乳腺癌類(lèi)器官藥物敏感性檢測(cè)指導(dǎo)患者精準(zhǔn)治療技術(shù)規(guī)范

Q/LB.□XXXXX-XXXXT/FDSAXXX—2024目次TOC\o"1-1"\h前言 II1范圍 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語(yǔ)和定義 14樣本采集與處理 15類(lèi)器官建立與培養(yǎng) 26藥物敏感性檢測(cè) 27結(jié)果解讀與精準(zhǔn)治療建議 4前言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專(zhuān)利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專(zhuān)利的責(zé)任。本文件由XXX提出。本文件由中國(guó)食品藥品企業(yè)質(zhì)量安全促進(jìn)會(huì)歸口。本文件起草單位：深圳市北科生物科技有限公司、國(guó)科大杭州高等研究院、樸衡博邁（上海）生物醫(yī)藥有限公司、上海睿鈺生物科技有限公司、杭州艾名醫(yī)學(xué)科技有限公司、山東富優(yōu)生命科學(xué)有限公司、諾賽聯(lián)合（北京）生物醫(yī)學(xué)科技有限公司、山東省第四人民醫(yī)院、新安吉醫(yī)療科技（深圳）有限公司。本文件主要起草人：蔡車(chē)國(guó)、張夢(mèng)娜、李金朋、高云峰、廖延、宋光啟、王鶴鳴、陳睿、陳凱、游明亮、申重陽(yáng)、張茂好、張曉峰、亓愛(ài)杰、李少波、張磊升、胡良昌、祝佳杏。乳腺癌類(lèi)器官藥物敏感性檢測(cè)指導(dǎo)患者精準(zhǔn)治療技術(shù)規(guī)范范圍本文件規(guī)定了乳腺癌類(lèi)器官藥物敏感性檢測(cè)的樣本采集與處理、類(lèi)器官建立與培養(yǎng)、藥物敏感性檢測(cè)、結(jié)果解讀與精準(zhǔn)治療建議。本文件適用于乳腺癌類(lèi)器官藥物敏感性檢測(cè)和指導(dǎo)治療乳腺癌患者。規(guī)范性引用文件本文件沒(méi)有規(guī)范性引用文件。術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。乳腺癌類(lèi)器官breastcancerlikeorgan利用乳腺癌患者的腫瘤組織或細(xì)胞，在體外三維培養(yǎng)條件下形成的具有類(lèi)似原生組織結(jié)構(gòu)的三維細(xì)胞團(tuán)，能夠模擬原生腫瘤組織的生理和病理特性。藥物敏感性檢測(cè)drugsensitivitytesting一種通過(guò)實(shí)驗(yàn)方法評(píng)估特定藥物對(duì)乳腺癌類(lèi)器官生長(zhǎng)或活性的抑制作用，從而預(yù)測(cè)該藥物對(duì)患者腫瘤可能的治療效果。樣本采集與處理樣本采集采集對(duì)象應(yīng)為確診為乳腺癌的患者，在符合醫(yī)學(xué)倫理和患者知情同意的前提下進(jìn)行樣本采集。通過(guò)手術(shù)或穿刺活檢獲取新鮮的乳腺癌組織樣本。采集過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)范，避免樣本污染。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求采集足夠量的樣本，確保后續(xù)類(lèi)器官培養(yǎng)和藥物敏感性檢測(cè)的順利進(jìn)行。樣本處理將采集到的乳腺癌組織樣本按照以下步驟進(jìn)行處理：初步處理：將組織樣本立即放入含有適量培養(yǎng)基或保存液的無(wú)菌容器中，以保持細(xì)胞的活性；清洗與消毒：用無(wú)菌生理鹽水或PBS緩沖液輕輕沖洗樣本，去除表面的血跡和污染物。避免使用刺激性強(qiáng)的化學(xué)消毒劑；切割與消化：將組織樣本切割成小塊，便于后續(xù)的消化和分離。使用適宜的消化酶（如胰蛋白酶、膠原酶等）在37℃下進(jìn)行消化，直至組織塊分散成單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)；細(xì)胞懸液制備：消化完成后，通過(guò)離心去除消化液，加入適量的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液，用于后續(xù)的類(lèi)器官培養(yǎng)。質(zhì)量控制與記錄在樣本處理過(guò)程中和處理后，應(yīng)進(jìn)行細(xì)胞活性檢測(cè)（如臺(tái)盼藍(lán)染色法），確保細(xì)胞的活力和數(shù)量滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求。對(duì)處理后的細(xì)胞懸液進(jìn)行微生物污染檢測(cè)，確保無(wú)細(xì)菌、真菌等污染。詳細(xì)記錄樣本的采集時(shí)間、地點(diǎn)、患者信息等，以及樣本處理過(guò)程中的關(guān)鍵步驟和參數(shù)，確保實(shí)驗(yàn)的可追溯性和重復(fù)性。類(lèi)器官建立與培養(yǎng)細(xì)胞接種與基質(zhì)準(zhǔn)備基質(zhì)膠準(zhǔn)備選擇適宜的基質(zhì)膠，如Matrigel或其他生物工程基質(zhì)，用于模擬體內(nèi)微環(huán)境，并為類(lèi)器官的形成提供支持。細(xì)胞接種將處理好的乳腺癌細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)接種在基質(zhì)膠上，確保細(xì)胞分布均勻，密度適中。