DB34T 2071-2014 雜交玉米及親本真實(shí)性鑒定DNA分析方法

DB34DB34/T2071—2014雜交玉米及親本真實(shí)性鑒定DNA分析方法IdentificationofgenuinenessofhybridcornanditsparentsusingDNAanalysismethod安徽省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I1GB/T3543.2農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程扦樣GB/T3543.4農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程發(fā)芽GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)5.1僅使用分析純試劑和符合GB/T6682溶解于800mL水中，用鹽酸（HCl）調(diào)pH至8.0，加水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃)條）：），5.150.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉溶液（EDTA-Na2pH8.0稱取185.16十六烷基三甲基溴化銨提取液（CTAB81.7g氯化鈉和20苯氰（XyleneCyanoleFF）、2mL36.2臺式高速冷凍離心機(jī)：最大離心力≥10,000g，溫控范圍最-10℃~40℃。分別從受檢樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品中隨機(jī)抽取5粒種子或單株，根據(jù)實(shí)際情況從以下兩種方法中選擇任移入2.0mL離心管；每管加入700μL65℃預(yù)熱的CTAB提取液后離心15min后，吸取上清液至一新離心管，再加入等體積預(yù)冷的異丙醇，顛倒離心管數(shù)次，在-20℃放置30min；4℃,12,000rpm離心10min，棄上清；加入70％乙醇，旋轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，棄去乙4MgCl2Tag酶PCR模板-*-*-*-*PCR產(chǎn)物采用6％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（見附錄B）或毛品中具相同帶型的個體所占比例，若在該位點(diǎn)具有相按7.5的方法分別統(tǒng)計(jì)受檢樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品——疑似差異位點(diǎn)數(shù)與差異位點(diǎn)數(shù)之和≤1，判定為近似或極近似品種。5phi056ACTTGCTTGCCTGCCGTTACphi011GCACACACACAGGACGACAGTbnlg125GGGACAAAAGAAGAAGCAGAGGAAATGGGACAGAGACAGACumc1551CACCGGAACACCTTCTTACAGTTTCGAAACCTTCTCGTGATGAGCumc2105ACATACATAGGCTCCCTTTTTCCGTCCCGTGACACTCTCTTTCTCTphi053CTGCCTCTCAGATTCAGAGATTGACAACCCAACGTACTCCGGCAGphi072ACCGTGCATGATTAATTTCTCCAGCCTTGACAGCGCGCAAATGGATTGAACTbnlg2162umc1705ATCTCACGTACGGTAATGCAGACACATGACCTGATAAACCCTCCphi085AGCAGAACGGCAAGGGCTACTTTTGGCACACCACGACGAbnlg107GCAACTAGAAGTAGATGGCTTGTTATCAACAACAAGTGGCTGGCTAGGGTGmmc0241TATATCCGTGCATTTACGTTTCATCGCTTGTCTGTCGAphi034TAGCGACAGGATGGCCTCTTCTphi328175bnlg2235ATCCGGAGACACATTCTTGGphi080umc2084ATCGCGACGAGTTAATTCAAACATTACGATGTCTTCAGTGTGACAC6phi065AGGGACAAATACGTGGAGACACAGCGATCTGCACAAAGTGGAGTumc