IF（免疫熒光）實驗寶典白皮書

cellsignaling·TECHNOLOGY22在IF實驗中，通常采用兩種方式來檢測目標蛋白：一是直接使用與熒光基團共價偶聯(lián)的所需材料冰凍組織22制備細胞或組織?組織制備細胞或組織?組織?鋪板條件?優(yōu)化細胞密度和改善細胞健康狀態(tài)1設計實驗?實驗對照?實驗對照?多重分析 4?固定劑的選擇?固定孵育時間通透化處理?去污劑或醇類的選擇?封閉劑的選擇?封閉劑的選擇免疫染色?一抗稀釋?清洗和二抗孵育678899數(shù)據(jù)收集和成像33一抗是IF實驗的關鍵成分，其性能可直接影響到數(shù)據(jù)質量。能用于免疫印跡法(WB)檢測特異性條驗證特異性以避免誤導性IF結果?充分保證其在IF分析中也具備相應良好表疑難排解提示疑難排解提示44行藥物學處理、添加胞外配體來調控信號轉導通平行的，這樣固定和后續(xù)步驟可以同時進行。采評估抗體性能時所采用的對照方式。其中一些可敲除細胞系以驗證靶標特異性一種異構體，還是能識別兩種異構體，還是已知對目標靶標的表達呈陽性或陰性的細胞?通過調節(jié)靶標磷酸化狀態(tài)來確認磷酸化特異性(C)實驗擾動分析可確定某種抗體對PTM是否具有特異性。55?和?抗原抗原熒光基團酪胺激活的酪胺組織/細胞組織多重操作步驟連續(xù)染色每個靶標使用不同的宿主種類或同位素否是是信號擴增無12取決于靶標數(shù)量注取決于偶聯(lián)抗體的可用性；66IF-IC操作流程的最后一步是在熒光顯微鏡下觀察已固定和已染色細胞的成像?？紤]到體材料上進行細胞鋪板（從永生化細胞系中傳代培養(yǎng)，或從原代細胞中分離）。典型的載體形式包括玻璃底細胞培養(yǎng)皿、使用聚賴氨酸和/或細胞外基質成分制成的玻璃蓋玻片（保存在塑料培養(yǎng)皿內，支持貼壁式細胞培養(yǎng)）、市面上可用于顯微鏡的玻片底多孔顯微鏡上以低放大倍數(shù)檢測細胞應激跡象（比如多核細胞），確保您的細胞始終保持健康狀態(tài)。此外，還要確保細胞密度對相應細在CST，我們會檢測各種各樣的固定和通透化條件，努力發(fā)現(xiàn)有助于每種抗體產(chǎn)生最佳信號的條件組合。樣本的固定和通透化步驟十分關鍵，決定著實驗的成敗。理想的固定劑可以使樣疑難排解提示疑難排解提示針對懸浮生長細胞系的IF操作方法有二：一固定步驟，然后低速離心至載玻片上進行后續(xù)染色步驟；二是先在懸浮液中進行固定和染色步驟，離心洗脫，然后用移液管移至77經(jīng)新鮮冰凍并在冷凍箱內切片的IF-F樣本現(xiàn)可使用固定劑進行處理?；蛘撸M織樣本也可首先通過穿心灌注、隨后固定、低后再進行石蠟包埋和切片。在抗體孵育之前，必須對切片進行抗原/表位修復步驟，即使用二甲苯脫蠟并用加熱或微波爐進位，同時還利于抗體識別并標記相應靶標?？焖賹⑴囵B(yǎng)介質更（見下文），而最佳的固定方法取決于所使用的甲醛、福爾馬林（由溶解甲醛和較低比例的甲醇混合而成）和戊二醛等醛基固定劑都是十分常用的固定劑。針對大多數(shù)應、形成交聯(lián)，從而穩(wěn)定和固化樣本。交聯(lián)程度取決于多種條件（見下文）。醛類在交聯(lián)質膜、固定可溶性蛋白方面的性能引發(fā)脫水/變性的固定劑會移除細胞大分子周圍的水，導致在原位變性和沉淀。