疾病的分子生物學

疾病的分子生物學11/2/20241

目前認為發(fā)病既有遺傳基礎(chǔ)，又有環(huán)境因素，遺傳因素提供了疾病產(chǎn)生的遺傳背景，環(huán)境因素促使疾病表現(xiàn)出相應的癥狀和體癥。二者作用的大小則要具體分析，如圖。遺傳因素環(huán)境因素

123411/2/20242

1、遺傳因素決定發(fā)?。哼z傳因素起主導作用。.如先天聾啞、甲型血友病等。

2、基本由遺傳因素決定發(fā)?。涵h(huán)境因素起誘導作

用，如：突變

苯丙酮尿癥PKU————苯丙氨酸羥化酶缺乏

PAH

高苯丙氨酸飲食誘發(fā)疾病。

3、遺傳和環(huán)境雙重影響發(fā)病——多基因病。

取決于遺傳度，如：哮喘，遺傳度（率）80%，遺

傳因素大，環(huán)境因素小。

消化性潰瘍遺傳度（率）30%~40%，遺傳因素

小，環(huán)境因素大

4、基本由環(huán)境因素決定

如外傷、人為因素。11/2/20243遺傳病的主要類型

Thehereditarydisease'smaintype

從遺傳學角度分類，遺傳病包括：1、單基因病

涉及一對主基因所導致的疾病。

AR——先天聾啞

AD——并指、多指癥

XR——紅綠色盲血友病DMDXD——抗VD佝僂病2、多基因病

涉及多對（二對以上）基因和環(huán)境共同作用所導致的疾病。如；唇裂、精神分裂癥、高血壓等。

11/2/202443、染色體病染色體異常引起的疾病。常染色體——21三體綜合征數(shù)目異常性染色體——Turner綜合征常染色體——5p-，貓叫綜合征結(jié)構(gòu)異常

性染色體——脆性X染色體綜合征4、體細胞遺傳病——腫瘤5、線粒體病——Leber視神經(jīng)病（C核外基因組）11/2/20245

一．染色體病Chromosomedisease

概念：由于染色體的數(shù)目、結(jié)構(gòu)畸變所引起的疾病就稱為染色體病。染色體是基因的載體，共有24種染色體：包括1～22號常染色體和X、Y染色體，其中含有2～2.5萬個基因、2.85х109bp(基因組)。最大的1號染色體約有250Mb，最小的21號染色體約有50Mb，可見一個染色體上有上千個基因。染色體除了DNA以外還有RNA、組蛋白、非組蛋白等組成。11/2/20246染色體數(shù)目改變、微小結(jié)構(gòu)畸變都能引起許多基因增加或缺失，結(jié)果導致染色體綜合癥。染色體綜合癥的主要表現(xiàn)是:多發(fā)畸形、生長發(fā)育遲緩、智力低下，特征性皮紋改變等。目前記載已有100多種染色體綜合癥。11/2/20247染色體異常的臨床后果

1、自發(fā)流產(chǎn)在流產(chǎn)兒中進行染色體研究表明，大約50%或更多的自發(fā)流產(chǎn)兒有嚴重的染色體異常。幾乎涉及到所有的染色體，但較為集中在某些染色體的改變。如X染色體、13、18、14、和21。包括三體性、三倍體、四倍體、及單倍體等。11/2/202482、出生缺陷

染色體異常的第二大臨床后果是出生缺陷，染色體的改變不同，臨床表現(xiàn)也不盡相同。

但普遍的特點是：生長發(fā)育遲緩（growthretardation），智力低下（mentalretardation）和特征性異常體征（specificsomaticabnormalities）。

11/2/202491.人類染色體：每一種生物都具有恒定的染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)。一個體細胞中全部染色體組成就稱為核型，人的正常男性核型為46，xy

，正常女性核型為46，xx.。

1）

染色體分析技術(shù)：

染色體顯帶技術(shù)