培養(yǎng)條件設(shè)置培養(yǎng)基根據(jù)乳腺癌類(lèi)器官的生長(zhǎng)需求，選擇含有必需營(yíng)養(yǎng)成分、生長(zhǎng)因子和激素的培養(yǎng)基。環(huán)境條件維持培養(yǎng)環(huán)境的溫度在37°C，CO2濃度為5%，并保持適宜的濕度，以模擬體內(nèi)生理?xiàng)l件。換液與觀察定期更換培養(yǎng)基，以去除代謝產(chǎn)物和補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。同時(shí)，定期觀察類(lèi)器官的生長(zhǎng)情況，記錄形態(tài)變化、增殖速率等關(guān)鍵指標(biāo)。類(lèi)器官形成與監(jiān)測(cè)在接種后，持續(xù)監(jiān)測(cè)細(xì)胞在基質(zhì)膠中的生長(zhǎng)和分化情況，直至形成具有三維結(jié)構(gòu)的類(lèi)器官。定期使用顯微鏡觀察類(lèi)器官的形態(tài)學(xué)特征，確保其結(jié)構(gòu)與原生乳腺癌組織相似。培養(yǎng)周期與傳代根據(jù)類(lèi)器官的生長(zhǎng)速度和實(shí)驗(yàn)需求，設(shè)定合理的培養(yǎng)周期。當(dāng)類(lèi)器官生長(zhǎng)到一定程度時(shí)，進(jìn)行傳代操作，即將類(lèi)器官分散成單個(gè)細(xì)胞或小塊，重新接種到新的基質(zhì)膠上繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)過(guò)程中的質(zhì)量控制定期對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行污染檢測(cè)，確保無(wú)細(xì)菌、真菌或其他微生物的污染。詳細(xì)記錄類(lèi)器官的生長(zhǎng)情況，包括形態(tài)學(xué)變化、生長(zhǎng)速度等，以便后續(xù)分析。藥物敏感性檢測(cè)檢測(cè)原理藥物敏感性檢測(cè)基于類(lèi)器官對(duì)藥物的反應(yīng)來(lái)評(píng)估其療效。通過(guò)檢測(cè)藥物對(duì)乳腺癌類(lèi)器官生長(zhǎng)、增殖或凋亡的影響，預(yù)測(cè)該藥物對(duì)患者的可能療效。實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備藥物選擇根據(jù)臨床需求和患者情況，選擇待測(cè)藥物。藥物濃度設(shè)置針對(duì)每種藥物，設(shè)定多個(gè)濃度梯度，以全面評(píng)估藥物在不同濃度下對(duì)類(lèi)器官的影響。對(duì)照組設(shè)置設(shè)立未經(jīng)藥物處理的對(duì)照組，以便準(zhǔn)確評(píng)估藥物效應(yīng)。鋪板培養(yǎng)板的選擇應(yīng)選擇透明、無(wú)菌、對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性的培養(yǎng)板，以確保類(lèi)器官的正常生長(zhǎng)和觀察。宜使用低吸附性的培養(yǎng)板，以減少類(lèi)器官與培養(yǎng)板表面的粘附，保持類(lèi)器官的3D結(jié)構(gòu)。類(lèi)器官密度在鋪板時(shí)，應(yīng)控制類(lèi)器官的密度，避免過(guò)度擁擠或過(guò)于稀疏，以保證類(lèi)器官的正常生長(zhǎng)和藥物敏感性檢測(cè)的準(zhǔn)確性。推薦的類(lèi)器官密度應(yīng)根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)條件和類(lèi)器官的大小而定，一般建議在培養(yǎng)板的每個(gè)孔中放置適當(dāng)數(shù)量的類(lèi)器官。基質(zhì)膠濃度和體積基質(zhì)膠應(yīng)用于支持類(lèi)器官的生長(zhǎng)和維持其3D結(jié)構(gòu)。基質(zhì)膠的濃度和體積應(yīng)根據(jù)類(lèi)器官的類(lèi)型和大小進(jìn)行優(yōu)化，以確保類(lèi)器官在培養(yǎng)過(guò)程中的穩(wěn)定性和生長(zhǎng)狀況。加藥藥敏培養(yǎng)基配方藥敏培養(yǎng)基應(yīng)包含必需的營(yíng)養(yǎng)成分和生長(zhǎng)因子，以支持類(lèi)器官的正常生長(zhǎng)和代謝。培養(yǎng)基的配方應(yīng)根據(jù)類(lèi)器官的具體需求和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化。藥物濃度梯度稀釋藥物應(yīng)按照預(yù)定的濃度梯度進(jìn)行稀釋?zhuān)栽u(píng)估不同藥物濃度對(duì)類(lèi)器官的影響。稀釋過(guò)程中應(yīng)確保藥物的均勻分布和準(zhǔn)確濃度，避免濃度誤差對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。藥物處理時(shí)間藥物處理時(shí)間應(yīng)根據(jù)藥物的性質(zhì)和實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行確定。推薦在處理前進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定最佳的藥物處理時(shí)間。檢測(cè)3D類(lèi)器官細(xì)胞活力ATP檢測(cè)法通過(guò)測(cè)量類(lèi)器官中的ATP水平來(lái)評(píng)估細(xì)胞活力。