生物化學-蛋白質

蛋白質一、蛋白質的一般特性（一）含量：細胞干重一半（二）作用（三）相對分子質量：6000~6000000（四）元素組成：CHONSN含量平均：16%?？赏ㄟ^測量N，估算蛋白質的含量。二、氨基酸（一）氨基酸的結構和類型1.α-氨基酸的結構和旋光性氨基酸：至少含有一個氨基和一個羧基的有機小分子。組成蛋白質的氨基酸：α-氨基酸甘氨酸不具有旋光性，其余氨基酸具有旋光性。蛋白質中的氨基酸幾乎都是L-氨基酸2.氨基酸類型蛋白質氨基酸：30多種（常見的20種）非蛋白質氨基酸：β、Γ、δ氨基酸，D-型氨基酸，如鳥氨酸、瓜氨酸、γ-氨基丁酸、β-丙氨酸等。疏水性：遠離水相。膜中暴露。位于蛋白質的角落，使其易于折疊。親水性：暴露在大分子表面與水接觸。形成--s-s-鍵（二）氨基酸的酸堿性質和等電點

1.氨基酸的酸堿性質兩性電解質2.氨基酸的等電點調節(jié)溶液的PH可使氨基酸表現(xiàn)出各種帶電形式當溶液在某特定的pH時，氨基酸主要以兩性離子形式存在，在溶液中所帶的凈電荷為零，即一個氨基酸所帶正電荷與負電荷數(shù)相同，這時雖在電場作用下，它也不會向正極或負極移動，這時溶液的pH值稱為該氨基酸的等電點，常用pI表示。每一種氨基酸都有特定的pl。等電點pI等于電中性狀態(tài)的兩性離子兩側pK值的平均值。酸性氨基酸的pI<7，堿性氨基酸的pI>7，其他氨基酸的pl<7但很接近于7。（三）氨基酸的分離和分析鑒定1.依據(jù)各種氨基酸在水中和在其他某種溶劑中有不同溶解度為原理的兩種方法（1）紙層析法（2）薄層層析法先將樣品點在濾紙一端距紙邊約2～3厘米處，然后將點有樣品的一端浸入某一有機溶劑系統(tǒng)中，不沒及樣品，經(jīng)毛細管作用使溶劑從紙的一端流向另一端，樣品中的混合物也得以分離，濾紙干后再以適當顯色劑顯色或在紫外燈下觀察所得的層析圖譜，加以鑒定。將纖維素、硅膠、氧化鋁或聚酰胺等之一作為支持劑涂布在玻璃或其他載體上制成均勻的薄層，然后將被分析的樣品滴加到薄層的一端上，再用適當?shù)娜軇┱归_就可使樣品得以分離（圖1-15）。2.依據(jù)各種氨基酸有不同等電點為原理的三種方法（1）離子交換柱層析法離子交換樹脂：是帶有官能團（有交換離子的活性基團）、具有網(wǎng)狀結構、不溶性的高分子化合物。調節(jié)相應氨基酸溶液的pH值，使相應氨基酸呈陽離子或陰離子，再選用陽離子交換樹脂或陰離子交換樹脂進行離子交換層析而分離得到相應的氨基酸。陽離子交換樹脂陰離子交換樹脂（2）沉淀法調節(jié)溶液pH值等于某種氨基酸的pI時，該氨基酸會由于靜電引力的作用，溶解度最小，容易發(fā)生沉淀。（3）電泳法處于一定pH溶液中的不同氨基酸分子，其正、負電荷量和相對分子質量是不相同的，因而在一定電場強度下的電場中向相反電極移動的速度不同而得到分離和提純。茚三酮反應測定氨基酸的含量原理:含有α-氨基的化合物與茚三酮反應生成紫色。通過比色法可以定量測定氨基酸含量。但是脯氨酸與之反應生成亮黃色化合物。三、二肽和多肽氨基酸殘基α羧基C端α氨基N端有雙鍵性質，不可旋轉。四、蛋白質（一）蛋白質的空間結構按構象分纖維蛋白（結構蛋白）：二級或超二級結構球蛋白（功能蛋白）：三級或四級結構1.蛋白質的一級結構多肽鏈中氨基酸的數(shù)目、種類和排列順序，多肽鏈的數(shù)目，多肽鏈之間的連接方式和連接部位，二硫鍵的數(shù)目和位置.一級結構：肽鍵、二硫鍵2.蛋白質的二級結構指蛋白質分子中的肽鏈向單一方向卷曲而形成的有周期性重復的主體結構或構象。二級結構：氫鍵類型：α螺旋、β折疊（1）α螺旋3.6個氨基酸殘基右手螺旋居多螺距0.54nm（2）β-折疊并列的比α螺旋更為伸展的肽鏈，互相以氫鍵連接起來而成片層狀的結構。肽鏈比較伸展，彈性較差。（3）β-轉角和不規(guī)則卷曲β轉角：使多肽鏈發(fā)生180°的回折。不規(guī)則卷曲：使一種沒有規(guī)律的松散肽鏈結構。酶的功能部位常常位于這種構象區(qū)域里。3.超二級結構和結構域蛋白質二級結構和三級結構的過渡態(tài)。（1）超二級結構二級結構組合體，但沒有結構域。幾種超二級結構膠原蛋白彈性蛋白角蛋白膠原蛋白脊椎動物中最多、最普遍的蛋白質普遍存在于結締組織、真皮、腱、韌帶、骨及軟骨、血管壁、角膜等處的細胞外基質中。每條肽鏈是α左手螺旋3條α-螺旋共價相連，形成右手螺旋。原膠原分子原膠纖維共價鍵隨著動物年齡的增長，肽鏈間的共價鍵數(shù)目增加，使膠原纖維越來越硬而脆，結果改變了結締組織的機械性能?！椥缘鞍兹狈σ?guī)則的二級結構，更不形成超螺旋，但含有各種各樣的不規(guī)則卷曲。當施加張力時，卷曲可以拉伸;張力除去后，卷曲又可復原，因此彈性蛋白有彈性?！そ堑鞍譨-角蛋白（呈α-螺旋的纖維蛋白）：指甲，毛發(fā)。有蹄類蹄，角，羊毛。毛發(fā)：3條α右手螺旋

