分子生物學技術的分類

PAGEPAGE1分子生物學技術的分類目前，常用的分子生物學技術有如下幾種：PCR-單鏈構象多態(tài)性分析(PCR-singlestrandconformationanalysis,PCR-SSCP)是近年來在基因突變檢測中運用最廣泛的方法之一。PCR-SSCP技術憑借突變可引起單鏈DNA三級構象改變,通過觀察單鏈DNA在非變性聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率漂移來判斷突變。樣品經PCR擴增后，其產物經變性后可以產生2條單鏈，如果存在基因突變，哪怕是一個堿基的異常，單鏈的構象也會發(fā)生變化，正常與突變的DNA單鏈在聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)中，可以顯現(xiàn)出不同的帶型，從而確定野生型和突變型，PCR-SSCP分析的主要優(yōu)點是簡易且敏感性較高。但是該技術不能確定突變的部位和性質。PCR-SSCP突變檢測敏感性隨PCR產物長度的增加而降低，一般用于檢測較小外顯子的突變。有時由于單個核苷酸變化所引起的構象改變很小，用PAGE電泳就可能無法檢出，在PCR產物或待測DNA小于200bp時，PCR-SSCP分析能夠檢測出70%~95%的突變。如果以毛細管電泳代替PAGE，則可大為提高突變檢測的效率。Wallace1997年提出將PCR-SSCP和異源DNA雙鏈分析（heteroduplexanalysis,HA)相結合，稱之為SSCP/HA，部分PCR產物經變性進行SSCP分析以了解是否具有突變，其余PCR產物直接用于電泳，以檢出含有突變的異源DNA雙鏈，電泳凝膠經銀染，單鏈DNA所形成的帶為橘黃或棕色，而雙鏈DNA則表現(xiàn)為灰黑色。該綜合手段可以單鏈構型多態(tài)性和異源雙鏈構型分析兩個不同的層次檢出突變，是一種經濟、迅速的突變檢測手段，但無法提供突變位置的信息。PCR-SSCP有許多改進技術，如RNA單鏈構象多態(tài)性法（PCR-rSSCP）、雙脫氧測序單鏈片段構象多態(tài)分析（PCR-ddF）、限制酶指紋技術(PCR-REF)等。PCR-rSSCP法依據(jù)RNA構象對單個堿基替代更敏感的原理，在PCR引物上加上某類啟動子，通過轉錄的RNA構象體的電泳遷移差異進行突變鑒別。PCR-ddF法把PCR產物轉錄，將轉錄物用反轉錄酶進行Sanger雙脫氧終止測序反應，通過觀察非變性膠上經解鏈處理所產生的單鏈漂移、突變后終止片段的獲得與缺失來判斷突變。PCR-REF法將RFLP和SSCP技術優(yōu)勢組合，將PCR擴增的待測片段用5~6種限制酶依次消化，混合并進行末端標記，最后經變性處理并在非變性凝膠上電泳分離，從而獲得來自片段長度和片段構象的雙重突變信息。變性梯度凝膠電泳(denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)利用由堿基序列所決定的DNA片段溶解度或變性度的差異，達到分離野生型與突變型DNA片段的目的，該手段分辨率達一個堿基。當DNA雙鏈沿變性劑濃度梯度增加的聚丙烯酰胺凝膠遷移時，DNA分子中解鏈溫度（Tm)低的部分逐漸變性解鏈。一般總是錯配堿基部分的異源雙鏈Tm最低，最容易解鏈，其次是富含AT堿基對的部位，富含GC堿基對的部位Tm值較高所以解鏈較難。因此，正常DNA雙鏈和異源雙鏈在梯度變性膠中電泳時，異源雙鏈總是先解鏈。將PCR產生的雙鏈DNA在濃度遞增的尿素和甲酰胺變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，當某一DNA片段遷移到變性劑濃度與其最低Tm相當?shù)奈恢脮r，該片段低溫解鏈部分的雙鏈打開，部分解鏈導致DNA遷移速度明顯下降，觀察樣品的遷移率變化即可判斷是否存在變異。DGGE敏感性高，即便異源雙鏈中僅含一個錯配堿基，在電泳時也可分辨其遷移率的改變。DGGE方法的單堿基突變檢出率在DNA片段長度600bp以內可以達到95%。DGGE的成功有賴于雙鏈DNA內部低溫解鏈部分變性后遷移率的改變。但在相當于最高Tm的變性劑濃度的位置，相應的DNA片段可能全部解鏈，使試驗無法檢出存在于高TmDNA片段中的堿基替換。為了解決此問題，可以在一個PCR引物的5'端設計一段富含GC的尾巴，從而使PCR擴增產物的一端富含GC堿基對，保證了絕大多數(shù)DNA片段不會發(fā)生完全解鏈，在最高變性劑濃度區(qū)域仍然可以分辨出部分解鏈的異源雙鏈，這一改進使DGGE的突變檢出率接近100%，但DGGE只能檢測突變是否存在而不能確定突變的位置。DGGE方法需要設計特定片段最佳的PCR引物以及最佳變性條件，這一過程比較復雜，梯度變性膠的制備需要的設備較昂貴，所以在常規(guī)實驗室不易實施。等位基因特異性擴增法（allele-specificamplificarion,ASA)是基于PCR技術的一種單核苷酸突變檢測法，是分析已知堿基替代或微小片段缺失和插入型突變的常規(guī)技術。在PCR的引物設計中，根據(jù)已知突變位點性質在引物3'端或中間設計一錯配堿基，使之僅能與突變型或野生型基因互補而只擴增突變型或野生型基因。ASA技術只需一步PCR反應，甚至無需電泳和標記技術。因其快速，重復性強，耗資少，無同位素污染以及高效性等特點，將成為有前途的適應于人群大規(guī)模突變篩查的方法。應用該方法最好避免錯配堿基為G:T，這種錯配可能引發(fā)擴增反應?；瘜W裂解錯配堿基法（chemicalcleavagemismatch,CCM)通過化學修飾并切割異源DNA雙鏈中錯配堿基，達到檢測點突變的目的。其原理是末端標記的DNA片段暴露于可以識別并修飾異源雙鏈中錯配堿基的化學試劑中（如錯配的胞嘧啶可被羥胺修飾，錯配的胸腺嘧啶可被四氧化鋨修飾），被修飾的位點隨即可被雜氮環(huán)已烷等化學物質裂解。DNA修飾裂解后，電泳觀察DNA片段長度即可知道突變是否存在。該技術較其他突變檢測系統(tǒng)有更多的優(yōu)越性，可以掃描1~2kb的大片段DNA并在隨后的順序分析中定位突變位點，其效率可達100%。該手段通常首先對目標DNA和野生型DNA進行PCR擴增，然后對野生型DNA擴增片段進行末端標記，標記片段作為探針與目標序列復性形成異源雙鏈，用四氧化鋨（OsO4）或羥胺（hydroxylamine)修飾并用哌啶（piperidine)切割，聚丙烯酰胺電泳分離不同長度的片段。近年來，有人采用碳化二亞胺作為錯配修飾劑，