應(yīng)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，確保測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性。3D無(wú)損成像檢測(cè)法使用高分辨率顯微鏡對(duì)類(lèi)器官進(jìn)行無(wú)損成像，觀察類(lèi)器官的形態(tài)變化和生長(zhǎng)情況。成像過(guò)程中應(yīng)避免對(duì)類(lèi)器官造成損傷或干擾。AOPI熒光染色檢測(cè)法使用AOPI熒光染料對(duì)類(lèi)器官進(jìn)行染色，通過(guò)熒光顯微鏡觀察活細(xì)胞和死細(xì)胞的分布情況。染色過(guò)程中應(yīng)確保染料的均勻滲透和適當(dāng)濃度，以獲得清晰的熒光信號(hào)。數(shù)據(jù)分析IC50計(jì)算根據(jù)藥物濃度和對(duì)應(yīng)的細(xì)胞活力數(shù)據(jù)，使用合適的統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算IC50值（半抑制濃度）。IC50值可用于評(píng)估藥物對(duì)類(lèi)器官的抑制效果，并比較不同藥物或不同類(lèi)器官之間的敏感性差異。類(lèi)器官圖片分析對(duì)類(lèi)器官的圖片進(jìn)行定量分析，包括大小、數(shù)量、邊緣粗糙度、中空度等反應(yīng)器官活力的指標(biāo)，可用于評(píng)估類(lèi)器官的生長(zhǎng)狀況和藥物對(duì)類(lèi)器官形態(tài)的影響。熒光強(qiáng)度分析對(duì)AOPI熒光染色后的類(lèi)器官圖片進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析，分別計(jì)算綠色熒光（代表活細(xì)胞）和紅色熒光（代表死細(xì)胞）的強(qiáng)度。通過(guò)比較不同藥物處理組之間的熒光強(qiáng)度差異，評(píng)估藥物對(duì)類(lèi)器官細(xì)胞活力的影響。結(jié)果判定與報(bào)告敏感性判定依據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，制定敏感性判定標(biāo)準(zhǔn)，如將藥物敏感性分為高度敏感、中度敏感和低敏感等級(jí)。報(bào)告撰寫(xiě)應(yīng)撰寫(xiě)詳細(xì)的藥物敏感性檢測(cè)報(bào)告，包括但不限于以下內(nèi)容：實(shí)驗(yàn)基本信息：包括實(shí)驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)、操作人員、使用的類(lèi)器官來(lái)源等；實(shí)驗(yàn)方法與材料：詳細(xì)描述實(shí)驗(yàn)方法、使用的藥物及其濃度設(shè)置；結(jié)果部分：展示藥物敏感性檢測(cè)的各項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果；分析討論：對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行深入分析，探討藥物敏感性的可能機(jī)制，以及實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)患者的治療指導(dǎo)意義；結(jié)論與建議：根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，給出明確的藥物敏感性結(jié)論，并提出針對(duì)患者的個(gè)性化精準(zhǔn)治療建議。報(bào)告應(yīng)由專(zhuān)業(yè)人員進(jìn)行審核，確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和報(bào)告的完整性。對(duì)于關(guān)鍵數(shù)據(jù)和結(jié)論，應(yīng)進(jìn)行多次復(fù)核，避免出現(xiàn)錯(cuò)誤或遺漏。結(jié)果解讀與精準(zhǔn)治療建議結(jié)果解讀藥物敏感性判定根據(jù)第6章藥物敏感性檢測(cè)的結(jié)果，將藥物對(duì)乳腺癌類(lèi)器官的抑制作用進(jìn)行量化評(píng)估。通常，抑制率超過(guò)50%可認(rèn)為藥物對(duì)該類(lèi)器官有明顯的抑制作用。結(jié)合藥物的IC50值（半數(shù)抑制濃度）來(lái)綜合判斷藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。IC50值越低，表示藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力越強(qiáng)。結(jié)果可靠性分析對(duì)比不同藥物或同一藥物不同濃度下的抑制作用，以評(píng)估結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性。分析實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的可能干擾因素，如類(lèi)器官的質(zhì)量、藥物的穩(wěn)定性等，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。精準(zhǔn)治療建議個(gè)性化治療方案制定根據(jù)藥物敏感性檢測(cè)結(jié)果，為患者篩選出敏感藥物，避免使用不敏感或耐藥的藥物。結(jié)合患者的臨床情況、病理類(lèi)型、分期等因素，制定個(gè)性化的精準(zhǔn)治