文獻翻譯NUB1是加強蛋白降解的變異亨廷頓蛋白毒性抑制劑的確認

文獻題目：IdentificationofNUB1asasuppressorofmutantHuntingtintoxicityviaenhancedproteinclearanceNUB1是加強蛋白降解的變異亨廷頓蛋白毒性抑制劑的確認BoxunLu1,2,IsmaelAl-Ramahi3,4,AntonioValencia5,6,QiongWang2,FradaBerenshteyn2,HaidiYang2,TatianaGallego-Flores3,4,SalahIchcho2,ArnaudLacoste2,MarcHild2,MarianDiFiglia5,6,JuanBotas3,4&JamesPalacino2亨廷頓舞蹈癥是由HTT基因中的CAG重復序列異常延長引起的，導致變異HTT蛋白（mHTT）功能增強，產(chǎn)生毒性。減少mHTT蛋白的量被認為是介入治療的一種策略。我們進行了全基因組RNA干擾篩選以尋找調(diào)控mHTT數(shù)量的基因，并識別出13個基因。我們在一個亨廷頓舞蹈癥果蠅模型中對其中10個進行了體內(nèi)實驗，其中6個顯示出與體外篩選結(jié)果一致的活性。在這6個基因中，泛素樣蛋白1陰性調(diào)節(jié)酶（NUB1）過表達降低了神經(jīng)元模型中的mHTT含量，挽救了mHTT導致的細胞死亡。NUB1減少mHTT含量是通過加強多泛素化，以及蛋白酶體對mHTT蛋白的降解完成的。這一過程需要CUL3和泛素樣蛋白NEDD8（該蛋白為激活CUL3所必須）的參與。作為一種調(diào)節(jié)NUB1用于治療的可能的途徑，β-干擾素通過誘導NUB1降低了mHTT含量并挽救了神經(jīng)元毒性。因此，通過高通量篩選我們已經(jīng)識別出調(diào)節(jié)內(nèi)源性mHTT的基因，并證明了NUB1是干預性治療亨廷頓舞蹈癥的示范性切入點。亨廷頓舞蹈癥是一種常染色體顯性遺傳的不可治愈疾病，是一種神經(jīng)退行性疾病。該疾病病因是HTT基因外顯子1的CAG重復序列異常擴增，導致表達出含有超過最多36個谷氨酰胺多肽鏈的變異HTT蛋白（mHTT）。盡管野生型HTT蛋白具有神經(jīng)保護作用，毒性mHTT功能的增加，而不是野生型HTT蛋白活性的喪失，才是該疾病的主要病因。mHTT蛋白的表達導致神經(jīng)元死亡，機理是破壞諸如轉(zhuǎn)錄、軸突運輸、胞吞胞吐和鈣平衡等細胞活動。盡管這些活動的平衡對于細胞存活極為重要，病因背后的真相依然不甚明朗。HTT會發(fā)生翻譯后修飾，包括一些酶促反應，例如蛋白酶解、磷酸化或有泛素或泛素樣蛋白參與的修飾。盡管這些翻譯后修飾可能調(diào)控HTT的正常和病理性功能，究竟什么反應對涉及神經(jīng)毒性的通路有影響依然不得而知?？紤]到HTT蛋白生物學性質(zhì)的復雜性，根據(jù)已報道的證據(jù)我們猜測在諸多病理表型的上游某一點靶向定位HTT蛋白能夠減少下游環(huán)節(jié)的任何毒性。在一只可誘導mHTT老鼠中，關閉轉(zhuǎn)基因表達扭轉(zhuǎn)了神經(jīng)毒性和運動缺陷，而在哺乳動物模型中針對mHTT導入小發(fā)卡RNA（shRNA）或小干擾RNA（siRNA）緩解了神經(jīng)毒性和疾病相關的表型。因此，降低mHTT量來緩解任何下游毒性，從而可能提供一種有效的治療亨廷頓舞蹈癥的途徑，并且識別調(diào)控mHTT的通路是研究非常感興趣的。