靶蛋白變性可能會將通常隱藏的表位暴露出來，因此該方法對某些抗體而言存在一定優(yōu)勢。(F)然而，脫水性固定劑不太適用于可溶性靶標和修飾特異性抗體，比如磷交聯(lián)程度及IF信號保存情況取決于固定時間。在接下來的實驗中，保持甲醛濃度為4%，而對固定時長作出了改變。以熒光號最佳。當固定不足該時長（僅5分鐘）時，出現(xiàn)信號移位。醇或IF甲醇-通透化），則需要根據(jù)這些抗體的最佳條件確定它們的使用優(yōu)先順序。首先進行一次小型檢測，比較不同的操作步驟，可能會發(fā)現(xiàn)一些有益信息，為后續(xù)開展大型實驗疑難排解提示疑難排解提示定期更換陳舊的醛類固定劑，制備新鮮的稀釋液；陳舊溶液88如果使用交聯(lián)性固定劑，質膜將仍保持完整，抗體無法檢測胞），??、皂苷、洋地黃皂苷和移除了細胞膜中的多種分子，形成了各種“孔道”，使得抗體得以進入胞內。或者，也可在固定步驟之后使用乙醇或甲醇進行醇類通透化處理。該方法將交聯(lián)性固定劑的快速固定性能和醇類的中度變性結合了起來，可增強某些靶標（尤其是與細胞器或細胞骨架相關的靶標）的信號強度。同固定一樣，最佳通透化方法也根據(jù)所使用的抗體來調整確定。甲醇通透化處理可封閉步驟可減少一抗和二抗與非靶標位點進行非特異性結合時所產(chǎn)生的本底信號。理想情況是，封閉劑將占據(jù)樣本中的“黏性”位點，比如暴露的帶電性或疏水性蛋白表面，同時不會干擾一抗/二抗識別靶表位，從而盡可能提高信噪比整；請參見產(chǎn)品說明書中的建議。我們最常建議使用的是在??本之間產(chǎn)生非特異的、基于電荷的相互作用?；旧?，選擇經(jīng)測試和批準可適用于所選應用的高質量抗體，可在封閉操疑難排解提示疑難排解提示苷酸(NADH)/煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、黃素和黃比較使用/未使用抗體/熒光基團的信號強度有何差異。IF標準IF甲醇-通透化99請務必按照建議的稀釋比例使用抗體，以便獲得較高的信噪比(S/N)。一方面，如果抗體的使用濃度過低，會導致熒光信號十分模細胞系進行滴定測試，以發(fā)現(xiàn)既能提供最佳信號又能最大程度降低本底染色的理想濃度，從而為您提供最佳建議。下圖為某種抗體雖然前一步已對樣本作封閉處理，但抗體通常還是會在含蛋白載體（牛血清白蛋白BSA）的稀釋緩沖液中被稀釋，然后再應用到樣育時長和溫度條件的相關性。從圖中可以看出，在建議孵育條件（4°C/過夜）下可獲得最佳信號強度；而縮短孵育時間、提高溫度信號過低固定之后，在一抗和二抗孵育和/或復染色步驟之間務必進行徹底清洗，這是降低背景、提高S/N的關鍵。經(jīng)IF驗證的抗體，其抗原結合區(qū)域對靶表位具有較高的親合力；但其他區(qū)域可能存在程度較低的親和力，還可能發(fā)生非特異性相互作用，最終導致背景升IF-IC檢測是研究亞細胞定位變化情況的理想方法，因為它可以?????），??????????可能原因按照經(jīng)嚴格測試的操作步驟進行一抗孵育，才能獲得一致、可靠原因以未染色樣本為對照，檢測自發(fā)熒光程度。請用久了的固定劑可能會出現(xiàn)自發(fā)熒光；更換陳舊甲醛，制備新?????