免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)

免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第1頁經(jīng)典免疫學(xué)方法：一、凝集反應(yīng)（agglutination）細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆粒性抗原與對(duì)應(yīng)抗體結(jié)合后形成凝集團(tuán)塊反應(yīng)。1、直接凝集反應(yīng)2、間接凝集反應(yīng)3.間接凝集抑制反應(yīng)免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第2頁免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第3頁二、沉淀反應(yīng)（precipitation）血清蛋白質(zhì)、細(xì)胞裂解液或組織浸液等可溶性抗原與對(duì)應(yīng)抗體結(jié)合后出現(xiàn)沉淀物反應(yīng)。1、單向免疫擴(kuò)散（singleimmunodiffusion）2、雙向免疫擴(kuò)散（doubleimmunodiffusion）3、免疫電泳（immunoelectrophoresis）4、火箭免疫電泳（rocketimmunoelectrophoresis）5.免疫濁度測(cè)定（immunonephelometry）免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第4頁免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第5頁免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第6頁免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第7頁免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第8頁免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第9頁免疫濁度測(cè)定:可溶性Ag+Ab，二者百分比適當(dāng)時(shí)，在特殊緩沖液中快速形成一定AgAb復(fù)合物，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。透射比濁法散射比濁法速率散射比濁法終點(diǎn)散射比濁法免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第10頁免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第11頁一定要保持抗體過量,以維持抗原－抗體復(fù)合物相對(duì)不溶解性。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第12頁該方法分析范圍主要檢測(cè)是血漿、體液中特定蛋白系列。如Ig、補(bǔ)體、血漿蛋白、炎性反應(yīng)蛋白、一些小分子量治療性藥品濃度等。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第13頁第一節(jié)

免疫學(xué)檢測(cè)常見標(biāo)識(shí)技術(shù)免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第14頁免疫標(biāo)識(shí)技術(shù)（immunolabellingtechnique）指用熒光素、放射性核素、酶、發(fā)光劑或電子致密物質(zhì)（膠體金、鐵蛋白）作為示蹤劑標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行抗原—抗體反應(yīng)。優(yōu)點(diǎn):高靈敏度、特異性、快速，能定性、定量、定位測(cè)定，易于觀察結(jié)果并適合自動(dòng)化檢測(cè)?？傮w分為:免疫組化:定位檢測(cè)組織或細(xì)胞中Ag/Ab免疫測(cè)定:定量檢測(cè)液體標(biāo)本中Ag/Ab也可分為:熒光免疫技術(shù)，放射免疫技術(shù)，酶免疫技術(shù)，化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)及免疫金標(biāo)識(shí)技術(shù)等。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第15頁一、酶免疫技術(shù)基礎(chǔ)原理:以酶標(biāo)識(shí)抗體（或抗原）用于免疫檢測(cè)，經(jīng)過對(duì)應(yīng)底物被酶解后顯色反應(yīng)，對(duì)標(biāo)本中抗原/抗體進(jìn)行定量、定位分析。標(biāo)識(shí)物:酶（催化底物:生物放大作用）特點(diǎn):靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好，酶標(biāo)識(shí)試劑能夠較長(zhǎng)時(shí)間保持穩(wěn)定，檢測(cè)方法簡(jiǎn)便安全易行，輕易與其它技術(shù)偶聯(lián)衍生出適用范圍更廣新方法。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第16頁（一）常見酶和酶作用底物1.辣根過氧化物酶（HRP）HRP起源于植物辣根中，分子量40KD，由主酶（糖蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）組成復(fù)合物。HRP常見底物有：（1）鄰苯二胺（OPD）

OPD顯色后為橙黃色，加入終止液為棕黃色，可溶性產(chǎn)物，應(yīng)用最早，但配成溶液后穩(wěn)定性差，且有潛在致癌性，顯色反應(yīng)需避光。（2）四甲基聯(lián)苯胺（TMB）TMB經(jīng)酶作用呈蘭色，可溶性產(chǎn)物，加酸終止后黃色，穩(wěn)定性好，顯色反應(yīng)無需避光，無致突變作用。應(yīng)用最廣泛。但水溶性差。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第17頁2.堿性磷酸酶（AP）AP從大腸桿菌或小牛腸粘膜中提取，菌源性活力小于小腸粘膜活力。AP價(jià)格較HRP高，穩(wěn)定性差，但敏感度高，空白值低?？纱呋瘜?duì)硝基苯磷酸酯（p-NPP），生成黃色對(duì)硝基酚，NaOH終止后黃色可穩(wěn)定存在一段時(shí)間（405nm）。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第18頁

（二）酶免疫技術(shù)分類酶免疫組化

（EIH）

均相酶免疫測(cè)定（HEI）

酶免疫測(cè)定非均相酶免疫測(cè)定固相酶免疫測(cè)定（EIA）

液相酶免疫測(cè)定（同RIA）免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第19頁（三）酶免疫測(cè)定（EIA）

1.均相酶免疫測(cè)定（HEI）特點(diǎn):僅需將待測(cè)樣品、酶標(biāo)試劑和底物溶液混合，待抗原抗體反應(yīng)完成即可直接測(cè)定結(jié)果，整個(gè)檢測(cè)過程都在均勻液相中進(jìn)行。以酶放大免疫測(cè)定技術(shù)（EMIT）為例:

免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第20頁2.非均相酶免疫測(cè)定（1）液相酶免疫測(cè)定（液相EIA）:同RIA:抗原、酶標(biāo)抗原、抗體相繼加入后，使反應(yīng)到達(dá)平衡，再加分離劑。（2）固相酶免疫測(cè)定（固相EIA）:AgAb反應(yīng)在固相載體表面進(jìn)行，應(yīng)用最廣泛是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzymelinkedimmunosorbentassay——ELISA）免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第21頁1）ELISA基礎(chǔ)原理將抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面,并保持其免疫活性?？乖蚩贵w與酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體,仍分別保持其免疫活性和酶活性。在固相載體上按照一定步驟加入待測(cè)抗原或抗體及酶標(biāo)抗體或酶標(biāo)抗原,洗去未結(jié)合游離物質(zhì),加入酶底物顯色,顏色深淺與待測(cè)物質(zhì)含量呈相關(guān)性。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第22頁2）固相載體種類A、塑料制品聚苯乙烯：蛋白質(zhì)非共價(jià)鍵或物理吸附結(jié)合到載體表面，可制成小試管、小珠、微量反應(yīng)板形式