①Q(mào)顯帶(Qbanding)---1968年建立，用熒光染料處理后，在熒光顯微鏡下觀察，可見明暗交替的帶。11/2/202410

②

G顯帶---1971年建立，用胰蛋白酶處理后，Giemsa染色，可見深淺交替的帶，Q帶的亮帶處正好是G帶的深染處。③

R帶---鹽溶液（磷酸二氫鈉等）處理后，Giemsa染色，深淺帶正好與G帶相反。一般用于觀察染色體末端。④C帶---用氫氧化鈉或氫氧化鋇預處理后，Giemsa

染色，結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)（著絲粒、副縊痕、Y染色體長臂等）染成深色。11/2/202411顯帶方法：

G-顯帶：是最常用的方法。標本經(jīng)胰蛋白酶處理后，應用Giemsa染色，鏡檢、分析,顯示深染和淺染相間的帶紋。11/2/202412G-banging界標、區(qū)和帶11/2/202413染色體高分辨顯帶(highresolutionbandingchromosome,HRBC)：

70年代后期建立，一般顯帶是320條帶，HRBC是550條帶----850條----1000多條。在細胞分裂晚前期、早中期收集染色體，獲得更長的染色體，然后顯帶。11/2/20241411/2/202415※

人類細胞遺傳學研究新進展：（1）微細胞遺傳學---應用HRBC技術(shù)研究染色體微細結(jié)構(gòu)改變與遺傳效應之間的相關(guān)性。一般能檢測到4500Kb以上的DNA改變。（2）

分子細胞遺傳學---近年來進展快，以分子水平研究染色體結(jié)構(gòu)畸變遺傳效應、疾病。11/2/202416原位雜交熒光原位雜交（FISH），把某一DNA片斷（探針）精確定位到染色體特定區(qū)帶。染色體涂染---染色體特異性DNA作為探針池（某號染色體、或某區(qū)帶染色體），用非同位素標記（如生物素），與靶細胞染色體進行原位雜交，以帶有熒光的抗生物素蛋白進行抗原抗體反應后檢測特異區(qū)段的熒光雜交信號。染色體易位檢測時用兩種不同染色體涂染不同染色體。11/2/2024171/單色FISH

11/2/2024182/多色FISH（24種染色）11/2/20241921三體FISH診斷11/2/202420核型11/2/202421比較基因組雜交（Comparativegenomichybridization,CGH）

待測基因組DNA和正常參照基因組DNA，分別用不同的非同位素標記（切口平移法、隨機引物法），以1：1混合制成探針，在正常人外周血染色體標本上進行原位抑制雜交，分別以不同熒光染料標記的蛋白進行檢測。11/2/202422

例如：正常DNA與紅色熒光染料結(jié)合，腫瘤與綠色結(jié)合，那么紅（正常）/綠（腫瘤）熒光比值定量檢測（用電腦彩色圖像分析系統(tǒng)），由此判斷腫瘤DNA的擴增或缺失等基因拷貝數(shù)的變化11/2/2024232.

染色體機能、轉(zhuǎn)錄活性以及染色體結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系哺乳動物染色體有如下兩個生物學功能：（1）保持遺傳物質(zhì)恒定---DNA復制后經(jīng)有絲分裂均分。（2）世代傳遞時（減數(shù)分裂）來自于雙親的同源染色體之間發(fā)生互換，使遺傳物質(zhì)重組（父母親的）。11/2/202424染色體的機能依賴于著絲粒、端粒、復制起點三種元件，在酵母人工染色體的制備成功就說明這一點。酵母人工染色體（Yestartificialchromosome,YAC）---具有相當于有功能的著絲粒、兩個端粒、復制起點的特殊的克隆載體，能克隆200~2000Kb長度。

著絲粒---細胞分裂時姐妹染色單體之間分離，同源染色體之間分離起重要作用，沒有著絲粒的染色體片斷在分裂中丟失。有多個染色體特異的DNA序列組成，結(jié)構(gòu)很復雜。11/2/202425

