DB34T 2167-2014 油菜黑脛病菌鑒定方法

DB34DB34/T2167—2014油菜黑脛病菌鑒定方法DetectionandidentificationofLeptosphaeriabiglobosa(Desm.)Ces.etDeNot.安徽省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I1GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗油菜黑脛病菌Leptosphaeriabiglobosa(Desm)Ces.&deNot.屬真菌界(Fungi)，子囊菌門鑒定依據(jù)：以油菜黑脛病為害癥狀、病菌形態(tài)），瓊脂培養(yǎng)基（Agar），馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA-potatodextroseAgar），馬鈴薯葡萄糖2油菜黑脛病菌（Leptosphaeriabiglobosa(Desm)Ces.&deNot.）菌株；油菜莖基潰瘍病菌——子葉/葉片癥狀：黑色壞死斑點（由致病力弱的菌株造成）；或灰白色病斑（由致病力強的菌），在衰老菌絲體上可觀察到黑色小粒點（為分生孢子器），（見附錄D，圖1、2、3、4）；分生孢子器球2個油球，分生孢子大小3～5.5μm×1.3～2.7μm（見附錄D，圖5）。子囊殼呈球形，黑色，有孔口，直徑360μm～500μm；子囊棍棒形，內(nèi)有8個子囊孢子，（見附錄D，圖6）；子囊孢子長橢圓形，具5～8個隔膜，黃褐色，大?。?0～，（PCR擴增出與L.biglobosa陽性對照分子量大小（440bp）一致的單一明亮條帶，判定為油菜黑選取形態(tài)特征與L.biglobosa形態(tài)特征相符且PCR檢測陽性的分離菌株，在V8基上培養(yǎng)獲得分生孢子，用無菌水配置成濃度為107/mL分生孢子懸浮液。選取健康感病油菜品種播分生孢子懸浮液。將接種過的幼苗保濕48小時（約100％相對濕度），期間如有新生真葉出現(xiàn)，3將其剪去，以延緩子葉衰老的時間。在接種后7～14d觀察子葉發(fā)病情況。子葉侵染癥狀的主要特），對接種發(fā)病的子葉再做病原菌分離、培養(yǎng)，觀察是否與L.biglobosa一致的形態(tài)特征，并對分離符合L.biglobosa為害癥狀，菌落培養(yǎng)特性和病菌形態(tài)學(xué)特征與L.biglobosa相符，PCR擴增出與L.biglobosa陽性對照分子量大?。?40bp）一致的單一明亮條帶，且致病性測試為陽性的分離物，判定為油菜黑脛病菌L.biglobosa。分離鑒定的菌株應(yīng)妥善保存，菌株在PDA平板培養(yǎng)后可于4℃冰箱保存，每90d定期繼代，或?qū)в芯z的培養(yǎng)基塊轉(zhuǎn)入30%滅菌甘油中于4A.2馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potatodextroseA.3馬鈴薯葡萄糖肉（potatodextrosebroth，PDB）液體培56將采集疑似癥狀的植株樣本用自來水洗凈，晾干組織表面的水；從油菜植株的病斑處切取大小約表面消毒約2min，無菌水清洗2～3次，用無菌濾紙吸干表面多將表面消毒后的油菜種子（或油菜籽）或植物組織樣品置瓊脂培養(yǎng)基上，100mg/L鏈霉素和50mg/L氨芐青霉素）上，20℃培養(yǎng)5～7d，挑取菌絲體邊緣少量菌絲轉(zhuǎn)移至不含抗生素的PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3～6d，再次挑取邊緣菌絲接種至PDA培養(yǎng)基，直7圖D.6假囊殼8）；％（-HCl、1.4MNaCl、20mMEDTA、1%β-巰基乙醇。1)將小片（約2mm×2mm）植物病斑組織置1.5ml離心管中，預(yù)先冷凍（-20℃)數(shù)小時后，進行低溫冷凍干燥處理(﹥24h2)使用與離心管匹配的金屬（或塑料棒）將干燥后的樣品充分碾碎；將通過形態(tài)鑒定初步篩選的疑似L.biglobosa菌株接種至PDB（potatodextrosebroth培養(yǎng)基中，水平振蕩培養(yǎng)（23℃,180rpm）10d，14000×g離心5min收集菌絲，提取菌絲體DNA。(1)將菌絲進行低溫冷凍干燥處理(﹥24h），保存在-20℃待用；9LmacB(L.biglobosaforward對照LmacA(L.maculansforwardprimer:5’-CTTGCCCACCAATTGGATC取5μL擴增產(chǎn)物與1μL的樣品緩沖液(loadingbuffer)混勻，在1%瓊脂糖凝膠(含0.1%EB)中電泳(電泳緩沖液1×TAE,電壓120V,時間1h),在凝膠成像系統(tǒng)中觀察，記