補(bǔ)黃丹對乙酸致小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）1859年由Wilks首先描述，1920年被醫(yī)學(xué)界公認(rèn)，我國于1956年首次報道。過去認(rèn)為該病歐美多見，亞非少見，但近幾十年研究表明，UC在我國也是一種較常見的消化道疾病，并且正在逐漸成為消化病學(xué)研究的一個新熱點(diǎn)，盡管我國目前還缺乏UC的流行病學(xué)資料，但據(jù)《世界華人消化雜志）2000年3月[1]對1978年以來幾次重要的全國性消化會議的資料統(tǒng)計(jì)，該病發(fā)病率和患病率在我國有明顯增加趨勢：潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerativecolitis），簡稱UC。是一種病因不明的，以直腸和結(jié)腸的淺表性、非特異性炎癥病變?yōu)橹鞯哪c道疾病，主要累及直腸和乙狀結(jié)腸，也可侵及其他部分或全部結(jié)腸；病變嚴(yán)重者，其中少數(shù)可出現(xiàn)10cm以內(nèi)的“反流性回腸。一、材料與方法（一）小鼠50只，體重20±2g，雌雄兼用均由荊州衛(wèi)校提供。所有小鼠購回后用混合配方飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水，每日更換飲水，飼料，保持小鼠生活環(huán)境通風(fēng)及清潔衛(wèi)生。應(yīng)用手術(shù)器械、分光光度儀、離心機(jī)、水浴恒溫震蕩器、微量稱重器（上海天平儀器廠）等。所用藥品為補(bǔ)黃丹、鄰甲聯(lián)苯胺溶液。（二）方法1、分組小鼠隨機(jī)分成5組，即正常組、模型組、高劑量補(bǔ)黃丹組、中劑量補(bǔ)黃丹組和低劑量補(bǔ)黃丹組等5組，每組10只，各組體重統(tǒng)計(jì)學(xué)比較無顯著差異（P>0.05）。2、模型制作參照文獻(xiàn)[24～26]并略加改進(jìn)：實(shí)驗(yàn)前各組小鼠分別稱重，實(shí)驗(yàn)采用灌腸法制作小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型。灌腸前小鼠禁食24小時，除對照組外，其余各組小鼠均經(jīng)肛門插入一直徑1mm的硅膠管，插管尖端距小鼠肛門約2cm，并以4%乙酸稀釋液灌腸，每次2mL，而后保持小鼠頭朝下體位，大約20秒后，注入生理鹽水0.5mL沖洗；對照組注入等量生理鹽水對照。連續(xù)灌腸4天，模型完成。3、治療對造模成功的小鼠根據(jù)分組分別給以相應(yīng)的藥物（每100g體重），每日一次灌胃：正常組及模型組給予生理鹽水3mL；補(bǔ)黃丹高、中、低劑量組分別給予等量的不同濃度的補(bǔ)黃丹（含生藥分別為0.75，0.60，0.48g/mL，使用前用無菌的蒸餾水稀釋，相當(dāng)于225，180，144mg/kg）。連續(xù)給藥7天，給藥期間正常飲食。（三）觀測指標(biāo)1、大體觀察觀察小鼠的體重、進(jìn)食量、飲水量、毛發(fā)光澤度、大便性狀及活動情況，并記錄體重變化。2、疾病活動指數(shù)（DAI）建模后1—7天測定小鼠體重、觀察糞便性狀和隱血情況，按DAI標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分（表1），計(jì)算DAI分值：DAI=體質(zhì)量下降分?jǐn)?shù)+糞便性狀分?jǐn)?shù)+便血分?jǐn)?shù)。糞隱血測定：鄰聯(lián)甲苯胺法——將糞便涂于白色濾紙上，滴加鄰聯(lián)甲苯胺溶液兩滴，再滴加過氧化氫一滴，觀察結(jié)果。表1疾病活動指數(shù)評分標(biāo)準(zhǔn)疾病活動指數(shù)參照文獻(xiàn)[27]標(biāo)準(zhǔn)。正常糞便指成形顆粒樣便；半稀便指糊狀或半成形不粘肛便；稀便指水樣粘肛便。3、外周血白細(xì)胞總數(shù)（TWBC）建模后7天，小鼠斷尾取血，取60微升推片瑞氏染色后，另取20微升加入280微升白細(xì)胞稀釋液中混勻，在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)白細(xì)胞總數(shù)。4、結(jié)腸長度、腸質(zhì)量指數(shù)、結(jié)腸潰瘍及炎癥評分建模后7天后，脫頸椎處死小鼠，取全段結(jié)腸，沿腸系膜剖開結(jié)腸，4℃生理鹽水漂洗，將結(jié)腸上端固定于測量板上，下端負(fù)荷1g，測量結(jié)腸負(fù)荷1g時的垂直長度。結(jié)腸經(jīng)濾紙吸干后，微量稱重儀測其濕質(zhì)量，計(jì)算腸質(zhì)量指數(shù)：腸質(zhì)量指數(shù)=結(jié)腸濕質(zhì)量/體重×100%[28]。