補黃丹對乙酸致小鼠潰瘍性結腸炎的治療作用

潰瘍性結腸炎（UC）1859年由Wilks首先描述，1920年被醫(yī)學界公認，我國于1956年首次報道。過去認為該病歐美多見，亞非少見，但近幾十年研究表明，UC在我國也是一種較常見的消化道疾病，并且正在逐漸成為消化病學研究的一個新熱點，盡管我國目前還缺乏UC的流行病學資料，但據(jù)《世界華人消化雜志）2000年3月[1]對1978年以來幾次重要的全國性消化會議的資料統(tǒng)計，該病發(fā)病率和患病率在我國有明顯增加趨勢：潰瘍性結腸炎（ulcerativecolitis），簡稱UC。是一種病因不明的，以直腸和結腸的淺表性、非特異性炎癥病變?yōu)橹鞯哪c道疾病，主要累及直腸和乙狀結腸，也可侵及其他部分或全部結腸；病變嚴重者，其中少數(shù)可出現(xiàn)10cm以內的“反流性回腸。一、材料與方法（一）小鼠50只，體重20±2g，雌雄兼用均由荊州衛(wèi)校提供。所有小鼠購回后用混合配方飼料喂養(yǎng)，自由進食飲水，每日更換飲水，飼料，保持小鼠生活環(huán)境通風及清潔衛(wèi)生。應用手術器械、分光光度儀、離心機、水浴恒溫震蕩器、微量稱重器（上海天平儀器廠）等。所用藥品為補黃丹、鄰甲聯(lián)苯胺溶液。（二）方法1、分組小鼠隨機分成5組，即正常組、模型組、高劑量補黃丹組、中劑量補黃丹組和低劑量補黃丹組等5組，每組10只，各組體重統(tǒng)計學比較無顯著差異（P>0.05）。2、模型制作參照文獻[24～26]并略加改進：實驗前各組小鼠分別稱重，實驗采用灌腸法制作小鼠潰瘍性結腸炎模型。灌腸前小鼠禁食24小時，除對照組外，其余各組小鼠均經肛門插入一直徑1mm的硅膠管，插管尖端距小鼠肛門約2cm，并以4%乙酸稀釋液灌腸，每次2mL，而后保持小鼠頭朝下體位，大約20秒后，注入生理鹽水0.5mL沖洗；對照組注入等量生理鹽水對照。連續(xù)灌腸4天，模型完成。3、治療對造模成功的小鼠根據(jù)分組分別給以相應的藥物（每100g體重），每日一次灌胃：正常組及模型組給予生理鹽水3mL；補黃丹高、中、低劑量組分別給予等量的不同濃度的補黃丹（含生藥分別為0.75，0.60，0.48g/mL，使用前用無菌的蒸餾水稀釋，相當于225，180，144mg/kg）。連續(xù)給藥7天，給藥期間正常飲食。（三）觀測指標1、大體觀察觀察小鼠的體重、進食量、飲水量、毛發(fā)光澤度、大便性狀及活動情況，并記錄體重變化。2、疾病活動指數(shù)（DAI）建模后1—7天測定小鼠體重、觀察糞便性狀和隱血情況，按DAI標準進行評分（表1），計算DAI分值：DAI=體質量下降分數(shù)+糞便性狀分數(shù)+便血分數(shù)。糞隱血測定：鄰聯(lián)甲苯胺法——將糞便涂于白色濾紙上，滴加鄰聯(lián)甲苯胺溶液兩滴，再滴加過氧化氫一滴，觀察結果。表1疾病活動指數(shù)評分標準疾病活動指數(shù)參照文獻[27]標準。正常糞便指成形顆粒樣便；半稀便指糊狀或半成形不粘肛便；稀便指水樣粘肛便。3、外周血白細胞總數(shù)（TWBC）建模后7天，小鼠斷尾取血，取60微升推片瑞氏染色后，另取20微升加入280微升白細胞稀釋液中混勻，在血細胞計數(shù)板上計數(shù)白細胞總數(shù)。4、結腸長度、腸質量指數(shù)、結腸潰瘍及炎癥評分建模后7天后，脫頸椎處死小鼠，取全段結腸，沿腸系膜剖開結腸，4℃生理鹽水漂洗，將結腸上端固定于測量板上，下端負荷1g，測量結腸負荷1g時的垂直長度。結腸經濾紙吸干后，微量稱重儀測其濕質量，計算腸質量指數(shù)：腸質量指數(shù)=結腸濕質量/體重×100%[28]。