臨床富血小板血漿介紹、分類(lèi)、制備技術(shù)及質(zhì)量控制要點(diǎn)

臨床富血小板血漿介紹、分類(lèi)、制備技術(shù)及質(zhì)量控制要點(diǎn)富血小板血漿（PRP）制備技術(shù)是一種高度異質(zhì)性的技術(shù)，目前尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。采血量、抗凝劑、離心設(shè)備、離心參數(shù)、激活方式、PRP制備量等差異性較大，血小板富集度、血小板回收率、白細(xì)胞清除率、紅細(xì)胞清除率等指標(biāo)不穩(wěn)定，缺乏統(tǒng)一的PRP質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。所有這些因素導(dǎo)致PRP研究結(jié)果往往不能重復(fù)或不一致，嚴(yán)重制約了PRP的臨床推廣應(yīng)用，因而亟需建立一套穩(wěn)定可靠的PRP制備技術(shù)規(guī)范來(lái)指導(dǎo)PRP制備。PRP概述血小板簡(jiǎn)介血小板是一種從巨核細(xì)胞上脫落的細(xì)胞質(zhì)小塊，是哺乳動(dòng)物血液中的有形成分之一。成年人血液中血小板濃度為（100～300）×109/L，平均壽命7～14d，每日約更新總量的1/10。性別、年齡、種族、身高、季節(jié)、早晚、運(yùn)動(dòng)、生理周期等不同，不僅血小板濃度有一定程度的生理性波動(dòng)，而且會(huì)影響PRP的制備效率。一般情況下，血小板呈雙凸盤(pán)狀，受到刺激后會(huì)伸出足突，呈不規(guī)則狀，具有明顯的異質(zhì)性。血小板有質(zhì)膜，沒(méi)有細(xì)胞核。細(xì)胞質(zhì)呈淡藍(lán)色，含有a顆粒、致密顆粒（d顆粒）、溶酶體（l顆粒）等。血小板受到刺激后會(huì)發(fā)生粘附、聚集、釋放、收縮及吸附，在止血、傷口愈合、炎性反應(yīng)、血栓形成、器官移植排斥等生理和病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。PRP概念PRP是全血經(jīng)分離后得到的富含高濃度血小板的血漿。1993年，Hood等首先提出PRP概念。由于目前PRP制備多采用自體全血，所以PRP通常都是指自體PRP，主要含有血小板、纖維蛋白、白細(xì)胞等成分。血小板中α顆粒在血小板激活后釋放大量生長(zhǎng)因子，如血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGFβ)、類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子（IGF）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等，各種生長(zhǎng)因子的比例與體內(nèi)生理狀態(tài)比例相符，在加速傷口愈合、促進(jìn)組織再生修復(fù)、緩解疼痛等方面扮演了非常重要的角色。由于PRP是從自體血液中提取，來(lái)源豐富、取材方便、制備簡(jiǎn)單、安全有效，近幾年已廣泛應(yīng)用到骨科、疼痛科、口腔頜面外科、心胸外科、醫(yī)學(xué)美容科、皮膚科、康復(fù)醫(yī)學(xué)科、耳鼻喉科、婦產(chǎn)科、眼科、泌尿外科、兒外科、神經(jīng)外科等學(xué)科領(lǐng)域，具有廣闊的應(yīng)用空間和發(fā)展前景。PRP分類(lèi)根據(jù)所用的PRP制備技術(shù)、產(chǎn)生的PRP中不同成分含量等，PRP有很多分類(lèi)系統(tǒng)，比如DohanEhrenfest、Mishra、PAW、PLRA、DEPA、MARSPILL、血小板生理學(xué)小組委員會(huì)分類(lèi)、PRP分類(lèi)和編碼系統(tǒng)等分類(lèi)系統(tǒng)。