專用于ELISA微量反應(yīng)板——ELISA板（812=96孔）B、微顆粒高分子單體聚合成微球或顆粒，帶有能與蛋白質(zhì)結(jié)合功效基團(tuán)，易于化學(xué)偶聯(lián)，結(jié)合容量大。反應(yīng)時(shí)可均勻分散到整個(gè)反應(yīng)溶液中，反應(yīng)速度快。其中可包裹磁性物質(zhì)，制成磁化微顆粒，使分離可在磁板中完成，自動(dòng)化分析。C.膜載體NC膜（硝酸纖維素膜）、玻璃纖維素膜、尼龍膜等微孔濾膜。非共價(jià)鍵吸附Ab/Ag，吸附能力強(qiáng)。廣泛應(yīng)用于斑點(diǎn)-ELISA等。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第23頁3）ELISA方法類型及反應(yīng)原理A.雙抗體夾心法此法是檢測(cè)大分子抗原常見方法。上述方法亦可改為雙位點(diǎn)一步法,使用針反抗原分子上兩個(gè)不一樣表位單克隆抗體,分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體。注意鉤狀效應(yīng)。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第24頁B.間接法此法是測(cè)定抗體常見方法。能夠用一個(gè)酶標(biāo)抗抗體檢測(cè)各種抗體。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第25頁免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第26頁C.競(jìng)爭(zhēng)結(jié)正當(dāng)可用于測(cè)定小分子抗原或半抗原及抗體。以檢測(cè)抗原為例，待測(cè)抗原和酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合，結(jié)合于固相酶標(biāo)抗原量與標(biāo)本中待測(cè)抗原含量呈反比。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第27頁D.捕捉法——最常見于檢測(cè)IgM抗體

包被抗人IgM鏈+待測(cè)標(biāo)本IgM類抗體全被固相抗體捕捉洗滌+特異性抗原（針對(duì)待測(cè)IgM對(duì)應(yīng)抗原）與固相上特異性IgM結(jié)合+酶標(biāo)抗體（針對(duì)特異性Ag）+底物顯色顯色表示有特異性IgM。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第28頁E、BAS-ELISA生物素（B）-親和素（A）系統(tǒng)（biotinavidinsystem,BAS）是以生物素和親和素含有獨(dú)特結(jié)合特征為基礎(chǔ),它們結(jié)合快速、專一、穩(wěn)定,并含有多級(jí)放大效應(yīng)。應(yīng)用生物素親和素放大系統(tǒng)ELISA,使反應(yīng)信號(hào)放大,檢測(cè)靈敏度提升。

免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第29頁1個(gè)親和素（鏈霉親和素）可結(jié)合四個(gè)生物素衍化物1個(gè)抗體可結(jié)合多個(gè)B,與蛋白質(zhì)-NH2結(jié)合形成肽鍵,-NH2越多,標(biāo)識(shí)B越多。E

BAg?

E—B—A—B—EBAbB

BB

EE—B—A—B—E免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第30頁BAS-ELISA包含:

ABC-ELISA（間接法、雙抗體夾心法）

BA-ELISA（間接法、雙抗體夾心法）

BAB-ELISA（間接法、雙抗體夾心法）

比如:BAB-ELISA（雙抗體夾心法）:

固相Ab+待檢Ag+（Ab-B）+A+B-E+底物顯色免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第31頁ABC-ELISA（間接法、雙抗體夾心法）免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第32頁（四）酶免疫組化（EIH）原理:以酶標(biāo)識(shí)抗體與用于對(duì)應(yīng)抗原反應(yīng)，經(jīng)過底物被酶解顯色以示蹤抗原-抗體結(jié)合物存在部位。酶免疫組化染色標(biāo)本可在普通光學(xué)顯微鏡下觀察，并能長(zhǎng)久保留。另外，作為辣根過氧化物酶底物二氨基聯(lián)苯胺（DAB），其分解產(chǎn)物為不溶性，適于鏡下觀察。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第33頁1、直接法組織標(biāo)本待測(cè)抗原+酶標(biāo)識(shí)抗體——DAB顯色2.間接法組織標(biāo)本待測(cè)抗原+Ab1+酶標(biāo)-二抗使用一個(gè)酶標(biāo)抗體可檢測(cè)各種抗原。敏感性較直接法高，但低于PAP法。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第34頁3.生物素-親和素法將親和素（A）與生物素（B）系統(tǒng)應(yīng)用于酶免疫組化包含：ABC法（直接法、間接法）BAB法（直接法、間接法）BA法（直接法、間接法）免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第35頁3.

1）ABC法直接ABC法:玻片Ag+B·AbAg-Ab·BABCAg-Ab·B-AB*C特點(diǎn):將BAB法中A先與B·E結(jié)合，制備成復(fù)合物ABC間接ABC法:用生物素化第二抗體與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合玻片Ag+Ab1Ag-Ab1B·Ab2Ag-Ab1-Ab2·BABCAg-Ab1-Ab2·B-AB*C免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第36頁2）BAB法（橋聯(lián)親合素-標(biāo)識(shí)生物素法—BRAB）直接BAB法:組織切片或細(xì)胞涂片Ag+B·AbAg-Ab·BAAg-Ab·B-AB·EAg-Ab·B-A-B·E特點(diǎn):以游離A分別連接B·Ab和B·E間接BAB法:用生物素化第二抗體與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合組織切片或細(xì)胞涂片Ag+Ab1Ag-Ab1B·Ab2Ag-Ab1-Ab2·BAAg-Ab1-Ab2·B-AB·EAg-Ab1-Ab2·B-A-B·E免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第37頁3）BA法（標(biāo)識(shí)親合素-生物素法——LAB法）直接BA（或LAB）法玻片Ag+B·AbAg-Ab·BA·EAg-Ab·B-A·E特點(diǎn):以A·E/SA·E代替BAB法中A，省卻了加B·E步驟間接BA（或LAB）法:用生物素化第二抗體與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合玻片Ag+Ab1Ag-Ab1B·Ab2Ag-Ab1-Ab2·BA·EAg-Ab1-Ab2·B-A·E免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第38頁

