分子生物學(xué)第五章2

第四節(jié)轉(zhuǎn)錄的機制轉(zhuǎn)錄是由DNA指導(dǎo)的RNA合成過程，可分為起始(initiation)、延伸(elongation)和終止(termination)三個階段。對轉(zhuǎn)錄的調(diào)控主要發(fā)生在起始和終止階段，其中轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控是轉(zhuǎn)錄過程乃至整個基因表達過程的中心環(huán)節(jié)。一、轉(zhuǎn)錄的起始轉(zhuǎn)錄的起始是RNA聚合酶識別啟動子并與之結(jié)合從而啟動RNA合成的過程。轉(zhuǎn)錄的起始過程十分復(fù)雜，特別是真核生物，需要多種輔助因子參與。Activationofgenestructure↓Initiationoftranscription↓Processingthetranscript↓Transporttocytoplasm

↓TranslationofmRNA1.原核生物轉(zhuǎn)錄的起始菌體細(xì)胞中，大部分的RNA聚合酶（核心酶）與DNA分子松弛結(jié)合，形成松弛型復(fù)合物，并且核心酶對啟動子無特殊的親和力。σ因子與核心酶結(jié)合形成全酶以后，對啟動子的親和力大大提高，形成緊密型復(fù)合物。原核生物RNA聚合酶中的σ因子起著識別啟動子的作用。全酶在很長的基因組中尋找約60bp的啟動子是一個很復(fù)雜的過程。目前有三種模式解釋這種機制：隨機擴散模式序列置換模式滑動模式RNA聚合酶與啟動子－35區(qū)結(jié)合后，與DNA形成封閉型啟動子復(fù)合物，然后－10區(qū)左右的DNA發(fā)生熔解，形成12～17bp的單鏈區(qū)，轉(zhuǎn)變?yōu)殚_放型啟動子復(fù)合物。二者皆為二元復(fù)合物，此時RNA聚合酶大約與75bp的DNA相接觸。在開放型啟動子起始復(fù)合物中，RNA聚合酶的起始位點和延伸位點被相應(yīng)的核苷酸前體所占據(jù)。在β亞基的催化下，起始位點和延伸位點上的核苷酸形成第一個磷酸二酯鍵，從而形成一個三元復(fù)合物。σ因子從三元復(fù)合物上解離下來，形成起始延伸復(fù)合物（initialelongationcomplex），此時與大約50bp（－35～＋20）的DNA相互接觸。原核生物轉(zhuǎn)錄的起始1.全酶與模板的DNA接觸，生成非專一的,不穩(wěn)定的復(fù)合物在模板上移動；2.起始識別：全酶與－35序列結(jié)合，產(chǎn)生封閉的酶-啟動子二元復(fù)合物（closedbinarycomplex）；3.全酶緊密地結(jié)合在-10序列處，模板DNA局部變性，形成開放的啟動子二元復(fù)合體；4.第一個rNTP轉(zhuǎn)錄開始,形成酶-啟動子-rNTP三元復(fù)合體（ternarycomplex）。5.當(dāng)RNA長約9bp形成穩(wěn)定的DNA-酶-RNA復(fù)合物、σ因子釋放，結(jié)束起始，進入延伸階段。σ因子釋放是起始與延伸的分水嶺。2.真核生物轉(zhuǎn)錄的起始RNA聚合酶Ⅰ的轉(zhuǎn)錄起始RNA聚合酶Ⅰ起始轉(zhuǎn)錄需要兩種輔助因子UBF1和SL1的參與。

UBF1可特異地識別核心啟動子和上游調(diào)控元件（UpstreamControlElement）中富含GC對的區(qū)域。在UBF1和DNA結(jié)合以后，SL1才可結(jié)合上來。SL1類似于原核生物的σ因子，它可與啟動子特異地結(jié)合，并保證RNA聚合酶Ⅰ定位于轉(zhuǎn)錄起始位點。當(dāng)兩種輔助因子與DNA結(jié)合以后，RNA聚合酶Ⅰ才能與核心啟動子結(jié)合，從而起始轉(zhuǎn)錄。RNA聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄起始RNA聚合酶Ⅱ自身不能起始轉(zhuǎn)錄，必須在其他輔助因子的作用下，RNA聚合酶Ⅱ和其他輔助因子組成一個基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄裝置（basaltranscriptionapparatus），起始真核生物Ⅱ類基因的轉(zhuǎn)錄。RNA聚合酶Ⅱ可以起始轉(zhuǎn)錄的最短的啟動子序列稱為通用啟動子（genericpromoter），它可以在任何細(xì)胞內(nèi)表達而無組織特異性。能使通用啟動子起始轉(zhuǎn)錄所需的輔助因子，稱為基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子（basaltranscriptionfactor，TFⅡX）。通用啟動子起始轉(zhuǎn)錄的效率很低，需要上游的調(diào)控序列及相應(yīng)的輔助因子來增強其轉(zhuǎn)錄的水平。RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄起始的過程需要很多輔助因子的參與，它們按一定的順序與DNA結(jié)合形成復(fù)合物。經(jīng)足跡法可證明各種輔助因子與DNA結(jié)合的先后次序。識別TATA框及其上游序列的輔助因子稱為TFⅡD。TFⅡD由TBP（TATA-bindingprotein，TBP）及TBP相關(guān)因子（TBP-associatedfactors，TAFs）兩種組分組成。TBP識別TATA框。含不同TAFs的TFⅡD可以識別不同的啟動子。人類Ⅱ型啟動子的轉(zhuǎn)錄因子 因子 分子量 功能 RNAPolⅡ≥10K 依賴模板合成RNA TFⅡA 12,19,35K穩(wěn)定TFⅡD和DNA的結(jié)合，激活TBP亞基 TFⅡB 33K 結(jié)合模板鏈（-10～+10），起始PolⅡ結(jié)合，和TFⅡE/F