之前的篩選已經(jīng)研究了mHTT生物活性的不同方面，例如與之相互作用的蛋白、蛋白聚合調(diào)節(jié)物和負責降解蛋白的各種蛋白酶。雖然這些研究展現(xiàn)了mHTT生物活性的重要方面，但據(jù)我們所知尚沒有無偏篩選mHTT蛋白水平本身的基因調(diào)控物的報道。HTT復雜的生物活性對這樣的努力是一種阻礙。首先，因為存在蛋白降解和聚合所以對mHTT進行定量很復雜。其次，HTT的清除受到多種通路的調(diào)控，例如自吞噬和蛋白酶體。這樣的復雜因素使得在多種模型中確定HTT含量的變化成為必須要做的事。此外，RNAi篩選存在脫靶活性的風險。為了說明以上這些，我們設計了流程圖以最小化假陽性結(jié)果。我們首先使用了能檢測所有含有多聚谷氨酰胺重復序列的mHTTN-端片段的抗體，運用均相時間分辨熒光（HTRF）技術確認了靶點（補充圖1a）。我們確認了在不同物種模型體內(nèi)和體外實驗的結(jié)果，以識別進化上保守的位點。對于那些我們感興趣的特殊位點，我們在多種模型中用多種抗體進一步研究了不同種類的mHTT，確保mHTT含量的減少是顯著的。我們的篩選研究識別出13種mHTT含量的調(diào)控物，其中大多數(shù)顯示出與一個果蠅模型種的表型反應一致的結(jié)果。其中，我們的數(shù)據(jù)顯示NUB1（一種與HTT相互作用的蛋白）調(diào)控著mHTT的水平和毒性。并且我們進一步找到了一種由NUB1調(diào)控的mHTT含量的變化機制，這也證明了定位NUB1治療亨廷頓舞蹈癥的方法。據(jù)我們所知，本研究首次報道了尋找mHTT含量調(diào)控基因的全基因組篩選。NUB1和其他調(diào)控HTT含量的位點得到證實，為治療亨廷頓俄舞蹈癥提供了基礎數(shù)據(jù)和入手點。結(jié)果全基因組篩選可溶性mHTT清除我們使用果蠅S2R細胞系進行全基因組篩選。該實驗體系成熟，可用于各種RNAi篩選，包括一種尋找mHTT聚合物的篩選。我們建立了一條S2R細胞系，該細胞系表達了metallothioneinpromoter-driven含573個氨基酸殘基（其中谷氨酰胺重復序列數(shù)達到73，并帶有C端β1表位）的HTT蛋白片段。我們選擇這一片段是因為更短的片段傾向于形成聚合物，而更長的片段會發(fā)生多重蛋白酶解反應。這兩種情況都會大幅增加檢測可溶性HTT的復雜性。表達的mHTT片段由westernblot和HTRF檢測（配合胞外銅離子誘導）（補充圖1b、c）。為了盡可能減小來自可誘導promoter的定位于轉(zhuǎn)錄的位點數(shù)，我們在一個蛋白降解模型中進行篩選（其中誘導與應用于RNA干擾的dsRNA同時結(jié)束）。mHTT的含量在沒有從頭測序的情況下進行，使我們能同時檢測mHTT降解的促進物和抑制物（圖1a）。初步的篩選使用了兩個全基因組dsRNA庫（AmbionandBKNHeidelberg2，覆蓋了超過97%的果蠅基因組）。我們通過Z分（見實驗方法）（圖1b、c）和復篩選擇初步篩選的位點（圖1b）。如此，我們得到了554個基因作為mHTT降解的調(diào)控基因。在患者成纖維細胞中第二次確認基于序列對比算法可知，在這554個基因中，363個基因有人類同源基因。這363個基因匯編成總共352個候選人類基因（補充表1）。我們在第二次篩選中評估了兩種表達內(nèi)源性全長mHTT蛋白的細胞作為模型的合適程度，分別為敲入基因STHdh的老鼠細胞和人類細胞（經(jīng)永生化處理的亨廷頓舞蹈癥患者成纖維細胞）。