BAS試驗(yàn)方法及反應(yīng)層次

方法反應(yīng)層次

直接法BAAg—(Ab-B)—A*BABAg—(Ab-B)—A—B*ABCAg—(Ab-B)—AB*C

間接法BAAg—Ab1—(Ab2-B)—A*

BABAg—Ab1—(Ab2-B)—A—B*

ABCAg—Ab1—(Ab2-B)—AB*C

Ag抗原；Ab-B生物素化抗體；

A親合素；A*標(biāo)識(shí)親合素；

B生物素；B*標(biāo)識(shí)生物素；

Ab1第一抗體；Ab2第二抗體;Ab2-B生物素化第二抗體免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第39頁4.過氧化物酶-抗過氧化物酶（peroxidaseanti-peroxidasecomplex，PAP）法和堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶（alkalinephosphatase-antialkalinephosphatase，APAAP）法原理：應(yīng)用抗酶抗體與酶結(jié)合，形成可溶性、穩(wěn)定酶-抗酶抗體復(fù)合物。此法優(yōu)點(diǎn)是：未經(jīng)化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)，故防止了抗體和酶活性降低，并省去酶標(biāo)識(shí)抗體需純化繁復(fù)過程。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第40頁二、熒光免疫技術(shù)（fluoroimmunoassay）原理:以熒光素標(biāo)識(shí)抗體或抗原，用于對(duì)應(yīng)抗原或抗體分析判定。熒光免疫技術(shù)分為:免疫熒光顯微技術(shù)（熒光免疫組化）:用熒光抗體對(duì)細(xì)胞、組織切片或其它標(biāo)本中抗原（或抗體）進(jìn)行判定和定位檢測(cè)，可在熒光顯微鏡下直接觀察試驗(yàn)結(jié)果，流式細(xì)胞術(shù):進(jìn)行自動(dòng)分析檢測(cè)熒光免疫測(cè)定:用于檢測(cè)體液標(biāo)本中抗原或抗體。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第41頁（一）常見熒光色素1、異硫氰酸熒光素（FITC）

橙黃色/黃色粉末，發(fā)出黃綠色熒光。最大吸收峰490—495nm，最大發(fā)射峰520—530nm，含異硫氰基N=C=S。應(yīng)用最多熒光素。2、四乙基羅丹明（RB200）

橘紅色粉末，發(fā)出橘紅色或橙色熒光。最大吸收峰570nm，最大發(fā)射峰595—600nm。含磺酸基。與FITC做雙標(biāo)識(shí)或?qū)Ρ热旧?.藻紅蛋白（R-RE）發(fā)出橙色熒光，最大吸收峰565nm，最大發(fā)射峰575nm，可與FITC共用488nm激發(fā)光，可用于流式細(xì)胞儀雙標(biāo)識(shí)。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第42頁（二）免疫熒光顯微技術(shù)1.方法及原理1）直接法應(yīng)用特異性熒光抗體直接檢驗(yàn)標(biāo)本中對(duì)應(yīng)抗原。2）間接法以特異性抗體（或待測(cè)抗體）為第一抗體，以熒光素標(biāo)識(shí)抗球蛋白抗體（標(biāo)識(shí)抗抗體）為第二抗體，用于檢測(cè)抗原或抗體。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第43頁3）補(bǔ)體法此法是在間接法第一步抗原-抗體反應(yīng)加入補(bǔ)體,使之與抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合；再用熒光素標(biāo)識(shí)抗補(bǔ)體抗體進(jìn)行示蹤。4）雙標(biāo)識(shí)法此法用異硫氰酸熒光素（FITC）及羅丹明（TRITC）分別標(biāo)識(shí)不一樣抗體,進(jìn)行同一標(biāo)本熒光染色,若有兩種對(duì)應(yīng)抗原存在,可同時(shí)見兩種（橙紅、黃綠）熒光。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第44頁2.熒光顯微鏡檢驗(yàn)1）染色標(biāo)本盡可能馬上觀察結(jié)果。2）鏡下觀察時(shí)同一標(biāo)本區(qū)觀察時(shí)間不易過長(zhǎng)。3）通風(fēng)很好暗室中進(jìn)行。4）油鏡檢驗(yàn)時(shí)用無熒光鏡油，先觀察對(duì)照，再對(duì)待測(cè)標(biāo)本。