相互作用 TFⅡD (TBP,30K)TBP亞基識別TATA，將聚合酶組入復(fù)合體中，TAFs識別特殊啟動子 TFⅡE 34K(β)結(jié)合在PolⅡ的前部，使復(fù)合體的保護區(qū)延伸到下游

57K(α)TFⅡF 38,74K 大亞基具解旋酶活性（RAP74）,小亞基和PolⅡ結(jié)合，介導(dǎo)其加入復(fù)合體 TFⅡH 具激酶活性，可以磷酸化PolⅡC端的CTD，使PolⅡ逸出，延伸 TFⅡI 120K 識別Inr，起始TFⅡF/D結(jié)合 TFⅡJ 在TFⅡF后加入復(fù)合體，不改變DNA的結(jié)合方式 TFⅡS RNA合成延伸 轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物形成的基本過程為TBP及TAFs先與TATA框附近的區(qū)域結(jié)合，而后依次為TAⅡA、TAⅡB、TAⅡF和RNA聚合酶、TAⅡE、TAⅡH和TAⅡJ。TBP與DNA的小溝結(jié)合，這和其他的蛋白因子不同，目前所知的所有蛋白質(zhì)因子都是與DNA的大溝結(jié)合。TBP是唯一的一個與DNA特異結(jié)合的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子。TBPinTFIIDbindstotheTATAboxTFIIAandTFIIBarerecruitedwithTFIIBbindingtotheBRERNAPolII-TFIIFcomplexisthenrecruitedTFIIEandTFIIHthenbindupstreamofPolIItoformthepre-initiationcomplexPromotermeltingusingenergyfromATPhydrolysisbyTFIIH)PromoterescapesafterthephosphorylationoftheCTDtail經(jīng)分析，TBP的晶體結(jié)構(gòu)呈馬鞍狀,內(nèi)面與DNA結(jié)合，外面與其他的蛋白因子相互作用。TFⅡD具有識別TATA框的作用，TFⅡD結(jié)合上來以后形成的復(fù)合物可保護－45～－10的區(qū)域。TFⅡA由幾個亞基組成，可以激活TBP。它的結(jié)合可使復(fù)合物的保護區(qū)域擴展。TFⅡB與TATA框的下游結(jié)合，可使復(fù)合物的保護區(qū)域擴展至＋10。TFⅡF由兩個亞基組成，大亞基具有依賴ATP的DNA螺旋酶的活性，可能參與DNA雙鏈的熔解。小亞基與RNA聚合酶緊密結(jié)合。TFⅡF的功能是將RNA聚合酶Ⅱ于其他的輔助因子組成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。TFⅡF的結(jié)合可使復(fù)合物的保護區(qū)域擴展至＋30。TFIIE由兩個亞基組成，分別為34Kda和56Kda，兩個亞基對RNA聚合酶的結(jié)合和轉(zhuǎn)錄激活都是必需的。TFⅡH和TFⅡJ與復(fù)合物的結(jié)合并不改變復(fù)合物與DNA間的作用模式。