兩者轉(zhuǎn)染siRNA的情況均為良好，并在westernblot中顯示出高效的HTT蛋白敲除結(jié)果（補充圖2a、c）。然而對于HTRF檢測結(jié)果，老鼠細胞顯示與westernblot結(jié)果不一致（補充圖2a、b），這使得該模型不適合高通量確認實驗。同樣的不一致也出現(xiàn)在我們檢測老鼠HTT蛋白或其他老鼠細胞模型（例如老鼠胚胎干細胞發(fā)育出的細胞或來自基因敲入老鼠的初級神經(jīng)元）的敲入雜合等位基因的時候（數(shù)據(jù)未提供）。相反，患者的成纖維細胞在測試HTT敲除時westernblot與HTRF結(jié)果顯示出關聯(lián)性。多聚谷氨酰胺選擇性抗體（MW1，在線實驗方法）讓我們能在一高通量模式中有傾向地檢測mHTT（補充圖2c）。因此，我們使用來自兩位患者的永生化處理過的成纖維細胞用于確認實驗。兩種細胞分別帶有編碼含45和68個谷氨酰胺重復序列蛋白的mHTT等位基因（圖2a、b）。我們測試了之前第一輪篩選得到的352個位點，兩個患者成纖維細胞系中的mHTT信號是相互關聯(lián)的（R2=0.68，圖2b），表明大多數(shù)基因?qū)HTT的影響并非由于遺傳背景的緣故。我們之后對那些在兩種細胞系中重復地、持續(xù)地改變mHTT含量地位點進行了幾次反篩選（例如細胞通透性和對照蛋白（中心粒運動神經(jīng)元－2存活，SMN2）含量）（圖2a、c、d）。在這之中，14個位點顯示出對mHTT含量持續(xù)性、選擇性和定位靶向的影響（補充圖3a）。我們還在永生化處理的野生型成纖維細胞中用HTRF技術及2B7-Tb/2166-D2抗體對（在線實驗方法）檢測了野生型HTT含量。只有一個位點（KLHL22）顯著調(diào)控了野生型HTT含量（補充圖3a）。在果蠅亨廷頓舞蹈癥模型中進行體內(nèi)確認為了在體內(nèi)評估這13個位點的病理生理聯(lián)系，我們使用了一個設計良好的果蠅模型。這些果蠅攜帶一個可誘導的轉(zhuǎn)基因，編碼N端的由1～336個氨基酸殘基組成的一段mHTT序列，包含128個谷氨酰胺重復序列（代號為NT-HTT128Q），用GAL4-UAS系統(tǒng)表達。NT-HTT128Q在神經(jīng)系統(tǒng)中的表達（使用elav-GAL4）會誘導一種可重復的、可定量的啟動子表現(xiàn)損傷，該損傷可由能沿玻璃圓柱壁向上爬的NT-HTT128Q型果蠅百分比定量測量，對照組為無NT-HTT128Q的elav-GAL4果蠅（圖3a-f）。我們獲取了所有公開方式可得到的攜帶與我們篩選所得的基因相對應的過表達或失能等位基因的果蠅株型（補充圖3a）。3個位點的同源基因（SSRP、KLK14、NPR1）沒有經(jīng)過測試，因為我們進行篩選時沒有獲得相關的株型。經(jīng)過測試的10個同源位點中，六個（NUB1,VEGFC,SEC61B,SEC61G,LAP3和KLHL22）調(diào)控了NT-HTT128Q誘導的爬行障礙，與在細胞中觀察到的蛋白改變所預測的一致（圖3a-f；KLHL22未顯示，因為將其雜交入果蠅時引起了毒性和果蠅過早死亡，影響了精確測量爬行障礙）。一個位點未顯示調(diào)控作用（RAE1），三個位點（PICALM,CDA,TRAPPC9）顯示與細胞篩選結(jié)果不符的改變（結(jié)果未顯示）。我們之后利用HTRF技術監(jiān)測了這些果蠅體內(nèi)的NT-HTT128Q蛋白水平。與體外實驗結(jié)果一致的是，我們發(fā)現(xiàn)CG15445或CG7103（分別為NUB1和VEGFC的果蠅同源基因）缺乏會導致NT-HTT128Q蛋白水平上升（圖3g、h）。