免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第45頁（三）流式細(xì)胞術(shù)（FCM）FCM是將免疫熒光技術(shù)應(yīng)用于流式細(xì)胞儀，對(duì)單個(gè)細(xì)胞表面標(biāo)志（抗原或受體）進(jìn)行快速、準(zhǔn)確分析和自動(dòng)檢測(cè)，并可對(duì)不一樣類型細(xì)胞進(jìn)行分選和搜集。FCM還可對(duì)同一細(xì)胞各種參數(shù)（如DNA.RNA.蛋白質(zhì)和細(xì)胞體積等）進(jìn)行多信息分析，故成為當(dāng)代生命科學(xué)研究領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用一項(xiàng)新技術(shù)。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第46頁1.基礎(chǔ)概念與原理FCM是一個(gè)分析單個(gè)微粒（如細(xì)胞、微生物和人工合成微球等）物理和化學(xué)特征技術(shù)，其特點(diǎn)是快速、準(zhǔn)確、客觀，能定量。FCM原理：懸浮在液體中分散細(xì)胞單個(gè)地依次經(jīng)過測(cè)量區(qū)時(shí)產(chǎn)生電信號(hào)，從而可快速對(duì)大量細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)檢測(cè)和分析，并可從整個(gè)群體中分選出特定細(xì)胞亞群。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第47頁免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第48頁2.流式細(xì)胞術(shù)在免疫細(xì)胞研究中應(yīng)用1）細(xì)胞表型分析表型分析可用于免疫細(xì)胞判定、計(jì)數(shù)和功效評(píng)價(jià)。2）細(xì)胞功效檢測(cè)（1）細(xì)胞功效狀態(tài)和活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)：包含檢測(cè)胞內(nèi)鈣離子濃度、蛋白磷酸化、蛋白激酶活性狀態(tài)、信息傳遞相關(guān)蛋白表示及相互作用等。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第49頁（2）細(xì)胞增殖:應(yīng)用活細(xì)胞染料5’-二醋酸羧基熒光素琥珀酸單胞菌酯（5’-carboxyfluoresceindiacetatesuccinimidylester，CFSE）作為標(biāo)識(shí)物，建立了檢測(cè)細(xì)胞增殖新技術(shù)。原理:CFSE能自動(dòng)穿過胞膜，與胞內(nèi)蛋白賴氨酸不可逆結(jié)合，并隨細(xì)胞分裂而倍減，借助FCM檢測(cè)熒光強(qiáng)度，可判斷細(xì)胞增殖狀態(tài)。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第50頁（3）細(xì)胞分化:借助胞內(nèi)細(xì)胞因子染色（intracelluarcytokinestaining，ICCS），可應(yīng)用FCM檢測(cè)單細(xì)胞產(chǎn)生和分泌CK，從而判斷單一細(xì)胞亞群分化和功效狀態(tài)。原理:應(yīng)用蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑使胞內(nèi)合成CK滯留在高爾基體；應(yīng)用透膜劑（saponin）使熒光標(biāo)識(shí)抗體可逆性穿透胞膜，以進(jìn)行胞內(nèi)染色。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第51頁（4）細(xì)胞毒效應(yīng):經(jīng)過檢測(cè)一些效應(yīng)分子（FasL、穿孔素和顆粒酶等）可判斷細(xì)胞毒效應(yīng)。（5）細(xì)胞凋亡:見下文。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第52頁（四）熒光免疫測(cè)定（FIA）1.熒光偏振免疫測(cè)定（FPIA）該法主要用于小分子物質(zhì)（尤其是藥品濃度）測(cè)定。原理：熒光素標(biāo)識(shí)已知抗原+待測(cè)抗原+抗體——形成標(biāo)識(shí)抗原抗體復(fù)合物，因?yàn)槠浞肿恿看?，旋轉(zhuǎn)慢，在激發(fā)光照射下，吸收偏振光多，發(fā)出偏振熒光強(qiáng)，小分子游離標(biāo)識(shí)抗原旋轉(zhuǎn)快，其偏振熒光弱。所以，標(biāo)本中抗原濃度越高，形成標(biāo)識(shí)抗原抗體復(fù)合物越少，發(fā)出偏振熒光越弱。反之，發(fā)出偏振熒光越強(qiáng)。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第53頁2.時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定（TR-FIA）原理：應(yīng)用含有較長(zhǎng)熒光壽命鑭系螯合物（如銪）標(biāo)識(shí)抗原或抗體，并利用時(shí)間分辨熒光分析儀延緩測(cè)量時(shí)間，有效消除非特異性本底熒光干擾，所得信號(hào)完全是鑭系螯合物發(fā)射特異熒光，從而最大程度提升測(cè)定方法靈敏度和特異性。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第54頁免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第55頁3.酶免疫熒光測(cè)定（ELFIA）原理：應(yīng)用含有潛在熒光物質(zhì)作為酶底物，經(jīng)過酶解反應(yīng)產(chǎn)生高強(qiáng)度熒光，可用熒光測(cè)量?jī)x進(jìn)行定量測(cè)定。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第56頁三、放射免疫技術(shù)是以放射性核素作為示蹤劑標(biāo)識(shí)免疫測(cè)定方法,其特點(diǎn)是將核素分析高靈敏度與抗原-抗體反應(yīng)特異性相結(jié)合。廣泛應(yīng)用于各種微量蛋白質(zhì)、激素、小分子藥品和腫瘤標(biāo)志物定量分析,對(duì)相關(guān)學(xué)科發(fā)展起到了極大推進(jìn)作用。包含放射免疫測(cè)定（RIA）和免疫放射測(cè)定（IRMA）免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第57頁（一）常見放射性核素射線：131I、125I、51Cr、60Co射線：14C.3H、32P射線半衰期長(zhǎng)，易造成對(duì)環(huán)境污染，比活性差，需液體閃爍儀。普通不用。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第58頁（二）放射免疫測(cè)定（RIA）1.RIA基礎(chǔ)原理以放射性核素標(biāo)識(shí)抗原（Ag*）和檢品中待測(cè)未標(biāo)識(shí)抗原（Ag）與固定量特異性抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)。若Ag*和Ab量固定，二者結(jié)合所形成Ag*-Ab復(fù)合物受Ag含量制約。若反應(yīng)系統(tǒng)中Ag含量高，其對(duì)Ab競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合能力即強(qiáng)，Ag-Ab復(fù)合物生成量增加，Ag*-Ab復(fù)合物則相對(duì)降低。所以，Ag*Ab復(fù)合物形成量與Ag含量間呈一定負(fù)相關(guān)函數(shù)關(guān)系。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第59頁Ag*+Ab

Ag*Ab+Ag*

+

Ag

AgAb+Ag

BFB0T

免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第60頁2、RIA測(cè)定方法1）AgAb反應(yīng)2）B.F分離加入PR試劑（二抗和PEG混合物，也可制成固相二抗（二抗與顆粒固相物連接）Ag*Ab1+Ab2——Ag*Ab1-Ab23）放射性強(qiáng)度測(cè)定

——計(jì)數(shù)儀測(cè)上清/沉淀cpm，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線（B/（B+F），B/F，B/B0）。亦可用計(jì)算機(jī)處理。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第61頁（三）免疫放射測(cè)定（IRMA）1、單位點(diǎn)IRMA是將待測(cè)抗原與過量標(biāo)識(shí)抗體直接反應(yīng)，然后加入固相抗原免疫吸附劑與游離標(biāo)識(shí)抗體結(jié)合經(jīng)離心去除沉淀物，測(cè)定上清液放射性強(qiáng)度，從而推算出檢品中待測(cè)抗原含量。2.雙位點(diǎn)IRMA測(cè)定固相上cpm數(shù)免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第62頁四、化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)是將發(fā)光技術(shù)與免疫反應(yīng)和計(jì)算機(jī)技術(shù)結(jié)合自動(dòng)化儀器分析技術(shù),當(dāng)前已趨替換RIA而成為免疫檢測(cè)廣泛采取分析技術(shù)?？捎糜诙囗?xiàng)指標(biāo)檢測(cè)?？蓽y(cè)定內(nèi)分泌激素類、腫瘤標(biāo)志物類、心肌標(biāo)志物類、病毒標(biāo)志物類、治療性藥品濃度、骨代謝指標(biāo)和貧血類等方面檢測(cè)。