→左手螺旋初原纖維→微原纖維（9+2式）→纖維束β-角蛋白（呈β-折疊）:存在于蠶絲，蛛絲。鳥類和爬行類的羽毛和皮膚。（2）結構域結構域(domain)是位于超二級結構和三級結構間的一個層次。多肽鏈上相鄰的超二級結構緊密聯(lián)系，進一步折疊形成一個或多個相對獨立的致密三維實體，即結構域。結構域有獨特的空間構象，并承擔不同的生物學功能。對于較小的蛋白質分子或亞基來說，結構域和它的三級結構往往是一個意思。3.蛋白質的三級結構相關化學鍵：氫鍵，疏水鍵，鹽鍵，二硫鍵，范德華力球蛋白的三級結構表明，一條多肽往往是由一部分α-螺旋和一部分β-折疊，通過β-轉角成不規(guī)則卷曲連接，緊密折疊成球狀的結構。表面富含親水基團，易溶于水，所以能發(fā)揮各自的作用。含F(xiàn)e的色素功能蛋白至少需要幾級結構？肌紅蛋白三級結構5.蛋白質的四級結構兩個以上的肽鏈，以弱鍵連接，形成一定的構象，就是四級結構?；瘜W鍵：離子鍵（鹽鍵）、疏水鍵、氫鍵、范德華力等次級鍵（即非共價鍵，又稱弱鍵）血紅蛋白的四級結構①4條肽鏈②每條肽鏈都是一個三級結構的球蛋白。并各帶一個血紅素基團。③四條肽鏈擠在一起形成一定構象。（二）蛋白質的理化性質1.蛋白質是兩性電解質2.蛋白質是高分子化合物，在水中呈膠體3.蛋白質沉淀4.蛋白質的變構和變性1.蛋白質是是兩性電解質