這些分類(lèi)系統(tǒng)在一定程度上解決了不同數(shù)據(jù)之間無(wú)法比較的問(wèn)題，有利于臨床根據(jù)不同使用目的及情況，確定更適合的PRP，提供更好的治療方案。目前臨床上常用的分類(lèi)方法主要是根據(jù)白細(xì)胞含量及PRP應(yīng)用形式進(jìn)行分類(lèi)。根據(jù)白細(xì)胞含量不同分類(lèi)白細(xì)胞與血小板的沉降系數(shù)很相近，含量都相對(duì)較少，采用密度梯度離心法很難將兩者完全分開(kāi)。根據(jù)所含白細(xì)胞濃度的不同，PRP可分為含高濃度白細(xì)胞的富白細(xì)胞富血小板血漿（LPRP）以及不含或僅含低濃度白細(xì)胞的貧白細(xì)胞富血小板血漿（PPRP）。LPRP比PPRP具有更高的血小板濃度和白細(xì)胞濃度、釋放更高濃度的生長(zhǎng)因子。LPRP抗炎作用強(qiáng)，能更持久地釋放生長(zhǎng)因子、纖維膠原等，更適合被應(yīng)用于創(chuàng)傷組織的修復(fù)，但白細(xì)胞釋放炎癥因子引發(fā)局部的免疫反應(yīng)可能抑制組織修復(fù)、降低PRP臨床療效、增加注射部位疼痛等。PPRP在骨關(guān)節(jié)炎治療及各類(lèi)手術(shù)中效果較好，近年來(lái)獲得了越來(lái)越廣泛的關(guān)注。根據(jù)PRP應(yīng)用形式分類(lèi)(1)激活型PRP（外源性激活PRP）PRP萃取液指血小板被激活后，釋放的生長(zhǎng)因子與血漿及血漿中原有的活性蛋白成分一起形成的混合液。PRP凝膠指血小板被激活后釋放生長(zhǎng)因子的同時(shí)，其纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，并連接成網(wǎng)，所形成的乳白色膠狀物，具有一定強(qiáng)度和黏附性。(2)未激活型PRP（內(nèi)源性激活PRP）人體內(nèi)有足夠量的內(nèi)源性凝血酶原激酶、膠原蛋白等，一旦未激活型PRP注射入人體，就會(huì)被體內(nèi)凝血酶、膠原蛋白等激活，緩慢釋放生長(zhǎng)因子。制備技術(shù)如何進(jìn)行有效分離和提高PRP中血小板濃度并保持血小板的活性是PRP制備技術(shù)的關(guān)鍵。標(biāo)準(zhǔn)化制備的PRP可為基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供可靠的質(zhì)量保證，但目前PRP制備技術(shù)尚未形成統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。PRP制備技術(shù)根據(jù)制備原理的不同可分為密度梯度離心法和濾膜式分離法，前者是利用離心力將不同沉降系數(shù)的血液成分分層分離，后者是通過(guò)濾膜過(guò)濾的方法獲得一定顆粒大小的血液成分，如血小板等，目前臨床上主要使用密度梯度離心法制備PRP。密度梯度離心法密度梯度離心法是根據(jù)血液中各組分沉降系數(shù)的不同（表1），從全血中分離提取出PRP。不同的離心力、離心次數(shù)、離心時(shí)間及離心溫度所制備的PRP中血小板濃度和活性也會(huì)有差異。根據(jù)制備工具不同分類(lèi)密度梯度離心法根據(jù)制備工具不同可分為PRP制備套裝法、血細(xì)胞分離機(jī)單采法、手工一體性血袋法和手工試管法。(1)PRP制備套裝法PRP制備套裝是一類(lèi)專(zhuān)門(mén)用于制備PRP的整套裝置，包括采血和離心材料，通常配備專(zhuān)用的離心機(jī)。使用的PRP制備套裝須是在國(guó)家藥品監(jiān)督管理局注冊(cè)的Ⅲ類(lèi)醫(yī)療器械。