免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第63頁（一）化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定（CLIA）CLIA是以化學(xué)發(fā)光劑（如魯米諾、吖啶酯等）標(biāo)識(shí)抗體或抗原,免疫反應(yīng)完成后,直接引發(fā)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第64頁（二）化學(xué)發(fā)光酶免疫測(cè)定（CLEIA）CLEIA抗原-抗體反應(yīng)步驟與酶免疫測(cè)定相同,僅酶促反應(yīng)所用底物為發(fā)光劑,經(jīng)過化學(xué)發(fā)光反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第65頁（三）電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定（ECLIA）

ECLIA實(shí)際上是在電極表面由電化學(xué)引發(fā)特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。三聯(lián)吡啶釕RU(bpy)32+三丙胺（TPA）.免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第66頁電化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第67頁電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定示意圖免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第68頁五、免疫金標(biāo)識(shí)技術(shù)（immunogoldlabellingtechnique）氯金酸（HAuCl4）在還原劑（枸櫞酸三鈉）作用下被還原成原子金,聚合成特定大小金顆粒懸液,并因?yàn)殪o電作用成為一個(gè)穩(wěn)定膠體狀態(tài)——膠體金。是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物,應(yīng)用于抗原-抗體反應(yīng)。膠體金含有高電子密度,最初主要用于免疫電鏡技術(shù),以后其應(yīng)用范圍逐步擴(kuò)展。在免疫組化方面,膠體金標(biāo)識(shí)抗體可直接用于檢測(cè)細(xì)胞表面和組織切片中抗原或受體,并可在普通光學(xué)顯微鏡下觀察。在流式細(xì)胞術(shù)中,膠體金可作為多參細(xì)胞分析和分選有效標(biāo)識(shí)物。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第69頁常見方法：1.免疫金（銀）染色法（IGS/IGSS）組織切片（抗原）+特異性抗體+膠體金標(biāo)記二抗+銀顯影劑，標(biāo)識(shí)物上金顆粒催化硝酸銀離子還原成銀顆粒，在抗原抗體復(fù)合物上形成黑色“銀殼”，使Ag位置放大，從而提高了鏡下可見度。

免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第70頁用NC膜或微孔濾膜為載體吸附抗原,用膠體金標(biāo)識(shí)抗體代替酶標(biāo)抗體。2.斑點(diǎn)免疫層析試驗(yàn)（DICA）免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第71頁六、免疫印跡技術(shù)（immunoblotting）又稱為Western-blotting,是將凝膠電泳高分辨力與固相免疫測(cè)定結(jié)合起來一個(gè)方法。由十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印和固相膜免疫測(cè)定三項(xiàng)技術(shù)結(jié)合而成。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第72頁七、免疫PCR（immuno-PCR，IM-PCR）是將免疫學(xué)反應(yīng)和PCR技術(shù)相結(jié)合而創(chuàng)建一個(gè)新檢測(cè)技術(shù)，含有抗原、抗體反應(yīng)特異性和PCR技術(shù)高效性?；A(chǔ)原理:用一段已知DNA分子作為標(biāo)識(shí)物，結(jié)合一抗或二抗后去檢測(cè)對(duì)應(yīng)抗原或抗體，再用PCR法擴(kuò)增該DNA分子，擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖電泳定性，依據(jù)該DNA分子存在是否，確定檢測(cè)結(jié)果。該方法與ELISA原理類似，不一樣是以DNA分子作為標(biāo)識(shí)物。免疫PCR可采取直接法、間接法和雙抗體夾心法。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第73頁免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第74頁八、細(xì)胞凋亡檢測(cè)技術(shù)（一）形態(tài)學(xué)檢測(cè)①應(yīng)用電子顯微鏡或普通光學(xué)顯微鏡直接觀察細(xì)胞大小、凋亡小體和其它凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變；②應(yīng)用一些可直接、間接產(chǎn)生熒光染料[如雙苯并咪唑（HO）、碘化丙啶（PI）、AnnexinV等]使細(xì)胞著染,借助熒光顯微鏡區(qū)分凋亡細(xì)胞、壞死細(xì)胞和正常細(xì)胞。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第75頁（二）生物化學(xué)檢測(cè)方法凋亡細(xì)胞染色質(zhì)DNA在核小體單位間連接處斷裂，形成180~200bp整數(shù)倍寡核苷酸片段，在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜（DNAladder）。（三）免疫學(xué)檢測(cè)方法原理:凋亡細(xì)胞染色質(zhì)DNA斷裂而產(chǎn)生核小體DNA，可與組蛋白結(jié)合為復(fù)合物。應(yīng)用抗組蛋白和抗DNA單抗，借助ELISA方法可測(cè)定細(xì)胞凋亡。該技術(shù)優(yōu)點(diǎn)是:①可用于檢測(cè)不一樣培養(yǎng)細(xì)胞株或不一樣動(dòng)物起源細(xì)胞凋亡；②靈敏度高，且可檢測(cè)早期細(xì)胞凋亡。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第76頁（四）分子生物學(xué)檢測(cè)方法常見技術(shù)為脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)缺口末端標(biāo)識(shí)法（TUNEL），原理:凋亡細(xì)胞DNA鏈發(fā)生斷裂而暴露3’-OH末端，可借助末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）將脫氧核糖核酸與熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成衍生物標(biāo)識(shí)到DNA3’-OH末端，從而檢測(cè)細(xì)胞凋亡。TUNEL法優(yōu)點(diǎn)是:能對(duì)完整單個(gè)凋亡細(xì)胞或凋亡小體進(jìn)行原位染色；適合用于不一樣本檢測(cè)；靈敏度遠(yuǎn)比普通組織化學(xué)和生化測(cè)定法高。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第77頁免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第78頁（五）流式細(xì)胞術(shù)1.亞“G1”峰檢測(cè)法處于增殖周期細(xì)胞，其在不一樣周期時(shí)相（Go/G1.S、G2/M）DNA含量為2n~4n。凋亡細(xì)胞核內(nèi)DNA裂解成小片段，應(yīng)用胞膜通透劑可使小分子量DNA片段穿過胞膜而丟失，僅剩大片段DNA，這些失去個(gè)別DNA細(xì)胞，染色后形成一個(gè)DNA含量＜2n（即＜G1期細(xì)胞）分布區(qū)，稱為“亞G1峰”。該技術(shù)缺點(diǎn)為：不能反應(yīng)發(fā)生于G1峰后S期和G2期細(xì)胞凋亡；不能區(qū)分死細(xì)胞和活細(xì)胞。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第79頁2、HO/PI染色法原理：HO被活細(xì)胞攝取，與DNA結(jié)合后在紫外光下呈藍(lán)色熒光；PI使死細(xì)胞著染，產(chǎn)生紅色熒光。依據(jù)兩種熒光所形成細(xì)胞二維直方圖，可分辨正?；罴?xì)胞、凋亡細(xì)胞和死細(xì)胞。3.Annexin法應(yīng)用AnnexinV，AnnexinV是一個(gè)Ca2+依賴磷脂結(jié)合蛋白，含有易于結(jié)合到磷脂類如PS（磷脂酰絲氨酸）特征。對(duì)PS有高度親和性。借助FCM可定量分析被標(biāo)識(shí)凋亡與壞死細(xì)胞數(shù)。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第80頁4.caspase活性檢測(cè)caspase（胱天蛋白酶）水平及活性升高乃細(xì)胞凋亡標(biāo)志，并反應(yīng)效應(yīng)細(xì)胞細(xì)胞毒活性。應(yīng)用能透過胞膜caspase熒光底物，其被酶切后釋放熒光基團(tuán)，借助FCM檢測(cè)所釋放熒光強(qiáng)度，可推斷caspase活性。該法優(yōu)點(diǎn)為：可在單細(xì)胞水平反抗原特異性T細(xì)胞細(xì)胞毒作用進(jìn)行可視化和數(shù)量化分析。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第81頁第二節(jié)