這表明這兩個基因影響mHTT的機制在動物體內(nèi)也是活躍的。NUB1抑制果蠅體內(nèi)mHTT毒性兩個基因中的一個，即NUB1，在行為學和HTRF實驗中顯示出一致的結(jié)果，并且生理上與mHTT存在相互作用。NUB1主要在大腦中表達，通過胞外干擾素-β（IFNβ）處理可以被誘導。CG15445（NUB1的同源基因）shRNA似乎能加劇NT-HTT128Q誘導的啟動子損傷，但本身表型并不強。為了弄清NUB1和HTT之間的相互作用是否具有特異性，我們對表達了人類NUB1基因的轉(zhuǎn)基因果蠅（控制為GAL4-UAS）進行了運動行為測試，以探究NUB1過表達能否抑制NT-HTT128Q誘發(fā)的神經(jīng)退化。受測試的果蠅中五個轉(zhuǎn)入了人類NUB1基因的不同株型顯示了對NT-HTT128Q誘發(fā)的運動行為損傷的抑制（圖4a，部分數(shù)據(jù)未顯示），并且果蠅頭部的NT-HTT128Q量顯著減少（圖4b）。為了在一個獨立試驗中確認我們的實驗觀察，我們評估了視網(wǎng)膜退化。結(jié)果顯示人類NUB1在果蠅視網(wǎng)膜中的表達也抑制了NT-HTT128Q引起的細胞損失和視網(wǎng)膜萎縮，而CG15445對應shRNA的表達則加劇了視網(wǎng)膜疾病表型（圖4c-f）。在哺乳動物模型中NUB1防止mHTT毒性的產(chǎn)生Westernblost結(jié)果確認，NUB1的siRNA減少了NUB1蛋白量，使Q68患者的成纖維細胞和STHdhQ7/Q111細胞的內(nèi)源性HTT蛋白含量增加(Coriellch00096)。此外，在mHTT存在的情況下我們發(fā)現(xiàn)在上述細胞中NUB1對野生型HTT蛋白含量有著與mHTT相同的方向（補充圖4a、b），盡管我們并沒有在一株來自非患者的成纖維細胞對照系中觀察到類似變化（補充圖3a）。這一差異可能是由mHTT等位基因的存在或缺失導致。為了研究NUB1含量增加能否減少內(nèi)源性HTT蛋白含量，我們將人類NUB1的cDNA轉(zhuǎn)入STHdhQ7/Q111細胞。mHTT和野生型HTT含量均顯著降低（47±_11%formHTTbyMW1westernblot,P=0.0011,n=7;49±_19%formHTTpluswtHTTby2B7westernblot,P=0.033,n=5;圖5a）。HTT蛋白含量變化并非源自針對HTTmRNA的效應，因為不管是NUB1siRNA還是cDNA均沒有改變HTT的mRNA量（圖5a及補充圖5a）。HTT蛋白含量變化也不是來自完全長度的HTT蛋白的降解或聚合，因為電泳條帶中低分子量區(qū)域或不溶性區(qū)域都沒有增加（補充圖5a）。為了證實HTT含量減少是通過蛋白降解完成的，我們進行了非放射性脈沖－示蹤實驗來追蹤HTT降解。NUB1過表達顯著（P≤0.01）增加了HTT降解率，但沒有對GAPDH產(chǎn)生影響（補充圖5b）。用蛋白酶體抑制劑（MG132，補充圖5b）阻礙了NUB1對HTT蛋白降解的增強作用，而細胞自噬抑制劑（巴弗洛霉素補充圖5b）并沒有這樣的作用。這些結(jié)果表面，NUB1過表達增強了HTT蛋白的蛋白酶體降解。為了確定NUB1介導的mHTT含量變化是否影響了細胞毒性標記，我們使用了兩種mHTT敲入模型。表達mHTT的STHdh增加了半胱氨基天冬氨酸水解酶3和／或7（caspase3and/or7）在應激條件下的活性，例如血清移除。