蛋白質分子的每條多肽鏈，至少含有一個氨基和一個狻基，所以蛋白質是兩性電解質每種蛋白質都有特定的pI值。蛋白質混合液中，各蛋白質的pI和相對分子質量大小不同，所以在同一pH溶液及同一電場強度中，它們的移動速度是不相等的。根據(jù)這一原理就可以用電泳法使混合的蛋白質得到分離。2.蛋白質是高分子化合物，在水中呈膠體蛋白質是大分子、外帶有水化膜、具有同性電荷，因而在水中能形成穩(wěn)定的膠體。

蛋白質分子在pH不等于其pI的任何溶液中都是帶同性電荷的。等電點時更容易沉淀3.蛋白質沉淀①鹽析

高濃度鹽離子的水化作用，使蛋白質分子除去水化膜則凝聚沉淀的過程，叫鹽析。不同的蛋白質鹽析時所需鹽類濃度不同，因此可以用逐漸加大鹽溶液濃度的方法使不同蛋白質分段析出加以分離，這種操作稱為分段鹽析。②加入親水力強的有機溶劑

酒精、丙酮等有機溶劑對水的親和力很大，因此亦能破壞蛋白質的水膜。如果在等電點時加入這些有機溶劑即可使蛋白質沉淀析出。③加人可與蛋白質結合成不溶解的化合物的物質重金屬離子酸根（不變性）（變性）（溫度高則變性）4.蛋白質的變構和變性（1）變構蛋白質與效應物的結合引起整個蛋白質分子構象發(fā)生改變的現(xiàn)象就稱為蛋白質的變構作用，又稱別構作用。（只涉及非共價鍵的斷裂，是可逆的）（2）變性蛋白質分子的空間結構發(fā)生改變和破壞從而喪失生物活性的現(xiàn)象叫變性。一級結構不變，破壞二級結構以上的結構，即氫鍵等次級鍵部分或全部斷裂。溶解度降低，易沉淀（內部的疏水基團暴露）；失去結晶能力；肽鏈松散，易被水解；輔酶脫離。蛋白質復性：如果不過于劇烈，變性后的蛋白質可以在一定的條件下恢復其生物活性。②致變因素高溫、振蕩、攪拌、超聲波、X射線、紫外線;重金屬離子、強酸、強堿、尿素，去污劑以及酒精、丙酮等有機溶劑等。（三）蛋白質的分類化學分類簡單蛋白結合蛋白(有非蛋白部分)功能分類結構蛋白功能蛋白（四）蛋白質的顏色反應1.雙縮脲反應肽鍵在堿性溶液中與硫酸銅反應形成紅紫色絡合物。2.酚試劑（福林試劑）反應酪氨酸中的酚基，與磷鉬酸及磷鎢酸反應生成藍色化合物。用于比色法定量測定蛋白質含量。3.米倫氏反應米倫氏試劑為硝酸汞、亞硝酸汞、硝酸和亞硝酸的混合液。含有酪氨酸殘基的蛋白質遇米倫試劑產(chǎn)生白色沉淀，加熱后沉淀變成紅色。4.乙醛酸反應含有色氨酸殘基的蛋白質溶液加入乙醛酸混勻后,徐徐加入濃硫酸,在兩液接觸面處呈現(xiàn)紫紅色環(huán).吲哚基5.蛋白質遇碘呈黃色。（五）蛋白質的相對分子質量測定凝膠過濾層析SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳超速離心法質譜法凝膠過濾層析：

凝膠過濾層析是利用具有多孔網(wǎng)狀結構的顆粒的分子篩作用，根據(jù)被分離樣品中各組分相對分子質量大小的差異進行洗脫分離的一項技術。

在分子篩（凝膠過濾）層析中，小分子物質可進入凝膠顆粒的孔洞中，流經(jīng)路程長，所以流出慢；大分子不能進入凝膠，所以流經(jīng)路程短，流出快。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(簡稱SDS—PAGE)

根據(jù)不同蛋白質分子所帶電荷的差異及分子大小的不同所產(chǎn)生的不同遷移率將蛋白質分離成若干條區(qū)帶。

SDS是一種陰離子表面活性劑，能打斷蛋白質的非共價鍵，并按一定的比例和蛋白質分子結合形成密度相同的短棒狀復合物，使蛋白質帶負電荷的量遠遠超過其本身原有的電荷，