免疫分子檢測(cè)免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第82頁一、免疫球蛋白測(cè)定檢測(cè)IgG、IgA.IgM含量常見單向免疫擴(kuò)散法、火箭免疫電泳法、免疫比濁法以及免疫化學(xué)自動(dòng)分析儀。血清中IgE和IgD含量很低，須用RIA.ELISA.RAST等靈敏度較高方法測(cè)定。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第83頁二、補(bǔ)體測(cè)定（一）血清總補(bǔ)體活性測(cè)定原理:應(yīng)用家兔抗SRBC抗體致敏SRBC作為抗原-抗體復(fù)合物，激活待測(cè)血清中補(bǔ)體經(jīng)典路徑，造成SRBC溶解；若待測(cè)血清樣品中補(bǔ)體含量降低或某種補(bǔ)體成份缺失，可影響此種溶血反應(yīng)。通常以50%溶血作為判定反應(yīng)結(jié)果終點(diǎn)，故稱為50%溶血試驗(yàn)（50%complementhemolysis，CH50）。依據(jù)引發(fā)50%溶血所需最小補(bǔ)體量，計(jì)算血清總補(bǔ)體活性。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第84頁（二）血清補(bǔ)體旁路路徑活性測(cè)定原理：家兔紅細(xì)胞（RRBC）可直接激活人B因子，引發(fā)補(bǔ)體旁路路徑活化，造成RRBC溶解。（三）補(bǔ)體各成份測(cè)定1、免疫溶血法該法可用于C4.C2及B因子測(cè)定。以抗體致敏SRBC作為指示系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。2、免疫化學(xué)法常見方法有單向免疫擴(kuò)散法、火箭免疫電泳法、免疫比濁法、ELISA及RIA等。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第85頁三、細(xì)胞因子及其受體檢測(cè)（一）生物學(xué)檢測(cè)法原理為:依據(jù)CK特定生物學(xué)活性，采取對(duì)應(yīng)指示系統(tǒng)（如各種依賴性細(xì)胞株或靶細(xì)胞），經(jīng)過與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比，判斷樣品中細(xì)胞因子活性水平，普通以活性單位（U/ml）表示?？煞譃榇龠M(jìn)細(xì)胞增殖或增殖抑制法、集落形成法、細(xì)胞毒活性測(cè)定法、細(xì)胞病變抑制法、趨化活性測(cè)定法等。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第86頁生物學(xué)檢測(cè)法優(yōu)點(diǎn):靈敏度高（達(dá)pg水平），并能直接顯示CK生物活性。生物學(xué)檢測(cè)法缺點(diǎn):各種CK可能含有相同功效，故干擾原因較多；一些抑制因子可降低CK活性；一些細(xì)胞同時(shí)表示CK受體，其與CK結(jié)合將影響生物學(xué)活性檢測(cè)結(jié)果。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第87頁（二）免疫學(xué)檢測(cè)法1.體液中CK檢測(cè)幾乎全部CK均可借助免疫學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)。常見方法包含ELISA（雙抗體夾心法或競(jìng)爭(zhēng)法）、RIA及免疫印跡法等。一些細(xì)胞因子含量甚微樣品（如腦脊液）可用免疫PCR（immuno-PCR）進(jìn)行檢測(cè)，極大地提升檢測(cè)靈敏度（可達(dá)1012mol/L）。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第88頁2.單個(gè)細(xì)胞分泌CK檢測(cè)（1）反向溶血空斑試驗(yàn)（reversedhemolyticplaqueassay，RHPA）RHPA是一個(gè)體外檢測(cè)抗體分泌細(xì)胞試驗(yàn)。亦可將其用于測(cè)定CK分泌細(xì)胞。原理：待測(cè)CK分泌細(xì)胞+抗CK抗體+SPA-SRBC+補(bǔ)體，4種成份與瓊脂糖凝膠混勻，注入小室內(nèi)；反應(yīng)后造成SRBC溶解，在CK分泌細(xì)胞周圍形成溶血空斑，每個(gè)空斑代表一個(gè)CK分泌細(xì)胞，空斑大小與細(xì)胞所分泌CK量成正比。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第89頁（2）酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（ELISPOT）原理:抗CK抗體包被固相載體+待測(cè)分泌CK細(xì)胞+結(jié)合后洗去細(xì)胞+酶標(biāo)抗CK抗體+底物，顯色反應(yīng)深淺測(cè)定結(jié)合在固相載體上CK量，并可在光鏡下觀察分泌CK細(xì)胞。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第90頁免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第91頁3.細(xì)胞內(nèi)CK檢測(cè)采取FCM免疫熒光技術(shù)可從單細(xì)胞水平檢測(cè)不一樣細(xì)胞亞群中CK，用不一樣顏色熒光標(biāo)識(shí)抗CK抗體可在同一細(xì)胞內(nèi)同時(shí)測(cè)定兩種不一樣CK。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第92頁免疫學(xué)檢測(cè)法優(yōu)點(diǎn):①特異性強(qiáng)，可測(cè)出單一細(xì)胞因子含量；②方法簡(jiǎn)便，無須細(xì)胞培養(yǎng)，便于大量樣品檢測(cè)；③試驗(yàn)流程短，方法易標(biāo)準(zhǔn)化，重復(fù)性好免疫學(xué)檢測(cè)法缺點(diǎn):①免疫學(xué)方法所檢出細(xì)胞因子含量，與該因子生物活性并非必定平行；②不一樣單抗所識(shí)別細(xì)胞因子表位和親和力不一樣，所測(cè)結(jié)果可出現(xiàn)差異。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第93頁（三）分子生物學(xué)檢測(cè)法應(yīng)用細(xì)胞因子cDNA探針或寡核苷酸探針,經(jīng)放射性核素（32P或35P）、生物素或地高辛標(biāo)識(shí),與提取細(xì)胞因子mRNA進(jìn)行雜交（Northernblot）；亦可在細(xì)胞或組織切片上進(jìn)行原位雜交分析；若同時(shí)結(jié)合免疫組化技術(shù),還可判定表示細(xì)胞因子基因細(xì)胞類型。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第94頁分子生物學(xué)檢測(cè)法優(yōu)點(diǎn):特異性高。分子生物學(xué)檢測(cè)法缺點(diǎn):僅能檢測(cè)CK基因表示情況，不能直接提供CK含量及生物活性等信息，故此法主要用于研究CK基因表示與調(diào)控。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第95頁四、黏附分子檢測(cè)（一）細(xì)胞膜表面AM檢測(cè)1、間接免疫熒光法——組織細(xì)胞表面AM組織切片標(biāo)本+抗AM單抗+羊抗小鼠IgG熒光抗體，進(jìn)行間接免疫熒光染色，借助熒光顯微鏡觀察表示AM陽性細(xì)胞數(shù)。2、間接酶免疫組化法——組織細(xì)胞表面AM組織切片標(biāo)本+抗AM單抗+羊抗小鼠IgG酶標(biāo)抗體，加入酶底物顯色，顯微鏡觀察表示AM陽性細(xì)胞數(shù)。3.流式細(xì)胞術(shù)——內(nèi)皮、淋巴細(xì)胞等表面AM待檢細(xì)胞懸液+兩種熒光素標(biāo)識(shí)單抗，在流式細(xì)胞儀上可同時(shí)檢測(cè)胞膜表面兩種不一樣AM。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第96頁（二）可溶性AM測(cè)定1、ELISA雙抗體夾心：最常見于檢測(cè)選擇素家族和免疫球蛋白超家族組員。2、其它免疫測(cè)定方法：RIA或IRMA.化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定、時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定方法等免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第97頁第三節(jié)