NUB1過表達顯著降低了血清移除－饑餓誘導的STHdhQ111/Q111細胞中的caspase3和／或7的活性（to63.7+1.5%，圖5b），表明mHTT誘導的caspase活性受到抑制。我們也研究了來自HTT140Q/140Q敲入老鼠的初級皮層神經(jīng)元細胞。在慢病毒感染5天后NUB1過表達顯著降低了該細胞中的內(nèi)源性mHTT水平（33.2±6.4%lower，圖5c），而內(nèi)源性野生型HTT蛋白在野生型神經(jīng)元細胞中沒有顯著改變（9.4±5.8%lower，圖5c）。與野生型神經(jīng)元細胞相比，HTT140Q/140Q神經(jīng)元細胞的內(nèi)源性NUB1蛋白含量和NUB1過表達程度都升高了（圖5c）。這可能表明存在一種mHTT的毒性誘導應激反應，這種反應或者增加了NUB1的表達或者穩(wěn)定了NUB1蛋白，最終增強了mHTT的降解。之前的工作已經(jīng)證明，經(jīng)MTT檢測，在培養(yǎng)10天后HTT140Q/140Q初級神經(jīng)元的細胞通透性低于野生型神經(jīng)元（MTT即3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽），見在線實驗方法）。為了了解增加NUB1是否能保護HTT140Q/140Q神經(jīng)元免于細胞死亡，我們用NUB1或?qū)φ眨↙acZ）的慢病毒感染了培養(yǎng)5天的野生型和HTT140Q/140Q神經(jīng)元，并用MTT測試細胞通透性。培養(yǎng)10天后，未經(jīng)處理的HTT140Q/140Q神經(jīng)元細胞通透性低于野生型（圖5c、d）。就生存情況而言，相比于未感染慢病毒（61.14±0.01%，指存活細胞數(shù)量占野生型神經(jīng)元的比例，下同）和對照組（57.36±0.02%）的HTT140Q/140Q神經(jīng)元細胞，感染了NUB1對應病毒的HTT140Q/140Q神經(jīng)元顯示出更高的存活率（81.82±0.01%）（圖5d）。這些發(fā)現(xiàn)顯示，哺乳動物神經(jīng)元中的mHTT毒性可以通過NUB1含量增加來緩解，作用機制是降低mHTT含量。在人類胚胎干細胞（hESC）／誘導多能干細胞分化神經(jīng)元中NUB1降低mHTT含量為了在人類神經(jīng)元范疇中研究NUB1，我們使用了hESC分化神經(jīng)元細胞（補充圖6）。hESC分化神經(jīng)元被短暫地轉(zhuǎn)染了表達一個Q73mHTT外顯子1（HTT-exon1-Q73）的結(jié)構體，時長為3天，而mHTT通過HTRF、westernblot或者免疫染色法檢測。用HTRF加兩組抗體對（4C9-Tb/MW1-D2）檢測顯示，cDNA共轉(zhuǎn)染的NUB1過表達減少了mHTT含量（幅度達74.4±0.8%，圖6a左），而另兩組抗體對（4C9-Tb/4C9-D2）則檢測到聚合的mHTT（98.5±0.8%，圖6a中）。Westernblot結(jié)果與HTRF一致（圖6a右）。此外，mHTT聚合物用抗體EM48通過免疫染色實現(xiàn)可視化（圖6b）。在免疫染色與HTRF或westernblot得到的mHTT含量改變情況一致的結(jié)果中，NUB過表達降低了經(jīng)EM48+免疫染色的神經(jīng)元百分比（從8.5±0.9%降至1.5%±0.3%；圖6b）。mHTT-NUB1轉(zhuǎn)染的神經(jīng)元中該百分比（43.6±1.6%）稍高于無NUB1共轉(zhuǎn)染的HTT轉(zhuǎn)染細胞（34.3±1.2%；圖6b），這可能表明mHTT誘發(fā)的毒性得到降低。