端粒---由DNA和蛋白質(zhì)組成的特殊結(jié)構(gòu)，位于真核生物染色體末端。其作用是：

①保持染色體的完整---失去端粒后染色體末端非常不穩(wěn)定，容易與其他染色體切斷形成的切端之間融合相接形成易位染色體。端粒結(jié)合蛋白能識別端粒3’突出末端，起保護作用。②保證染色體末端DNA復制的完全，復制到DNA鏈終端。11/2/202426③維持核內(nèi)三維結(jié)構(gòu)及對染色體配對起作用（染色體末端限局性存在于核周邊）端粒的結(jié)構(gòu)---進化過程中高度保守，由高度重復序列組成，在人類是由(TTAGGG)n組成，在端粒酶的作用下復制。端粒酶（telomerase）---由RNA和蛋白質(zhì)組成的復合體，以核內(nèi)RNA為模板合成DNA的反轉(zhuǎn)錄酶（細胞內(nèi)以RNA為模板合成DNA，延伸端粒中富含TG的DNA領(lǐng)頭鏈，以DNA聚合酶合成另一條鏈，因此總是有3’突出單鏈末端），端粒的長度由遺傳控制。

11/2/20242711/2/202428

復制起點---開始DNA復制的位點，維持染色體拷貝數(shù)。在哺乳動物數(shù)十個Kb間有個開始復制起點，由復制起始的特異序列組成。一個細胞周期只復制一次，即復制一次分裂一次。轉(zhuǎn)錄活性與染色體結(jié)構(gòu)相關(guān)---細胞分裂間期染色質(zhì)可以分為常染色質(zhì)和異染色質(zhì)，常染色質(zhì)著色淺，螺旋化程度低，有轉(zhuǎn)錄活性。11/2/202429

異染色質(zhì)可以分為功能異染色質(zhì)和結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)，X染色質(zhì)屬于功能異染色質(zhì)（發(fā)育過程中選擇性地凝縮形成）。

結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)是在各種細胞中總是處于凝縮狀態(tài)，是高度重復的DNA，沒有轉(zhuǎn)錄活性，常見于著絲粒、端粒，維持染色體的結(jié)構(gòu)有關(guān)。目前FISH研究結(jié)果看到人類基因80%位于R帶，僅有20%位于G帶，CpG島多數(shù)在R帶，mRNA首先結(jié)合于R帶。11/2/202430

X和Y染色體---Y染色體上SRY基因決定男性性別，盡管有兩個以上X染色體但只要有Y染色體其表型為男性。X和Y染色體在減數(shù)分裂時配對，兩者的短臂末端具有同源性，稱為擬常染色質(zhì)區(qū)，是減數(shù)分裂時配對的部位。11/2/202431Lyon假說1.女性兩條X染色體中一條處于異固縮狀態(tài)——X染色質(zhì)（Barrbody）。2.胚胎發(fā)育早期—第16天。3.異固縮染色體是隨機的。11/2/202432需要說明的問題1）如果一個有缺失的X染色體，優(yōu)先失活；2）常染色體和X染色體平衡易位的個體中，正常的X染色體優(yōu)先失活；3）Xchr上的Gene不全部失活，部分gene逃避失活，已知>16個基因逃避失活；4）體細胞X失活是永久的，但在生殖細胞發(fā)育中，失活是可逆的；5）C中只有一條X染色體有活性，其他均以失活狀態(tài)存在；11/2/202433

3.染色體異常與疾病

概念：由于染色體數(shù)目異?；蚪Y(jié)構(gòu)異常引起的疾病就稱為染色體病。

數(shù)目異常：整倍體---染色體整組的變化，即3n、4n，常見于夭折的胚胎或腫瘤細胞中，這樣的個體即使生下來也不能生存很長時間。非整倍體---不是整組的變化而是某號染色體增或減，2n+1,2n-1的改變?！鴶?shù)目異常產(chǎn)生原因---染色體不分離，染色體丟失，核內(nèi)復制。還有雙受精。11/2/202434▲單親二倍體---所有染色體來自父或母單方的二倍體，在胚胎時夭折，父源的就形成葡萄胎，母源的就形成卵巢畸胎瘤。這是由于遺傳印記，即父源的和母源的基因表達不同，二倍體都來自單親的就不可能發(fā)育成個體?！?/p>

單親二體型---一對同源染色體都來自父或母方，一般三體型丟失一條后其數(shù)目正常，但都來自于單親。11/2/202435結(jié)構(gòu)異常：染色體斷裂以后形成的斷片變位重接就產(chǎn)生各種結(jié)構(gòu)異常。包括缺失、重復、倒位、易位、插入、環(huán)狀染色體、雙著絲粒染色體等。一般4Mb以上的改變才能被識別（光鏡下）。染色體?。悍譃槌Ｈ旧w病和性染色體病。