免疫細(xì)胞檢測(cè)一、免疫細(xì)胞分離與純化（一）白細(xì)胞分離1、自然沉降法2.高分子聚合物加速沉降法免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第98頁（二）外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）分離1、聚蔗糖-泛影葡胺（ficoll-hypaque，F(xiàn)-H）密度梯度離心法2.Percoll密度梯度離心法（連續(xù)和不連續(xù)）免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第99頁（三）淋巴細(xì)胞純化與亞群分離1、去除紅細(xì)胞普通采取無菌蒸餾水低滲裂解法或0.83%氯化銨處理法。2.去除血小板離心洗滌或胎牛血清（FCS）梯度離心法，因FCS可讓單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)過，而阻止血小板經(jīng)過。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第100頁3.去除單核細(xì)胞和粒細(xì)胞（1）黏附法玻璃纖維或葡聚糖凝膠SephadexG-10柱，清除發(fā)生黏附細(xì)胞（2）羰基鐵粉吞噬法單核細(xì)胞吞噬羰基鐵粉后，用磁鐵將細(xì)胞吸至管底（3）苯丙氨酸甲酯法苯丙氨酸甲酯含有親溶酶體性質(zhì)，用該法可溶解含溶酶體細(xì)胞（如單核、粒細(xì)胞等）。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第101頁4.淋巴細(xì)胞亞群分離（1）E花環(huán)分離法T細(xì)胞表示SRBC受體，能與SRBC結(jié)合形成E花環(huán)，而B細(xì)胞則不能。經(jīng)聚蔗糖-泛影葡胺分層液密度梯度離心，可將T、B細(xì)胞分離。（2）尼龍棉柱分離法B細(xì)胞易黏附于尼龍棉纖維（聚酰胺纖維）表面，而T細(xì)胞則不易黏附，借此可將T細(xì)胞與B細(xì)胞分離。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第102頁（3）親和板結(jié)合分離法（洗淘法）直接結(jié)正當(dāng):抗體包被塑料平皿或細(xì)胞培養(yǎng)瓶（板）+細(xì)胞，吸附表示特定抗原細(xì)胞。間接結(jié)正當(dāng):包被抗小鼠IgG抗體（第二抗體）+與單抗結(jié)合淋巴細(xì)胞，被吸附固定而分離。特異性抗原（配體）包被+表示對(duì)應(yīng)受體細(xì)胞，該細(xì)胞被分離。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第103頁優(yōu)點(diǎn):可同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞陽性分選和陰性分選，且所獲細(xì)胞量較大。缺點(diǎn):親和板結(jié)合分離法普通適合進(jìn)行陰性分選。另外，包被抗體宜采取不含F(xiàn)c段（Fab’）2抗體片段，以免發(fā)生非特異性吸附。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第104頁（4）補(bǔ)體細(xì)胞毒分離法抗體+細(xì)胞+補(bǔ)體,經(jīng)過補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒作用（CDC）而去除對(duì)應(yīng)細(xì)胞,用于細(xì)胞陰性分選。（5）流式細(xì)胞術(shù)分選法免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第105頁直接法:將特異性抗體與磁性微粒交聯(lián)，稱為免疫磁珠（IMB），其可與表示對(duì)應(yīng)膜抗原細(xì)胞結(jié)合；應(yīng)用強(qiáng)磁場(chǎng)分離IMB及其所吸附細(xì)胞，從而對(duì)特定細(xì)胞進(jìn)行陰性或陽性分選。間接法:用抗小鼠IgG抗體（第二抗體）包被磁性微珠，可與任何已結(jié)合鼠源性單克隆抗體（一抗）細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)，從而對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分離。（6）磁性激活細(xì)胞分離器（MACS）分離法