相比之下，當mHTT外顯子1上所有的賴氨酸殘基都突變?yōu)榫彼幔≦73_3R）時，NUB1介導的降低作用對mHTT無效（圖6a、b），表明mHTT賴氨酸修飾可能參與了相關反應，并通過翻譯后修飾機制協(xié)助了NUB1介導的mHTT含量降低過程。盡管hESC分化神經(jīng)元能模擬人類神經(jīng)元，但它過表達的是mHTT片段而非內(nèi)源性全長mHTT。為了確認NUB1能否在人類神經(jīng)元中清除內(nèi)源性mHTT，我們培養(yǎng)了從患病者身上得到的誘導多能干細胞（iPSC）分化的神經(jīng)元。與非定位對照組相比，在NUB1被siRNA敲除后細胞內(nèi)mHTT水平顯著升高（HTRF測得增幅為17.2±0.0%，圖6c左）。此外，NUB1經(jīng)慢病毒感染過表達后與LacZ對應慢病毒感染的細胞相比，mHTT含量顯著降低（HTRF測得降幅為15.7±1.7%，圖6c右），與未感染樣本相比也有類似結(jié)果。mHTT含量降低程度沒有老鼠神經(jīng)元大（圖5c），可能是由于iPSC分化神經(jīng)元的病毒感染效率較低（iPSC為~35%，而老鼠神經(jīng)元>95%，通過IRES-GFP判斷；數(shù)據(jù)未顯示）。和最近的研究結(jié)果一致的是，我們觀察到我們的iPSC分化神經(jīng)元在培養(yǎng)基中從腦部提取的嗜神經(jīng)組織因子（neurotropicfactor,BDNF）被移除后升高了caspase3和/或7的活性（圖6d、e）。通過HTTsiRNA轉(zhuǎn)染實現(xiàn)的HTT敲除將caspase活性降低到接近野生型水平（圖6d、e），說明存在一種mHTT依賴的神經(jīng)毒性。在Q70的iPSC分化神經(jīng)元中，NUB1過表達降低了caspase3和/或7的活性，表現(xiàn)出神經(jīng)保護性（圖6d、e）?？偠灾琋UB1降低了mHTT含量，保護了我們測試的所有人類神經(jīng)元模型中保護了神經(jīng)元，這其中包括來自亨廷頓舞蹈癥患者的iPSC分化神經(jīng)元（最接近患者神經(jīng)元的體外模型）。NUB1通過CUL3依賴的多聚泛素化降低mHTT含量mHTT賴氨酸殘基的參與（圖6a、b）和關于NUB1的研究報道表明了可能存在一種賴氨酸翻譯后修飾機制，通過泛素樣蛋白NEDD8或FAT10實現(xiàn)NUB1依賴的mHTT清除。評估NEDD8或FAT10對于底物的影響是具有挑戰(zhàn)性的，這可能是通道過多或蛋白量過高的結(jié)果。因此，為了弄清NUB1對mHTT含量的改變是否需要NEDD8和／或FAT10參與，我們使用了老鼠HN10成神經(jīng)細胞瘤細胞（表達了NEDD8但沒有可測量的FAT10，補充圖7）。當與一個HTT外顯子1-Q73結(jié)構體共轉(zhuǎn)染時，NUB1轉(zhuǎn)染與空白轉(zhuǎn)染相比顯著降低了mHTT含量（補充圖8a），表明NUB1依賴的mHTT降解并不需要FAT10。siRNA敲除NEDD8則阻礙了NUB1介導的HTT外顯子1清除（補充圖8a）。NUB1過表達對HTT外顯子1-Q73_3R沒有作用（補充圖8a）。因此，NEDD8（而不是FAT10）是NUB1介導的mHTT降解所必須的。與mHTT清除需要NEDD8一樣，對Q68成纖維細胞用MLN4924（一種強有力的NEDD8激活酶抑制劑）進行處理也能增加內(nèi)源性mHTT含量（補充圖8b左）。