TFⅡH具有激酶的活性，可使RNA聚合酶Ⅱ的CTD尾磷酸化，結(jié)果可使聚合酶與其他的轉(zhuǎn)錄起始因子解離，從而得以進行轉(zhuǎn)錄的延伸。RNA聚合酶Ⅱ的起始過程類似于原核生物，先由RNA聚合酶和DNA形成封閉型復(fù)合物，DNA解鏈后形成開放型復(fù)合物。ATP可能與某些轉(zhuǎn)錄因子從復(fù)合物上解離有關(guān)。真核生物共計有20多種多肽分子參與RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄起始過程，形成的起始復(fù)合物十分龐大，總計在1000KDa以上。真核生物RNA聚合酶Ⅱ的啟動子結(jié)構(gòu)中還有其他的元件如CAAT框、GC框和八聚體元件。對各種元件的識別都需要特有的轉(zhuǎn)錄因子，如SP1可識別GC框、CAAT框由CTF家族的因子識別、識別八聚體元件的蛋白質(zhì)因子不止一種，在非淋巴細(xì)胞中為oct-1，而在淋巴細(xì)胞中為oct-2。至于這些元件的識別與轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物形成的關(guān)系，目前還不十分清楚。RNApolII催化的基因轉(zhuǎn)錄的全過程

RNA聚合酶Ⅲ轉(zhuǎn)錄的起始RNA聚合酶Ⅲ轉(zhuǎn)錄基因的啟動子有三類，其中有兩類屬于內(nèi)部啟動子。這兩類內(nèi)部啟動子轉(zhuǎn)錄的起始需要三種輔助因子TFⅢA、TFⅢB和TFⅢC的參與。TFⅢB含有TBP，是RNA聚合酶Ⅲ所需要的真正轉(zhuǎn)錄因子，其主要作用是使RNA聚合酶Ⅲ正確定位于啟動子上。而TFⅢA和TFⅢC屬于裝配因子，起協(xié)助TFⅢB與啟動子正確結(jié)合的作用。RNA聚合酶Ⅲ的第三類啟動子（snRNA）不是內(nèi)部啟動子，其結(jié)構(gòu)類似于RNA聚合酶Ⅱ的啟動子。RNA聚合酶Ⅲ對其TATA框的識別同樣依賴于TBP，但必須有其他RNA聚合酶Ⅲ的輔助因子共同作用，使RNA聚合酶Ⅲ在啟動子上正確定位。RNA聚合酶Ⅲ并沒有對啟動子特異序列的識別作用。它能正確地結(jié)合在轉(zhuǎn)錄起始點附近，全靠其他轉(zhuǎn)錄因子的作用。RNA聚合酶III可以在僅有TATA元件的情況下從上游啟動子起始snRNA基因的轉(zhuǎn)錄。在TATA元件上游，PSE元件和OCT元件的出現(xiàn)會大大增加基因的轉(zhuǎn)錄效率。結(jié)合在PSE和OCT元件上的蛋白因子之間會發(fā)生協(xié)同作用。TBP在三種RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄起始中均有相同的作用。在RNA聚合酶Ⅰ識別rRNA的啟動子并起始轉(zhuǎn)錄的過程中，TBP是SL1的組分，起定位RNA聚合酶Ⅰ的作用。在RNA聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄起始過程中，TBP可以識別TATA框，同樣起定位RNA聚合酶的作用。

RNA聚合酶Ⅲ的轉(zhuǎn)錄起始（包括內(nèi)部啟動子）也需要TBP。盡管TBP在不同的啟動子中與其他轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合物的方式不同，但功能都是一樣的，即起定位作用。所以TBP又稱為定位因子（positioningfactor）。二、轉(zhuǎn)錄的延伸轉(zhuǎn)錄的起始第一個涉及的問題是第一個堿基的選擇。在原核生物，起始轉(zhuǎn)錄的堿基距保守T為6～9個核苷酸，多為CAT模式，第一個堿基為A，這可能是由RNA聚合酶的空間結(jié)構(gòu)決定的，即結(jié)合部位與聚合活性部位間的距離決定了轉(zhuǎn)錄起始堿基與TATA框（結(jié)合位點）的距離。原核生物的RNA聚合酶中，催化RNA合成的可能是β亞基。在酶分子上有兩個核苷酸結(jié)合位點，一是起始核苷酸位點。二是延伸核苷酸位點。當(dāng)兩個位點都與模板互補的核苷酸結(jié)合后，第一個磷酸二酯鍵才能形成。轉(zhuǎn)錄起始后，σ因子解離下來，這時的核心酶既能夠與DNA結(jié)合，又能在DNA分子上滑動。真核生物是靠多種輔助因子的共同作用來維持這一狀態(tài)的。轉(zhuǎn)錄的延伸過程中，需要旋轉(zhuǎn)酶（gyrase）和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ（topoisomeraseⅠ）消除正超螺旋和負(fù)超螺旋。新形成的RNA鏈與DNA形成的雜交雙鏈很短，只有幾個堿基(<3bp)。RNA合成的速度約為每秒40個核苷酸，與蛋白質(zhì)合成的速度相近（15個氨基酸/秒），但比DNA復(fù)制的速度要慢得多。另外，RNA聚合酶在DNA分子上的運動不是勻速的。Transition

fromtheinitiationto

elongationinvolvesthePolIIenzymeshedding(擺脫)mostofitsinitiationfactors(GTFandmediators)andrecruitingotherfactors:(1)Elongationfactors:factorsthatstimulateelongation,suchasTFIISandhSPT5.(2)RNAprocessing(RNA加工)factors

