24-二硝基氯苯誘導(dǎo)的大鼠潰瘍性結(jié)腸炎動物模型

近30年來，為探討一個可以用來模擬本病的模型，人們先后采用藥物學(xué)方法、免疫學(xué)方法和患者來源物質(zhì)等多種方法建立了多種潰瘍性結(jié)腸炎動物模型，從不同的角度探討潰瘍性結(jié)腸炎病因、發(fā)病機(jī)制、病理改變及生物學(xué)行為等，但大多數(shù)模型為采用一定的方法，誘發(fā)產(chǎn)生與人潰瘍性結(jié)腸炎不同程度上相似的病理改變，但因腸道具有較強(qiáng)的修復(fù)能力，這些變化往往難以維持。潰瘍性結(jié)腸炎病因和發(fā)病機(jī)制仍未闡明，這與缺少理想的動物模型有關(guān)。一、材料與方法（一）試驗(yàn)材料1、儀器（器械）。移液棒、注射器、灌腸儀器、手術(shù)器械、20mL帶塞刻度試管、20ul采血管、棉球、蓋玻片、白細(xì)胞計數(shù)器、顯微鏡等。2、藥物試劑。試驗(yàn)藥品：2，4-二硝基氯苯（DNCB）丙酮、乙醚苦味酸、0.85%生理鹽水等。3、動物。健康大鼠，用混合配方飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水，每日更換飲水，飲料，保持大鼠生活環(huán)境通風(fēng)及清潔衛(wèi)生。觀察進(jìn)食、飲水、活動、大小便情況，隨機(jī)分為兩組，模型組10只，對照組10只。（二）試驗(yàn)方法1、UC模型的建立。將20只大鼠隨機(jī)分為對照組（10只）和DNCB實(shí)驗(yàn)組（10只）；大鼠腹部剪毛（不損傷皮膚）約2.0cm×1.5cm，以2%DNCB涂腹液涂腹，1次/天，50μl/次，連續(xù)14天，第15天開始分別以0.2%DNCB灌腸，1次/天，每次2μl/g，連續(xù)4天，對照組灌以相應(yīng)體積的60%乙醇；方法是將直徑2mm的硅膠管插入大鼠結(jié)腸，插管尖端距肛門約8cm。2、動物觀察及評價。（1）大鼠的一般狀況。包括活動狀態(tài)、毛發(fā)變化、精神狀態(tài)、灌腸后體重下降的百分比、大便變化及便血。后三者綜合進(jìn)行疾病活動指數(shù)評分（2）大鼠結(jié)腸大體形態(tài)損傷評分。在20天后處死大鼠，取出近肛門段結(jié)腸約8cm，沿縱軸剪開結(jié)腸，進(jìn)行結(jié)腸大體損傷評分（3）將結(jié)腸標(biāo)本進(jìn)行HE染色，根據(jù)韓英等標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織損傷評分（三）統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±S）表示，采用t檢驗(yàn)和方差分析（ANVOA）進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，P〈0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。二、結(jié)果（一）大體觀察造模完成后1～2周，模型組大鼠出現(xiàn)粘液膿血便或糞便稀溏、食量下降等潰瘍性結(jié)腸炎活動期常見的消化道癥狀、且逐漸加重.4周左右癥狀更為嚴(yán)重，可見膿血便、消瘦、體重減輕、毛發(fā)無光澤、飲食明顯減少、畏寒、懶動等；而對照組大鼠大小便正常、體重增加、毛發(fā)有光澤、飲食、活動精神正常。（二）DAI評分表1DAI評分（±s）注：與正常組相比*P<0.05。模型組的評分明顯高于對照組，差異有顯著性（P<0.01）（見表3）（三）結(jié)腸大體形態(tài)損傷評分模型組大鼠結(jié)腸炎癥病變主要靠近肛門段結(jié)腸，病變粘膜充血、水腫、糜爛和潰瘍形成，部分腸壁增厚，部分大鼠的結(jié)腸與周圍組織粘連，模型組評分明顯高于對照組，差異具有極顯著性（P<0.01）。見表2表2兩組大鼠結(jié)腸大體形態(tài)損傷評分（±s）注：與正常組相比*P<0.05。（四）病理變化對照組：大鼠結(jié)腸粘膜完好，無炎細(xì)胞浸潤及潰瘍，粘膜上皮完整、連續(xù)、腺體排列規(guī)則、結(jié)構(gòu)清楚、分泌功能活躍、粘膜下固有層內(nèi)血管纖維內(nèi)質(zhì)對照，肌層無異常。模型組：大鼠結(jié)腸粘膜糜爛、潰瘍，大部分粘膜缺損，有的形成深大潰瘍，粘膜腺體破壞，粘膜及粘膜下大量炎細(xì)胞浸潤，淋巴細(xì)胞散在分布，處于增殖狀態(tài)（漿多、核大、染色質(zhì)稀疏），粘膜層變薄，粘膜下固有層局部充血、水腫、纖維增生。