通過siRNA敲除實現(xiàn)的NUB1表達缺失導致了MLN4924活性缺失，表明其活性通路與功能性NUB1以及NEDD化級聯(lián)反應有關（補充圖8b右）。綜上所述，最簡單的解釋就是mHTT受到NEDD8的調(diào)控（NEDD化），而NEDD化的mHTT通過NUB1被清除。然而，盡管我們付出了廣泛的努力（數(shù)據(jù)未顯示），我們依然沒能檢測到任何NEDD化的mHTT。因此，我們猜測是通道內(nèi)的其他成分被NEDD化了而非mHTT本身。描述最完善的NEDD8底物是滯蛋白泛素E3連接酶類。我們通過過表達帶有一個V5抗原決定基的顯性負滯蛋白類（dnCUL1-dnCUL5）（見在線實驗步驟）研究滯蛋白類對之前描述的過程的參與情況。只有dnCUL3過表達阻礙了NUB1介導的mHTT降解（從61.0±4.4%降為19.7±13.4%，n=5），表明CUL3參與了這一過程。因為CUL3是一個泛素E3連接酶的主要組成部分，我們便尋找mHTT的泛素化。我們在STHdh細胞中短暫地共表達了血凝素（HA）標記的HTT外顯子1-Q73（Q73-HA）蛋白與NUB1/dnCUL3（任一或者兩者均有，圖7b）。細胞之后經(jīng)過了MG132處理，Q73-HA經(jīng)過免疫沉降反應后進行了westernblot（抗體結(jié)合泛素）以檢測泛素化（圖7b左）。我們在HTT外顯子1-Q73中檢測到了一個微弱的基線多聚泛素化信號，大約在110-160kDa處。NUB1過表達增強了該信號，并且與背景相比沒有出現(xiàn)在賴氨酸三聯(lián)突變體中。dnCUL3稍微降低了基線多聚泛素化，但強烈抑制了NUB1誘導的mHTT多聚泛素化增強。因此，似乎是NUB1過表達通過CUL3泛素E3連接酶增強了mHTT多聚泛素化過程。與依賴CUL3一致的是，dnCUL3共轉(zhuǎn)染部分抑制了NUB1介導的STHdh細胞保護作用（圖7）。這可以通過移除血清培養(yǎng)基后STHdhQ111/Q111細胞的caspase3和/或7酶活性降低程度進行測定（本實驗中活性從36.5±0.6%降到25.1±0.1%）。這一結(jié)果進一步證實了CUL3的參與，并確認了NUB1介導的細胞保護是通過減少mHTT完成的。綜上所述，NUB1促進HTT降解的一個可能的解釋是，通過與HTT和NEDD化蛋白的實質(zhì)性接觸，NUB1將NEDD化的活性CUL3運送到HTT蛋白，增強了泛素化和HTT降解（補充圖9）。IFNβ處理導致NUB1介導的mHTT含量降低為了加強NUB1介導的HTT降解，我們檢測了作為一種潛在的亨廷頓舞蹈癥治療途徑的NUB1表達誘導。根據(jù)前人報道，NUB1是一種可由IFNβ誘導的蛋白，而IFNβ經(jīng)FDA批準可用于臨床使用。因此，我們研究了IFNβ處理對HTT含量和神經(jīng)毒性的影響，作為針對NUB1的可能治療途徑概念的證據(jù)。胞外使用IFNβ兩天后在Q68成纖維細胞和STHdhQ7/Q111細胞中均出現(xiàn)NUB1蛋白含量升高和HTT含量降低的現(xiàn)象（圖8）。這一影響不是通過改變HTT基因表達實現(xiàn)的，因為IFNβ處理沒有減少HTT基因的mRNA含量（圖8b）。HTT含量降低與IFNβ處理之間的劑量－應答關系具有617Uml-1的半最大效應濃度（EC50）（圖8c），這與之前報道的誘導NUB1基因表達的IFNβ濃度接近；此外，IFNβ處理沒有引起顯著的毒性（圖8c）。