泌利用消化酶消化人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞并制備成單細(xì)胞懸液，根據(jù)附錄A方法測定，使用血球計數(shù)板（E.1.1）及顯微鏡（E.1.2）計算T細(xì)胞與人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞懸液活細(xì)胞濃度，人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞按2×105細(xì)胞/mL接種，細(xì)胞貼壁后，將T細(xì)胞按5:1（T細(xì)胞：人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞）的比例進(jìn)行共培養(yǎng)，培養(yǎng)48h。結(jié)束培養(yǎng)前4h~6h往培養(yǎng)體系添加50ng/mL佛波酯（E.2.4）、10μg/mL布雷非德菌素A（E.2.7）和1μg/mL離子霉素（E.2.8），用于檢測人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞抑制IFN-γ陽性的T細(xì)胞比例C1，和TNF-α陽性的T細(xì)胞比例C2。E.3.3T細(xì)胞收集并標(biāo)記收集培養(yǎng)后的T細(xì)胞，用適量無菌磷酸鹽緩沖液（E.2.1）使用水平離心機離心（E.1.3）洗滌2次，4%多聚甲醛（E.2.10）固定細(xì)胞，用適量無菌磷酸鹽緩沖液（E.2.1）使用水平離心機離心（E.1.3）洗滌1次，0.1%~0.2%皂苷（E.2.9）處理穿膜，孵育IFN-γ和TNF-α抗體，用適量無菌磷酸鹽緩沖液（E.2.1）使用水平離心機離心（E.1.3）洗滌1次，通過40μm濾網(wǎng)轉(zhuǎn)移到流式管中，按流式細(xì)胞儀應(yīng)用手冊上機檢測。E.3.4圈門設(shè)定原則首先根據(jù)細(xì)胞大小和顆粒度設(shè)門圈出目標(biāo)細(xì)胞分群1，排除死細(xì)胞和其他雜細(xì)胞，然后根據(jù)Isotype組熒光強度，在分群1的基礎(chǔ)上畫出IFN-γ陽性的細(xì)胞群2和TNF-α陽性的細(xì)胞群3，排除沒有被熒光抗體標(biāo)記的陰性細(xì)胞。E.4結(jié)果分析得到的檢測結(jié)果用軟件綜合分析，具體參考其軟件使用說明。并計算人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞對T細(xì)胞分泌IFN-γ、TNF-α的抑制率。T/LNSI007-2024抑制率按式（E.1）和式（E.2）進(jìn)行計算：IFN-γ抑制率=（A1―C1）/A1×100％......................（E.1）式中：A1—單獨T細(xì)胞的IFN-γ陽性率；C1—與人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)T細(xì)胞的IFN-γ陽性率。TNF-α抑制率=（A2―C2）/A2×100％.....................（A.1）式中：A2—單獨T細(xì)胞的TNF-α陽性率；C2—與人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)T細(xì)胞的TNF-α陽性率。T/LNSI007-2024（規(guī)范性）成骨分化檢測茜素紅S染色法F.1儀器和設(shè)備F.1.1血球計數(shù)板。F.1.2明視場顯微鏡。F.1.3水平離心機。F.2試劑本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實驗用水均為GB/T6682規(guī)定的一級水。F.2.1磷酸鹽緩沖液：pH為7.4。F.2.2消化酶。F.2.3臺盼藍(lán)染液：使用時，用磷酸鹽緩沖液（F.2.1）稀釋至0.4%（質(zhì)量濃度）。F.2.4成骨誘導(dǎo)液。F.2.5茜素紅S染色試劑盒。F.3檢測步驟F.3.1細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備F.3.1.1細(xì)胞消化使用水平離心機（F.1.3）離心收集細(xì)胞于離心管中，用無菌磷酸鹽緩沖液輕輕重懸細(xì)胞，避免形成氣泡或者殘留細(xì)胞團塊。F.3.1.2細(xì)胞計數(shù)根據(jù)附錄A方法測定，使用血球計數(shù)板（F.1.1）及明視場顯微鏡（F.1.2）計算細(xì)胞懸液活細(xì)胞濃度。F.3.2細(xì)胞接種并誘導(dǎo)細(xì)胞接種方式、密度及誘導(dǎo)步驟均遵循成骨誘導(dǎo)液產(chǎn)品說明書，誘導(dǎo)14d~21d。F.3.3鈣結(jié)節(jié)染色T/LNSI007-2024鈣結(jié)節(jié)染色根據(jù)茜素紅S染色試劑盒說明書進(jìn)行。F.4結(jié)果分析顯微鏡下可見散在大量橘紅色的鈣結(jié)節(jié)。T/LNSI007-2024（規(guī)范性）成脂分化檢測油紅O染色法G.1儀器和設(shè)備G.1.1血球計數(shù)板。G.1.2明視場顯微鏡。G.1.3水平離心機。G.2試劑本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實驗用水均為GB/T6682規(guī)定的一級水。G.2.1