1380CTGCTGATGTCTGGAAGAACCCTAGCATCATGCCAGCAGGTTTTumc1196CGTGCTACTACTGCTACAAAGTCGTTCGTGTCTTCCGAAACTbnlg1007ATGTGCTGTGCCTGCCTCphi308707phi96100AGGAGGACCCCAACTCCTGTTGCACGAGCCATCGTATbnlg1520ACAGCTGCGTAGCTTCTTCCumc2101CCCGGCTAGAGCTATAAAGCAACTAGCTAGTTTGGTGCGTGGTGbnlg197phi074CCCAATTGCAACAACAATCCTGTGGCTCAGTGATGGCAGAAAbnlg2291phi113CACAACACATCCAGTGACCAGAumc1153CAGCATCTATAGCTTGCTTGCATGGGTTTTGTTTGTTTGTTTGTphi126GAGCTTGCATATTTCTTGTGGAphi031GCAACAGGTTACATGAGCTGACCCAGCGTGCTGTTCCAGTAGTTphi112TGCCCTGCAGGTTCACATTGAGGAGTACGCTTGGATGCTCTTCumc1125CGTCCGACATCTTGCTTTTCTATTTTACTTCTCAGCGGTAGATCbnlg2181bnlg162ACTAGCAGCAGTAAAACCTAATAAAGGGACAAGTAGCTAGCAGTCATTTGCAGT7bnlg244GATGCTACTACTGGTCTAGTCCAGACTCCTCCACTCATCAGCCTTGAumc1277TTTGAGAACGGAAGCAAGTACTACCAACCAACCACTCCCTTTTTAGphi062著絲點(diǎn)(10.04)ATGCCATGCGTTCGCTCTGTATCumc1061AGCAGGAGTACCCATGAAAGTCCTATCACAGCACGAAGCGATAGA8玻璃板處理：取清洗干凈的長短玻璃板，用去離子水沖洗干凈后晾干，用無水乙醇分別擦洗兩遍，晾干；在長板涂0.5mL親和硅烷工作液，短板（帶凹槽）涂0.5mL玻璃板組裝：待玻璃板徹底干燥后使用0.4mm均厚的墊片組裝凝膠膠膜夾層，注意墊片與玻璃灌膠：在60mL6％PAGE膠中加入40μLTEMED和400μL10％的過硫酸銨溶液，混勻后立即待膠凝固后，將玻璃板安裝到電泳槽上，在正極槽和負(fù)極槽中分別加入1×TBE用移液器吹吸加樣槽，清除氣泡和雜質(zhì)，將梳齒朝內(nèi)插入梳子形成加樣孔。每孔加樣5μL恒功率電泳至指示帶（二甲苯氰）到達(dá)膠板的中部，電泳結(jié)束，關(guān)閉電將膠板浸入固定液，置于搖床上搖動固定5mi9將膠板移入染色液，搖動染色5min將膠板移入ddH2O中搖動45s，棄去ddH等體積混合不同熒光標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物，混勻后從混合液中吸取1L加入到DNA板孔中。板中各孔分別加入0.1L分子量內(nèi)標(biāo)和8.9L去離子甲酰胺。將樣品在PCR儀上95℃打開DNA分析儀，檢查儀器工作狀態(tài)。更換緩沖液，灌膠。將裝有樣品的微孔板置放于樣品架基創(chuàng)建電泳板，在電泳板信息文件中輸入樣品板編號、各板孔對應(yīng)的樣品編號、電DB34/T2071—2014phi080如圖D.2(上),為熒光引物phi011在標(biāo)準(zhǔn)對照和受檢樣品各單株都擴(kuò)增出224bp的電泳譜帶如圖D.2(下),為熒光引物bnlg125在標(biāo)準(zhǔn)對照各單株中擴(kuò)增出310bp的譜帶(箭頭所示),在受檢樣品各單株中擴(kuò)增出280bp的譜帶(箭頭所示標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)對照受檢樣品圖D.2標(biāo)準(zhǔn)對照和受檢樣品間的毛細(xì)管電泳D.3非純位點(diǎn)的判讀如圖D.3(上),引物bnlg053在標(biāo)準(zhǔn)對照的全部20個單株中僅擴(kuò)增出1種帶型，受檢樣品除了擴(kuò)增出與標(biāo)準(zhǔn)對照相同的帶型外，還擴(kuò)增出新的帶型，其中具與標(biāo)準(zhǔn)對照相同的帶型的8個單株(箭頭所示),占受檢樣品20各單株的個體比例>20%,因此，該位點(diǎn)記為疑似相同位點(diǎn)。如圖D.3(下),引物umc2105在標(biāo)