常染色體病---由于常染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常引起的病，最常見的是唐氏綜合癥（Downsyndrome,DS，21三體，先天愚型）。

性染色體病---由于性染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常引起的疾病，最常見的是Turner綜合癥、Klinfilter綜合癥。其次是脆性x染色體綜合癥。11/2/202436DownSyndrome11/2/202437Down（唐氏）綜合征患者11/2/20243811/2/20243911/2/20244011/2/202441脆性X染色體綜合征（fragileXchromosome，fraX）

該基因定位于Xq27.3，染色體呈細絲樣，易斷裂—脆性部位。該病主要男性發(fā)病，發(fā)病率高（僅次于21三體），發(fā)病率為男性的1/1250。臨床癥狀—智力低下（中度），頭大，長臉，下頜大，大耳，大睪丸，語言障礙。近年分子遺傳學研究進展：克隆分離FMRIgene（主要在腦中表達）

Xq27.338kb17個外顯子11/2/20244211/2/202443發(fā)病機制：

5’端第1外顯子非編碼順序中存在（CGG）n。正常狀態(tài)n=6～46，當n〉52減數(shù)分裂時不穩(wěn)定傳遞過程中重復拷貝數(shù)增加前突變（premutation）n=60～2005’

端非甲基化，無臨床表現(xiàn)（攜帶者）。11/2/202444突變：當n〉230，達數(shù)百，數(shù)千，有臨床癥狀

5’端高度甲基化不穩(wěn)定

轉(zhuǎn)錄停止不同細胞中n數(shù)不同無FMR1mRNA及蛋白嵌合體11/2/202445攜帶者大部分是n=50～230（前突變）

FMR1仍有表達，但傳遞時不穩(wěn)定，尤其母親傳遞子女更不穩(wěn)定當n〈70突變概率20%n〉90突變概率99%女性的突變主要由母親前突變傳來，而不是父親，在家系傳遞過程中，拷貝數(shù)逐漸增多，表現(xiàn)為遺傳早現(xiàn)，即隨著傳代發(fā)病年齡提早，病情加重。11/2/20244611/2/202447二單基因?。╩onogenicdisease）的分子生物學

1.單基因遺傳病的概念、種類：由一對基因所決定的性狀或疾病稱為單基因遺傳，目前已知約有6000多種，其中約3000多種與疾病相關(guān)。根據(jù)基因的顯隱性、位于1~22號常染色體上還是X染色體上，把單基因遺傳病分為如下4種：11/2/202448AD---占半數(shù)以上，一般來講結(jié)構(gòu)蛋白異常，包括完全顯性、不完全顯性、共顯性、不規(guī)則顯性、延遲顯性。AR---約占36%，一般是酶蛋白異常。XR---10%以下。XD---很少11/2/202449常染色體顯性遺傳（AD）例1Huntington病（HD）雜合體多在30—40歲發(fā)病，致病基因定位于4p16.3。

正常n=25～39（CAG）n擴展患者n=42～8111/2/202450

脊髓小腦共濟失調(diào)(Spinocerebelar

ataxias,SCAs)

神經(jīng)退化性疾病,AD

臨床癥狀—遲發(fā)性共濟失調(diào)，走路不穩(wěn)，易跌，步態(tài)蹣跚，兩手笨拙，震顫，不能精細動作；喝水嗆；構(gòu)音障礙，眼震顫等。

SCA已發(fā)現(xiàn)有20幾種亞型—基因座異質(zhì)性11/2/202451發(fā)病機制與三核苷酸重復擴展的動態(tài)突變相關(guān)。例如：SCA1基因編碼區(qū)5’端（CAG）n