對照組的結(jié)腸有潰瘍癥狀的為0例，模型組的結(jié)腸有潰瘍癥狀的為4例，兩組進(jìn)行比較，由t檢驗(yàn)可以得出P<0.05；表明大鼠在灌注DNCB灌腸液前后，在其結(jié)腸出現(xiàn)潰瘍的幾率上差異顯著，灌注DNCB灌腸液可使大鼠的結(jié)腸出現(xiàn)潰瘍癥狀的幾率顯著升高。對照組的結(jié)腸有炎癥癥狀的為1例，模型組的結(jié)腸有炎癥癥狀的為7例，兩組進(jìn)行比較，由t檢驗(yàn)可以得出P<0.05；表明大鼠在注射DNCB灌腸液前后，在其結(jié)腸出現(xiàn)炎癥癥狀的幾率上差異顯著，灌注DNCB灌腸液可使大鼠的結(jié)腸出現(xiàn)炎癥癥狀的幾率顯著升高。對照組的結(jié)腸有中性粒細(xì)胞的為1例，模型組的結(jié)腸有中性粒細(xì)胞的為6例，兩組進(jìn)行比較，由t檢驗(yàn)可以得出P<0.05；表明大鼠在灌注DNCB灌腸液前后，在其結(jié)腸出現(xiàn)中性粒細(xì)胞的幾率上有差異。對照組的結(jié)腸有糜爛現(xiàn)象的為1例，模型組的結(jié)腸有糜爛現(xiàn)象的為3例，兩組進(jìn)行比較，由t檢驗(yàn)可以得出P<0.05；表明大鼠在注射DNCB灌腸液前后，在其結(jié)腸出現(xiàn)糜爛現(xiàn)象的幾率上差異顯著，灌注DNCB灌腸液可使大鼠的結(jié)腸出現(xiàn)糜爛現(xiàn)象的幾率顯著升高。三、結(jié)果分析（一）結(jié)腸變化腸道2，4-二硝基氯苯灌注部位出現(xiàn)粘膜和粘膜下層水腫、組織壞死，淋巴細(xì)胞聚集，隱窩膿腫、粘膜表面潰瘍，固有層漿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、多形核細(xì)胞浸潤，嚴(yán)重時大鼠因巨結(jié)腸而死亡，尚未發(fā)現(xiàn)腸穿孔。2～5周后逐漸出現(xiàn)愈合期改變，潰瘍可愈合，但腺泡排列紊亂，基底部固有層有漿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，固有層及粘膜下層纖維組織增生。（二）造模結(jié)果1、大體表現(xiàn)。造模完成后1～2周，大鼠出現(xiàn)黏液膿血便或糞便稀溏、食量下降等人潰瘍性結(jié)腸炎活動期常見的消化道癥狀，以及精神萎靡、活動減少、毛發(fā)色澤暗淡等全身改變。組造模后2周黏液膿血便減少，攝食恢復(fù)，4～6周大便及攝食正常。2、病理學(xué)變化（1）肉眼觀察造模完成后觀察的10只模型大鼠中，8只的結(jié)腸粘膜呈不同程度的充血、水腫，表面被覆粘液，血液和壞死組織，并有明顯的潰瘍形成。潰瘍的形狀、大小和深度不一，少數(shù)為細(xì)小點(diǎn)狀，多數(shù)成小塊狀或大片不規(guī)則狀；其中4只大鼠結(jié)腸的潰瘍僅累及粘膜，3只達(dá)粘膜下層，1只深達(dá)肌層，其余2只大鼠的結(jié)腸粘膜未見明顯的糜爛或潰瘍，但都有不同程度的充血和水腫。（2）鏡下觀察在8只有明顯潰瘍形成的大鼠結(jié)腸，鏡下可見潰瘍周圍的粘膜和粘膜下層組織充血、水腫，粘膜下層增后，并有大量和中等量的中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞、以及少量至中等量的大單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤，部分大單核細(xì)胞的胞漿內(nèi)可見含鐵血黃素。潰瘍底多為富有血管的肉芽組織，其中有3只大鼠有不同程度的纖維組織增生。肌層內(nèi)亦有少量至中等量的中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，偶見大單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤。漿膜也有少量炎性細(xì)胞浸潤。在其余2只未見明顯潰瘍的大鼠結(jié)腸，亦可見粘膜及粘膜下層組織充血、水腫，并有以淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤。肌層內(nèi)可見少量散在的淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤。（三）分析該期結(jié)腸的病理形態(tài)學(xué)檢查顯示，模型大鼠結(jié)腸有明顯的潰瘍形成和炎癥細(xì)胞浸潤等病理改變，造模完成后的12天為潰瘍期。并由此說明2，4-二硝基氯苯法確能成功制造大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型。四、總結(jié)本工作初步表明，應(yīng)用2，4-二硝基氯苯（DNCB）方法造模，其機(jī)理是2，4-二硝