將結腸展平置于冰盤上，用解剖顯微鏡觀察結腸情況，按UC結腸潰瘍及炎癥評分標準計分[29]。5、結腸組織病理學正常組結腸黏膜上皮完整，腺體排列整齊，未見糜爛及潰瘍形成，少量炎細胞浸潤；模型組結腸黏膜上皮缺失，腺體結構紊亂，淺表潰瘍形成，黏膜及黏膜下層水腫明顯，大量炎癥細胞浸潤，隱窩膿腫形成，腸壁增厚；補黃丹高劑量組結腸黏膜上皮基本完整，腺體排列整齊，未見糜爛及潰瘍形成，炎細胞浸潤輕，腸壁輕度增厚。6、統(tǒng)計學處理實驗數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用Dun-nett-t檢驗，以P<0.05作為有差異的界值，以P<0.01作為有顯著差異的界值。二、結果與分析（一）大體觀察灌腸第3天，造模小鼠開始出現(xiàn)腹瀉、飲食減少、體毛不光澤，第5天開始出現(xiàn)不同程度的肉眼血便、蜷縮、活動減少、體重減輕。經補黃丹給藥治療一周后，治療組小鼠癥狀均有不同程度改變，表現(xiàn)為食量增加、體重及毛色逐漸恢復，肉眼血便減少，有時僅見稀便，有時為正常大便。但UC模型組小鼠癥狀和體征均無明顯改變。（二）DAI評分造模成功后，小鼠即開始出現(xiàn)腹瀉、體質量下降、血便等UC癥狀。治療后補黃丹各劑量治療組DAI降低明顯，作用呈劑量依賴性（表2）。（三）外周血TWBC治療后補黃丹能顯著降低外周血TWBC，且補黃丹療效呈劑量依賴性（表2）。表2對照組與補黃丹組DAI分值、外周血TWBC（±s）n=10。建模前各組DAI均為0。DAI：疾病活動指數(shù)；TWBC：白細胞總數(shù)；UC：潰瘍性結腸炎。與UC模型組比較，*：P<0.05；與正常組比較，**：P<0.01。（四）結腸長度、腸質量指數(shù)、結腸潰瘍及炎癥評分造模后7天，模型組結腸明顯短縮，黏膜增厚、充血、水腫、潰瘍形成。補黃丹治療組結腸短縮程度較小，腸質量指數(shù)明顯降低；結腸充血、水腫明顯減少，增厚不明顯，偶有潰瘍且潰瘍面積明顯縮小（表3）。表3對照組與補黃丹組結腸長度、腸質量指數(shù)、結腸潰瘍及炎癥評分（±s）n=10。UC：潰瘍性結腸炎；與UC模型組比較，*：P<0.05；與正常組比較，**：P<0.01。三、總結本文采用乙酸法誘發(fā)小鼠UC，乙酸具有增加血管通透性、激活激肽的作用[30]；并可引起結腸屏障破壞，繼而促進進一步的炎癥反應。該模型制作方法簡便，造模周期短。建模后小鼠的腸質量指數(shù)均有不同程度的增加，表示模型小鼠的結腸發(fā)生不同程度的充血、水腫和增厚等炎癥病變，與王曉華等報道相似[31]。文章通過測定DAI、結腸長度、腸質量指數(shù)、結腸潰瘍及炎癥評分并分別從結腸肉眼情況及顯微鏡下評價補黃丹對乙酸誘發(fā)的潰瘍性結腸炎的療效，結果顯示補黃丹能明顯降低上述指標，且小鼠腹瀉、便血等UC癥狀好轉，結腸充血、水腫、增厚的局部炎癥表現(xiàn)減輕，說明補黃丹對乙酸誘發(fā)的小鼠UC有良好的治療作用。外周TWBC反映UC全身炎癥反應的嚴重程度；結腸長度間接反映了結腸上皮受損，隱窩缺陷及纖維化的程度，后者與嗜酸性粒細胞浸潤及TGF2β增高密切相關[32]，補黃丹治療組顯著降低上述指標，對UC小鼠結腸短縮有較好的修復作用，差別有統(tǒng)計學意義。文章結果提示補黃丹能有效減輕UC小鼠結腸短縮及結腸炎癥反應，減少UC小鼠腸質量指數(shù)的作用。綜上所述，補黃丹能有效減輕乙酸誘發(fā)的實驗性潰瘍性結腸炎，具有明顯治療實驗性UC的作用，為該藥臨床治療UC提供了藥理實驗依據(jù)，但其治療UC的機制有待深入研究。潰瘍性結腸炎的主要癥狀是腹痛、腹瀉及黏液血便，中醫(yī)屬于“泄