正常：n=17~36n〉43時發(fā)病11/2/202452ⅠⅡⅢⅣⅤ60歲發(fā)病70歲死亡121231234567891066歲死亡45歲發(fā)病62歲死亡50歲發(fā)病56歲死亡45歲發(fā)病26歲死亡19歲發(fā)病1234567891011121314151617181920212223242526272812345678910111213141565歲50歲發(fā)病48歲36歲發(fā)病36歲因肺結(jié)核死亡圖8-16常染色體顯性脊髓小腦共濟失調(diào)家系系譜11/2/202453動態(tài)突變（dynamicmutation）—某些遺傳性疾病與三核苷酸重復拷貝數(shù)的擴展有關(guān)，三核苷酸重復拷貝數(shù)在正常情況下有一定的變異范圍，而擴展時就表現(xiàn)為疾病，這種突變不穩(wěn)定，其拷貝數(shù)與病情正相關(guān)。例如：強直性肌營養(yǎng)不良癥（CTG）n3’非編碼區(qū)脆性X染色體綜合征（CGG）n5’非編碼區(qū)

HD（CAG）n5’編碼區(qū)

SCA（CAG）n5’編碼區(qū)

11/2/202454遺傳印跡（Geneticimprinting）：雙親的基因或染色體存在功能上的差異，因而基因來自父方或母方而產(chǎn)生不同表現(xiàn)型的現(xiàn)象。這是由于生殖細胞分化過程中受到不同修飾的結(jié)果。例如：15p11-13缺失父源染色體缺失—Prader-will綜合征母源染色體缺失—Angelman綜合征11/2/202455HD

父親遺傳—發(fā)病早（20歲以前）病情嚴重母親遺傳—約在40歲以后發(fā)病，病情輕早現(xiàn)遺傳（anticipation）：一些遺傳病表現(xiàn)出連續(xù)世代傳遞中發(fā)病年齡提早，病情也加重，這種現(xiàn)象就稱為早現(xiàn)遺傳。這與動態(tài)突變中三核苷酸拷貝數(shù)的擴展程度有關(guān)。11/2/202456※

分子病以及先天性代謝病：

分子?。╩oleculaerdisease）的概念是1949年P(guān)auling首次提出，對HbS患者的血紅蛋白進行電泳檢測時發(fā)現(xiàn)，患者和正常人的Hb泳動速度不同，考慮是由于Hb的分子結(jié)構(gòu)不同所致，由此提出分子病的概念。11/2/202457分子病包括：血紅蛋白病----異常血紅蛋白?。ńY(jié)構(gòu)異常）約有600多種地中海貧血（合成速率下降）包括α地貧和β地貧。血漿蛋白異常免疫蛋白異常受體蛋白異常酶蛋白異常---先天性代謝病11/2/202458先天性代謝?。哼z傳性酶缺陷導致代謝異常?；蛉毕菝傅鞍桩惓４x異常疾病

例如：苯丙酮尿癥（phenylketonuria,PKU）

苯丙氨酸羥化酶（phenylalaninehydroxyrase,PAH）遺傳性缺陷所致，AR,12q24,發(fā)病率為1/16500，由于PAH基因缺陷苯丙氨酸代謝受阻，導致旁路代謝開放副產(chǎn)物累積，造成白化癥（酪氨酸缺乏），苯丙酮尿，智力低下（腦積夜中含有大量的苯丙酮酸等中間代謝產(chǎn)物，使智力發(fā)育受限）。11/2/2024592

X---連鎖隱性遺傳病：常見的有血友病、G6PD、DMD、紅綠色盲等。血友病(hemophiliaA)是分子遺傳學研究基因定位、基因診斷、基因治療中很有意義的疾病，以血友病為例講疾病的認識過程及疾病的分子生物學研究過程。早在第二世紀被猶太人注意----割禮后出血不止而死亡12世紀在阿拉伯文獻中有記載19世紀已注意到出血不止的原因是由于凝血緩慢11/2/202460

1）

19世紀歷史上最著名的血友病家系---英國王室出現(xiàn)的血友病，波及歐洲各王室Victoria女王（1820~1901），8歲時其父去世，被定為王位繼承者，其父母家系中無血友病病史，后來研究認為是新生的突變。她共生育8個子女，三個兒子中一個是血友病患者，五個女兒中兩個是攜帶者，她們的女兒分別嫁到俄羅斯、德國、西班牙等多個歐洲國家以后生了血友病兒子。結(jié)果現(xiàn)今英女王是Vctoria正常兒子的后裔，因此其后代中無血友病患者，英國王室不再受血友病之害，然而通過攜帶者女兒把血友病傳遞到歐洲多個王室。11/2/2024612）