將結(jié)腸展平置于冰盤上，用解剖顯微鏡觀察結(jié)腸情況，按UC結(jié)腸潰瘍及炎癥評分標(biāo)準(zhǔn)計(jì)分[29]。5、結(jié)腸組織病理學(xué)正常組結(jié)腸黏膜上皮完整，腺體排列整齊，未見糜爛及潰瘍形成，少量炎細(xì)胞浸潤；模型組結(jié)腸黏膜上皮缺失，腺體結(jié)構(gòu)紊亂，淺表潰瘍形成，黏膜及黏膜下層水腫明顯，大量炎癥細(xì)胞浸潤，隱窩膿腫形成，腸壁增厚；補(bǔ)黃丹高劑量組結(jié)腸黏膜上皮基本完整，腺體排列整齊，未見糜爛及潰瘍形成，炎細(xì)胞浸潤輕，腸壁輕度增厚。6、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用Dun-nett-t檢驗(yàn)，以P<0.05作為有差異的界值，以P<0.01作為有顯著差異的界值。二、結(jié)果與分析（一）大體觀察灌腸第3天，造模小鼠開始出現(xiàn)腹瀉、飲食減少、體毛不光澤，第5天開始出現(xiàn)不同程度的肉眼血便、蜷縮、活動減少、體重減輕。經(jīng)補(bǔ)黃丹給藥治療一周后，治療組小鼠癥狀均有不同程度改變，表現(xiàn)為食量增加、體重及毛色逐漸恢復(fù)，肉眼血便減少，有時僅見稀便，有時為正常大便。但UC模型組小鼠癥狀和體征均無明顯改變。（二）DAI評分造模成功后，小鼠即開始出現(xiàn)腹瀉、體質(zhì)量下降、血便等UC癥狀。治療后補(bǔ)黃丹各劑量治療組DAI降低明顯，作用呈劑量依賴性（表2）。（三）外周血TWBC治療后補(bǔ)黃丹能顯著降低外周血TWBC，且補(bǔ)黃丹療效呈劑量依賴性（表2）。表2對照組與補(bǔ)黃丹組DAI分值、外周血TWBC（±s）n=10。建模前各組DAI均為0。DAI：疾病活動指數(shù)；TWBC：白細(xì)胞總數(shù)；UC：潰瘍性結(jié)腸炎。與UC模型組比較，*：P<0.05；與正常組比較，**：P<0.01。（四）結(jié)腸長度、腸質(zhì)量指數(shù)、結(jié)腸潰瘍及炎癥評分造模后7天，模型組結(jié)腸明顯短縮，黏膜增厚、充血、水腫、潰瘍形成。補(bǔ)黃丹治療組結(jié)腸短縮程度較小，腸質(zhì)量指數(shù)明顯降低；結(jié)腸充血、水腫明顯減少，增厚不明顯，偶有潰瘍且潰瘍面積明顯縮?。ū?）。表3對照組與補(bǔ)黃丹組結(jié)腸長度、腸質(zhì)量指數(shù)、結(jié)腸潰瘍及炎癥評分（±s）n=10。UC：潰瘍性結(jié)腸炎；與UC模型組比較，*：P<0.05；與正常組比較，**：P<0.01。三、總結(jié)本文采用乙酸法誘發(fā)小鼠UC，乙酸具有增加血管通透性、激活激肽的作用[30]；并可引起結(jié)腸屏障破壞，繼而促進(jìn)進(jìn)一步的炎癥反應(yīng)。該模型制作方法簡便，造模周期短。建模后小鼠的腸質(zhì)量指數(shù)均有不同程度的增加，表示模型小鼠的結(jié)腸發(fā)生不同程度的充血、水腫和增厚等炎癥病變，與王曉華等報道相似[31]。文章通過測定DAI、結(jié)腸長度、腸質(zhì)量指數(shù)、結(jié)腸潰瘍及炎癥評分并分別從結(jié)腸肉眼情況及顯微鏡下評價補(bǔ)黃丹對乙酸誘發(fā)的潰瘍性結(jié)腸炎的療效，結(jié)果顯示補(bǔ)黃丹能明顯降低上述指標(biāo)，且小鼠腹瀉、便血等UC癥狀好轉(zhuǎn)，結(jié)腸充血、水腫、增厚的局部炎癥表現(xiàn)減輕，說明補(bǔ)黃丹對乙酸誘發(fā)的小鼠UC有良好的治療作用。外周TWBC反映UC全身炎癥反應(yīng)的嚴(yán)重程度；結(jié)腸長度間接反映了結(jié)腸上皮受損，隱窩缺陷及纖維化的程度，后者與嗜酸性粒細(xì)胞浸潤及TGF2β增高密切相關(guān)[32]，補(bǔ)黃丹治療組顯著降低上述指標(biāo)，對UC小鼠結(jié)腸短縮有較好的修復(fù)作用，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。文章結(jié)果提示補(bǔ)黃丹能有效減輕UC小鼠結(jié)腸短縮及結(jié)腸炎癥反應(yīng)，減少UC小鼠腸質(zhì)量指數(shù)的作用。綜上所述，補(bǔ)黃丹能有效減輕乙酸誘發(fā)的實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎，具有明顯治療實(shí)驗(yàn)性UC的作用，為該藥臨床治療UC提供了藥理實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但其治療UC的機(jī)制有待深入研究。潰瘍性結(jié)腸炎的主要癥狀是腹痛、腹瀉及黏液血便，中醫(yī)屬于“泄