免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第106頁MACS分離法優(yōu)點(diǎn):所獲細(xì)胞純度高（93%~99%），獲率可達(dá)90%，活細(xì)胞率＞95%；分離效果可與流式細(xì)胞術(shù)相媲美，但比后者省時(shí)且費(fèi)用低，操作簡(jiǎn)單。缺點(diǎn):陽性分選中，抗體可造成細(xì)胞活化或細(xì)胞凋亡。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第107頁（四）單核-吞噬細(xì)胞分離和搜集1、將PBMC經(jīng)過Percoll連續(xù)密度梯度離心法或洗淘法（陽性分選）可獲取單核細(xì)胞，但所得細(xì)胞數(shù)量較少。2、斑蝥敷貼法能夠從組織滲出液中取得數(shù)量較多且較純巨噬細(xì)胞，亦無需作深入分離。3.以滅菌巰基乙醇酸鹽肉湯培養(yǎng)基（或無菌液體石蠟）注入小鼠腹腔內(nèi)，引發(fā)無菌性炎性滲出，從腹腔沖洗液中可取得大量巨噬細(xì)胞（＞85%）。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第108頁二、淋巴細(xì)胞及其亞群檢測(cè)（一）T細(xì)胞檢測(cè)計(jì)數(shù)1、間接免疫熒光法應(yīng)用抗CD3/CD4/CD8單抗與PBMC結(jié)合，再加入熒光素標(biāo)識(shí)抗小鼠IgG抗體（第二抗體），在熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。2、酶免疫組化法1）堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶（APAAP）法；2）ABC法（間接法）細(xì)胞涂片+單抗+二抗-B+AB*C+底物顯色3、流式細(xì)胞術(shù)采取流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)4.免疫金銀染色法（IGSS）免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第109頁（二）B細(xì)胞檢測(cè)計(jì)數(shù)1、膜表面免疫球蛋白（mlg）檢測(cè)細(xì)胞涂片+熒光素標(biāo)識(shí)抗Ig抗體（免疫熒光法）/+酶標(biāo)識(shí)抗Ig抗體（酶免疫組化法）2、間接免疫熒光法細(xì)胞+CD19/CD20/CD21/CD22等單抗+熒光素標(biāo)識(shí)二抗，判定和檢測(cè)計(jì)數(shù)B細(xì)胞。3、流式細(xì)胞術(shù)4.B細(xì)胞亞群檢測(cè)采取流式細(xì)胞儀，標(biāo)識(shí)CD5單抗和標(biāo)識(shí)CD19單抗，判定B1細(xì)胞和B2細(xì)胞。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第110頁三、免疫細(xì)胞功效測(cè)定（一）吞噬細(xì)胞功效測(cè)定1.中性粒細(xì)胞趨化功效測(cè)定（1）濾膜滲透法（Boyden小室法）在上室加入待測(cè)細(xì)胞，下室加入趨化成份，上下室間被含有一定孔徑和厚度纖維膜隔開，反應(yīng)后取纖維膜清洗后進(jìn)行固定、染色和透明化，在高倍鏡下觀察細(xì)胞穿越纖維膜移動(dòng)距離，從而判斷其趨化作用。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第111頁（2）瓊脂糖平板法:在瓊脂糖平板中央孔內(nèi)加白細(xì)胞懸液，兩側(cè)孔內(nèi)分別加趨化因子或?qū)φ找?，反?yīng)后經(jīng)過固定和染色，觀察細(xì)胞定向移動(dòng)能力。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第112頁2.中性粒細(xì)胞吞噬、殺菌功效測(cè)定（1）顯微鏡檢法白細(xì)胞與葡萄球菌或白色念珠菌懸液混合、溫育，取樣制片、固定、染色；在油鏡下觀察多形核白細(xì)胞對(duì)細(xì)菌吞噬情況，計(jì)算其吞噬率（%）和吞噬指數(shù)（phagocyticindex）及殺菌率。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第113頁（2）硝基藍(lán)四氮唑（NBT）還原試驗(yàn)中性粒細(xì)胞在吞噬、殺菌過程中,能量消耗驟增,氧需要量增加。己糖磷酸旁路糖代謝活性增強(qiáng)；葡萄糖分解中間產(chǎn)物6-磷酸葡萄糖在氧化脫氫轉(zhuǎn)變?yōu)槲焯沁^程中,所釋放氫被攝入吞噬體NBT染料接收,使其被還原成藍(lán)黑色點(diǎn)狀或塊狀甲臢顆粒,沉積于中性粒細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)。普通以陽性細(xì)胞數(shù)超出10%判定為NBT試驗(yàn)陽性。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第114頁3、巨噬細(xì)胞吞噬功效測(cè)定巨噬細(xì)胞+雞紅細(xì)胞（含有清楚可見胞核）吞噬試驗(yàn)，計(jì)算吞噬率和吞噬指數(shù)。4.巨噬細(xì)胞胞毒作用測(cè)定用-干擾素激活小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，觀察其對(duì)125I-UdR標(biāo)識(shí)小鼠肥大細(xì)胞瘤P815殺傷活性。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第115頁（二）T細(xì)胞功效測(cè)定1、T細(xì)胞增殖（轉(zhuǎn)化）試驗(yàn)T細(xì)胞在體外受抗原或絲裂原（PHA.ConA）刺激后，細(xì)胞代謝和形態(tài)發(fā)生改變，主要表現(xiàn)為胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸合成增加，發(fā)生一系列增殖反應(yīng)，并轉(zhuǎn)變?yōu)榱馨湍讣?xì)胞。（1）形態(tài)學(xué)觀察：依據(jù)淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化形態(tài)學(xué)特征，借助光學(xué)顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)。優(yōu)點(diǎn)：方法較簡(jiǎn)單，無需特殊儀器設(shè)備。缺點(diǎn)：依靠肉眼觀察形態(tài)學(xué)改變，準(zhǔn)確性較差。免疫學(xué)技術(shù)專題知識(shí)第116頁（2）放射性核素（3H-TdR、125I-UdR）摻入法:T細(xì)胞增殖，其胞內(nèi)新合成DNA需攝取核苷酸原料，故應(yīng)用核素標(biāo)識(shí)核苷酸參加反應(yīng)，經(jīng)過測(cè)定放射性強(qiáng)度可反應(yīng)淋巴細(xì)胞增殖水平。優(yōu)點(diǎn):靈敏，可自動(dòng)