20世紀Mendel遺傳規(guī)律的應用----發(fā)現(xiàn)血友病是XR,男性患者，女性攜帶者。3）

1911~1937年----探索血友病凝血缺陷的早期努力通過臨床實驗發(fā)現(xiàn)血友病患者的血液----凝血時間延長，但不清楚是凝血第幾因子的缺乏。4）

1950~1983年----命名因子Ⅷ，并分離出來11/2/2024621962年明確A型是第Ⅷ因子缺乏，B型是第Ⅸ因子缺乏所致。血友病中5/6是A型，1/6是其他因子缺乏，其中主要是B型。

※凝血瀑布假說----1965年取得很大進展

FⅧ是一個輔助因子，凝血過程中FⅧ增強了FⅨa因子對FⅩ因子激活的作用，可見在臨床上A型與B型無法區(qū)別。11/2/202463血液凝固的級聯(lián)式過程11/2/2024644）、凝血機制缺乏FⅧ或FⅨ都會引起FⅩ活化減少，繼發(fā)凝塊形成缺陷，從而出現(xiàn)血友病表現(xiàn)。

外原性途徑內(nèi)原性途徑

ⅫⅫaⅪ

組織因子ⅩⅪaⅨⅨaⅧⅧaⅦaⅩaⅤ

凝血酶原復合體Ⅴa

凝血酶原凝血酶

纖維蛋白凝塊纖維蛋白原11/2/202465血友病的治療---人的血漿中FⅧ含量低，因此在動物（豬、牛）血中提取輸給患者，可能產(chǎn)生抗體，誘發(fā)其他病，但是救了許多生命。即血漿化學分離商品化，問題是出現(xiàn)了并發(fā)癥，乙肝病毒、艾滋病病毒感染。1979年~1983年之間大部分FⅧ提取物被污染上了HIV，對于血友病的治療是悲劇性的結(jié)果。后來用滅活這些病毒的方法有了些好轉(zhuǎn)。11/2/202466※

FⅧ因子和VWD(vonwillebrand’sdisease,血管性假血友病)

VWD是由于VWF（Vonwillebrand’sfactor,血管性假血友病因子）缺乏所致。

VWD是50年代首先被描寫的常染色體顯性遺傳病，是由于VWF遺傳性缺陷所致。11/2/202467

VWF—已證明是FⅧ的受體，血漿中FⅧ是大分子復合物—即小分子量部分的FⅧ促凝活性和大分子量部分的VWF兩者結(jié)合所組成。FⅧ促凝活性（Ⅷ：C）缺乏是血友病A的發(fā)病原因，F(xiàn)Ⅷ促凝活性只占FⅧ復合物中的1%，具有凝血活性作用，血漿中含量約為50ug/L。Ⅷ：C的正常值為50~150%，小于正常的2%為重型，正常的2~5%為中型，正常的5~25為輕型，正常的25~50為亞臨床型。

VWF基因定位于12P12~Pter,VWD是AD遺傳。1979年才能把FⅧ和VWF純化出來。11/2/2024685）

1982年~1984年血漿提純

FⅧ提取高純度的FⅧ而獲得專利，隨后設(shè)想能否用生物工程的方法制備FⅧ，既提高產(chǎn)量也可以避免病毒等污染。11/2/202469幾個研究小組同時進行研究：把純化的FⅧ經(jīng)胰蛋白酶消化成不同的多肽片斷，通過色譜法分離不同多肽片斷，將多肽片斷進行氨基酸測序，以此為依據(jù)設(shè)計合成相應的寡核苷酸探針（考慮密碼的兼并性），應用此探針篩選基因組文庫，再經(jīng)基因組文庫步移法克隆全基因。基因全長為186Kb,含26個外顯子。用如上探針篩選肝臟的cDNA文庫，就能得到FⅧ基因的cDNA。11/2/2024701984年12月在Nature雜志上發(fā)表了如上研究結(jié)果。然后把FⅧcDNA克隆于表達載體，研究分析基因和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能。FⅧ基因：位于Xq28,全長186Kb,占X染色體的0.1%,mRNA大小是9.0Kb,含有26個外顯子和25個內(nèi)含子，其中第22個內(nèi)含子長達32Kb.11/2/202471FⅧ蛋白：由Cdna推測的FⅧ蛋白---含19個aa的信號肽和2332aa組成，主要在肝臟中合成，分泌時信號肽斷開后成為成熟的氨基末端，由A1A2BA3C1C2