為了確認IFNβ誘導的HTT含量降低是由NUB1主導的，我們將NUB1基因的siRNA或者對照組siRNA轉(zhuǎn)染入Q68成纖維細胞，之后對細胞進行IFNβ處理。與對照組或未轉(zhuǎn)染的細胞相比，轉(zhuǎn)染了NUB1基因siRNA的細胞的IFNβ劑量－應答曲線出現(xiàn)了明顯的右移（EC50移至大于4000Uml-1；圖8c）。為了探究在哺乳動物神經(jīng)元中IFNβ是否能抑制mHTT誘導的毒性，我們對HTT140Q/140/Q初級神經(jīng)元的培養(yǎng)體系進行了IFNβ處理以誘導NUB1蛋白的表達。HTT含量顯著降低（wtHTT降低了36.9±10.6%而mHTT降低了50.0±7.7%；圖8d）。HTT140Q/140/Q神經(jīng)元的通透性恢復到了與經(jīng)BDNF處理過的細胞相似的水平（102.6±3.0%；圖8e）。與BDNF的無特異性神經(jīng)營養(yǎng)功能相比，通過IFNβ的神經(jīng)恢復只針對mHTT神經(jīng)元，在野生型神經(jīng)元中沒有活性。這與之前的假說（即因IFNβ而增加的NUB1拯救了mHTT引發(fā)的神經(jīng)毒性，而不是提供無特異性的神經(jīng)保護）一致。為了進一步證明IFNβ通過NUB1保護神經(jīng)元，我們檢測了沒有NUB1表達的IFNβ的影響。由于沒有Nub1敲除的老鼠模型，我們在STHdh細胞中進行實驗，而且通過siRNA達到了近乎完全的Nub1基因敲除（補充圖4b）。在STHdhQ111/Q111細胞中，IFNβ抑制了刺激誘導的caspase活性（52.1±0.6%；圖8f），而Nub1siRNA轉(zhuǎn)染顯著地削弱了這一影響（降至11.0±1.5%；圖8f）表明IFNβ引發(fā)的保護作用的主要機制是通過NUB1完成的。上述發(fā)現(xiàn)突出了IFNβ或NUB1誘導作為亨廷頓舞蹈癥治療途徑的潛能。討論人們認為，減少mHTT的含量是一種有效的亨廷頓舞蹈癥治療方法。然而，由于沒有針對mHTT含量變化的篩選方面的努力，經(jīng)確認的調(diào)控mHTT蛋白的位點很少。這里我們報告了據(jù)我們所知的首次目標為確認mHTT含量調(diào)控物的全基因組篩選。盡管我們可能因各種失誤（其中包括從果蠅到人類的同源基因繪譜不完全，以及其他在確認過程中不可避免的損失）排除了一些位點，我們通過在不同物種間測試和多個體系中實驗將假陽性的風險降到最低。我們在人類患者細胞系中確認了13個調(diào)控內(nèi)源性mHTT含量的位點，而測試的10個位點中的6個顯示出與其在HTT蛋白實驗中的活性一致的體內(nèi)活性。盡管有報告顯示在幾百個確認的蛋白中NUB1與HTT存在相互作用，我們的研究是第一個展示NUB1在亨廷頓舞蹈癥中的生物功能的。在人類神經(jīng)元模型中，它減少了全長mHTT蛋白，防止了mHTT聚合物的形成。該活性在果蠅、人類和老鼠中均一致，證明了NUB1是一個強有力的，而且進化上保守的mHTT蛋白調(diào)控因子。在哺乳動物模型和轉(zhuǎn)基因果蠅體內(nèi)模型中，NUB1顯示出mHTT特異性的神經(jīng)保護活性。NUB1調(diào)控mHTT含量的功能及與之伴隨的對依賴mHTT的細胞毒性的抑制一起，支持了定位NUB1基因的可能治療策略。NUB1過表達可能也會降低wtHTT含量，至少在一些經(jīng)實驗的細胞系中（例如圖5a）。這可能引發(fā)對靶向定位NUB1基因的關注；然而，與降低mHTT伴隨的wtHTT部分缺失可能是對mHTT殘留有利