RecruitedtotheC-terminaltailoftheCTDofRNAPIItophosphorylatethetailforelongationstimulation,proofreading,andRNAprocessinglikesplicingandpolyadenylation.RNAprocessingenzymesarerecruitedbythetailofpolymerase三、轉(zhuǎn)錄的終止

轉(zhuǎn)錄進行到終止子序列時，就進入了終止階段，包括新生RNA鏈的釋放及RNA聚合酶與DNA的解離。1.轉(zhuǎn)錄終止的機制原核生物的終止子有兩種，一種是不依賴ρ因子的終止子，一種是依賴ρ因子的終止子。在不依賴ρ因子的終止子中，轉(zhuǎn)錄的終止依靠終止子本身的結(jié)構(gòu)就足以使轉(zhuǎn)錄終止。ρ因子可以與新生RNA在終止子上游的某一處與RNA結(jié)合，這種結(jié)合可能需要某種特異的序列。ρ因子有依賴RNA的ATPase活性，RNA的長度要大于50nt，這說明ρ因子要與RNA結(jié)合。強終止子的結(jié)構(gòu)特點

(1)有回文結(jié)構(gòu)存在；（2）莖的區(qū)域富內(nèi)含G-C；

(3)強終止子3′端上有6個U；

以上結(jié)構(gòu)特點在終止中起何作用？ρ因子沿RNA鏈移動的速度比RNA聚合酶在DNA鏈上的移動速度快，聚合酶在終止子處的暫停給ρ因子趕上RNA聚合酶提供了機會。ρ因子可使轉(zhuǎn)錄泡的RNA-DNA解鏈，然后RNA聚合酶釋放，轉(zhuǎn)錄終止。在原核生物中，轉(zhuǎn)錄和翻譯是同時進行的，ρ因子的終止作用可因核糖體的存在而阻礙。RNA分子中的二級結(jié)構(gòu)也可阻止ρ因子的作用。真核生物同樣存在終止子的結(jié)構(gòu)在RNA聚合酶Ⅰ的終止過程中，需要一個輔助因子識別一個18bp的終止子序列。RNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ的終止子與原核生物不依賴ρ因子的終止子結(jié)構(gòu)類似，可能也具有類似的終止機制，終止可能靠RNA聚合酶本身來完成。2.抗終止作用抗終止作用（antitermination）是指RNA聚合酶閱讀通過終止子，從而使轉(zhuǎn)錄過程不能在終止子處終止的一種機制，是細(xì)菌操縱子和噬菌體基因表達調(diào)控的一種方式。抗終止作用首先發(fā)現(xiàn)于λ噬菌體。λ噬菌體可以通過兩種抗終止蛋白pN和pQ調(diào)控不同基因的表達。真核生物的轉(zhuǎn)錄和原核轉(zhuǎn)錄的不同點：(1)原核只有一種RNA聚合酶，而真核細(xì)胞有三種聚合酶；

(2)啟動子的結(jié)構(gòu)特點不同，真核有三種不同的啟動子和有關(guān)的元件；

(3)真核的轉(zhuǎn)錄有很多蛋白質(zhì)因子的介入。第五節(jié)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的后加工多數(shù)轉(zhuǎn)錄的初始產(chǎn)物并無生物學(xué)活性，必須經(jīng)過進一步的加工才有生物學(xué)活性，特別是對于真核生物轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的后加工更為重要。一、原核生物轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的后加工原核生物mRNA的壽命非常短，這是原核生物基因表達調(diào)控的一種手段。原核生物的mRNA不需要進一步的加工就可以具有生物學(xué)活性，作為翻譯的模板。通過比較成熟的rRNA和tRNA與其原初轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)原核生物rRNA和tRNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物存在著后加工過程。參與蛋白質(zhì)合成的tRNA和rRNA都不是最初的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(1)它們的5′端都是單磷酸，而原始的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5′應(yīng)是三磷酸；(2)分子比初始轉(zhuǎn)錄物??；(3)tRNA含有特殊的堿基，這些堿基只有通過一些化學(xué)修飾才可以得到。1.rRNA的后加工原核生物有三種rRNA（5S、16S和23S），其基因（rDNA）與tRNA的基因（tDNA）混在一起，排列在一個操縱子（rrn）中。大腸桿菌有7個這樣的操縱子。rrn操縱子有兩個啟動子，第一個啟動子p1位于16SrRNA序列上游300bp左右，可能是主要的啟動子；第二個啟動子p2位于p1下游110bp左右，該操縱子轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物為