等區(qū)域構(gòu)成(同源性來分)。C區(qū)域---FⅧ功能區(qū)，B區(qū)域---由外顯子14編碼，與已知蛋白不同源，在活化的FⅧ中被剪切掉B區(qū)域，推測可能是被加工后的mRNA反轉(zhuǎn)錄后再整合進去的。11/2/20247211/2/2024736)如何檢測血友病攜帶者血液中FⅧ水平能檢測大多數(shù)攜帶者，但攜帶者可以有正常的FⅧ水平，最好的方法是基因診斷，1987年首次應用RFLP連鎖分析進行了首例產(chǎn)前基因診斷。11/2/202474奧大利亞一位醫(yī)生的妻子是個血友病攜帶者（家族性），當他讀了《Nature》雜志上發(fā)表的論文后，來信懇求作產(chǎn)前基因診斷，經(jīng)過BclⅠ/RFLP連鎖分析，確定胎兒是正常男性（核型分析判斷性別為男性，連鎖分析判斷未得到帶有致病基因的染色體），其結(jié)果發(fā)表在Lancent雜志上。11/2/202475

內(nèi)含子18中BclⅠ多態(tài)經(jīng)Southern雜交分析結(jié)果，1.2Kb(1165bp)占27%，0.9Kb(879bp)占73%，雜合子頻率2pq=2×0.27×0.73=0.42(一般在RFLP的情況下小于0.5)。11/2/20247611/2/2024777）

1986年首次檢測引起甲型血友病的點突變

TaqⅠ/RFLPSouthern檢測（以cDNA為探針）結(jié)果，患者出現(xiàn)異常帶，進一步克隆測序判定，外顯子24中密碼子2209的CGATGA,結(jié)果精氨酸變成了終止密碼。（迄今已發(fā)現(xiàn)80多種點突變、6種插入、7種小缺失、及60多種大缺失。）

11/2/2024788)1987~1992年

PCR技術(shù)的應用，檢測到很多種突變，也檢測到多種多態(tài)。

9）1992年缺失檢測

10）神秘的內(nèi)含子22被闡明，其中有2個小基因，分別叫F8A和F8B，通過CpG島發(fā)現(xiàn)，其功能還沒有搞清楚，已被檢測到的蛋白質(zhì)中沒有與該基因閱讀框架相應的蛋白質(zhì)。11/2/20247911）1990年~1993年通過基因工程技術(shù)生產(chǎn)FⅧ---將FⅧ基因重組于表達載體，把重組體轉(zhuǎn)染到BHK表達細胞中，使其表達產(chǎn)生FⅧ，1~2mg/升。首先在狗中做實驗，然后用于人。第一批接受治療的嚴重血友病患者，其止血效果非常好，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的不良表現(xiàn)，但后來注意到幾乎30%的人產(chǎn)生抗體。目前市售的FⅧ有---血漿來源的FⅧ或FⅧ復合物、基因工程生產(chǎn)的11/2/20248012）今后前景

①

確定所有突變基因型，又有效阻止這些突變

②

推動基因治療

③

解答蛋白產(chǎn)物的三維結(jié)構(gòu)

④

闡明蛋白功能的機制，研究基因的進化

11/2/202481假肥大型肌營養(yǎng)不良：

包括Duchennemusculardystrophy,DMD和Beckermusculardystrophy,BMD,都是DMD基因缺陷所致，DMD比BMD癥狀重，發(fā)病年齡早。DMD發(fā)病率為1/3500，是神經(jīng)肌肉系統(tǒng)最常見的遺傳病，XR遺傳。一般5~6歲開始發(fā)病，雙下肢無力，上樓梯困難，Gower征（+），腓腸肌假性肥大，進行性肌萎縮，10歲以后不能自主走路，20歲前死于呼吸、循環(huán)衰竭。11/2/202482

部分患兒伴有不同程度的智力低下。生化檢測---血清磷酸激酶升高（CPK）,乳酸脫氫酶升高（LDH）,肌紅蛋白（Mb）升高。肌電圖---呈典型肌源性疾病改變。11/2/202483三.致病基因的克隆1.

功能克隆Functionalcloning:基因產(chǎn)物能純化的情況下，通過基因產(chǎn)物的功能分析進行基因克隆方法，F(xiàn)Ⅷ基因克隆是功能克隆的典型。

※

蛋白產(chǎn)物精提后經(jīng)胰蛋白酶等消化分解成多肽，把多肽的氨基酸測序后，合成制備相應的寡核苷酸探針（考慮密碼的兼并性），以此來篩選基因組或者cDNA文庫。11/2/202484FⅧ蛋白多肽多肽

片段氨基酸測序合成寡核苷酸探針篩選基因組文庫基因組文庫步移法克隆全基因胰蛋白酶消化色譜法分離11/2/202485※

還可以用抗原抗體反應來篩選（蛋白產(chǎn)物經(jīng)免疫產(chǎn)生抗體，標記抗體來尋找全抗原）。

1982年用這種方法克隆了PAH基因。在肝臟中提純PAH酶，消化成多肽片斷以后，以此來免疫小鼠或小兔，獲得特異性抗體。由肝臟提取mRNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，連接到表達載體，構(gòu)建cDNA表達文庫。用如上特異性抗體經(jīng)同位素標記后篩選cDNA表達載體，確定表達抗原的克隆?！傊ㄟ^基因產(chǎn)物的功能分析來進行克隆的方法。11/2/2024862.

定位克隆：伴隨人類基因組計劃的實施而發(fā)展起來的基因定位新策略。其他信息未知的情況下先染色體定位，然后進行克隆。染色體定位縮小候選區(qū)域鄰接克隆群中篩選出結(jié)構(gòu)基因經(jīng)篩查突變來確定疾病相關(guān)基因。11/2/2024871）

染色體定位的方法（范圍較大，通常大于10Mb）（1）

連鎖分析---遺傳病的基因定位常用此法。同過家系分析尋找lod值3以上的遺傳標記，此表記位點就是該基因的候選區(qū)域。11/2/202488（2）雜合性丟失篩選(lossofheterozygosity,LOH)---常用于腫瘤抑制基因的定位。應用微衛(wèi)星多態(tài)標記（一般經(jīng)過細胞遺傳學分析，染色體缺失好發(fā)部位的多態(tài)標記），對比正常組織與腫瘤組織，尋找腫瘤中好發(fā)雜合性丟失部位。11/2/202489（3）

染色體異常---在一些疾病中伴隨著染色體異常，此異常部位的基因與疾病相關(guān)。例如，DMD中常見到Xp21缺失或該點的易位。1986年成功報道了DMD基因的定位克隆例子。（此外還有CF、HD、多囊腎、大腸癌、乳腺癌等致病基因），這種方法很費事，到1995年末只有50多個基因用此法進行克隆。11/2/202490

2)縮小候選區(qū)域---縮小候選染色體區(qū)域的范圍，用多態(tài)性標記對該區(qū)域作更為精細的遺傳圖，在這個過程中遺傳分析至關(guān)重要，采取交換體分析、連鎖不平衡分析等方法盡可能縮小染色體區(qū)域定位。

11/2/2024913)克隆重疊群(clonecontugs)的連接及篩選目的基因轉(zhuǎn)錄圖構(gòu)建、克隆DNA中識別基因，主要用CpG島識別、外顯子捕獲、DNA測序等方法（尋找外顯子序列特征部分）4)突變篩查確定候選基因(致病基因)※

三個定位克隆的成功例子（DMDNF1CF）

11/2/202492DMD(Duchennemusculardystrophy)

染色體定位：1982年靠通常的連鎖分析把DMD基因定位于Xp21

染色體分析---少見的女性患者（目前國際報道只有20多人女患），其雙親正常、無家族史，經(jīng)染色體分析發(fā)現(xiàn)都有X染色體和常染色體之間的易位，多個女患常染色體的斷點不同，而X染色體的斷點正好都在Xp21,從而進一步將DMD基因進一步定位于Xp21。11/2/202493通過消減雜交克隆法分離DMD