PRP制備套裝多在半封閉或全封閉狀態(tài)下采集和制備，一次采集一次使用，制品安全性相對(duì)較高，操作簡(jiǎn)單。PRP制備套裝種類(lèi)繁多，制備方法各異，PRP產(chǎn)量及血小板富集度相差很大，臨床應(yīng)用時(shí)要注意相互之間的差別。①二次離心法PRP制備套裝如山東威高PRP制備套裝、韓國(guó)瑞維PRP制備套裝等。采用二次離心法制備PRP，不僅血小板富集度和血小板回收率較高，而且可以通過(guò)對(duì)第一次離心后分離的三個(gè)部分吸取比例的不同實(shí)現(xiàn)制備LPRP或PPRP。②一次離心法PRP制備套裝如瑞士瑞珍PRP制備套裝、德國(guó)銳適PRP制備器、美國(guó)泰爾茂比司特PRP制備套包等。單次離心后直接吸取中間層，獲得PRP。部分品牌的制備套裝還聯(lián)合使用專(zhuān)用血小板分離膠/濾膜獲得PRP。(2)血細(xì)胞分離機(jī)單采法離心式血細(xì)胞分離機(jī)以全自動(dòng)方式分離血小板，同時(shí)將紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血漿回輸?shù)焦┭唧w內(nèi)。本法是在全密閉條件下操作，不易污染，一次可采集較多血小板，滿足分次使用，而且供血者自體血液損失少，所得血小板純度高、濃度高。但此法所需設(shè)備價(jià)格昂貴，多為血液制品相關(guān)機(jī)構(gòu)或科室使用，主要用于輸血性血小板輸注治療，總體成本較高，而且儲(chǔ)存的血小板分次使用可能會(huì)影響血小板活性，與臨床科室實(shí)際需求存在一定的差距，所以目前并未在臨床上廣泛應(yīng)用。(3)手工一體性血袋法離心方法可用富漿法或白膜法。使用串聯(lián)的血袋在密閉狀態(tài)下采血、分離和制備PRP，安全性高，也可一次采集較多血小板，其余血液成分可回輸供血者體內(nèi)。其缺點(diǎn)是所需環(huán)境和設(shè)備要求高，操作復(fù)雜，歷時(shí)長(zhǎng)，難以在臨床廣泛使用。(4)手工試管法試管法手工采集全血制備PRP，主要有Anitua、Petrungarp、Landesberg及Aghaloo等四種方法。這類(lèi)制備方法操作簡(jiǎn)單、設(shè)備要求低，成本低，但其開(kāi)放式制備方式容易受到外界污染，制備的PRP質(zhì)和量易受操作者習(xí)慣等影響，在國(guó)家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)注冊(cè)PRP專(zhuān)用離心管之前，臨床上不推薦使用手工試管法制備PRP。①應(yīng)用無(wú)菌采血管代替PRP離心管由于無(wú)菌采血管是Ⅱ類(lèi)醫(yī)療器械，未進(jìn)行特定的生物學(xué)檢驗(yàn)檢測(cè)，安全性較低，不能滿足國(guó)家Ⅲ類(lèi)醫(yī)療器械管理的規(guī)定要求，如果用來(lái)替代PRP離心管，一方面未按注冊(cè)預(yù)期用途使用，另一方面也不安全。②利用無(wú)菌注射器改裝成PRP離心管雖然無(wú)菌注射器是Ⅲ類(lèi)醫(yī)療器械，但利用無(wú)菌注射器改裝成離心管，用來(lái)制備PRP，屬于未按注冊(cè)預(yù)期用途使用，而且采集和制備過(guò)程為開(kāi)放性操作，存在較高的污染風(fēng)險(xiǎn)。③使用尚未在國(guó)內(nèi)注冊(cè)的PRP專(zhuān)用離心管不推薦使用國(guó)外或國(guó)內(nèi)生產(chǎn)的尚未在國(guó)內(nèi)注冊(cè)的PRP專(zhuān)用離心管。根據(jù)離心力不同選擇分類(lèi)PRP制備可用一次、二次或三次離心法，其中二次離心法提取的PRP質(zhì)量較高，在臨床上應(yīng)用最廣泛。二次離心法根據(jù)離心力選擇的不同又可分為富血小板血漿法和白膜法。(1)富血小板血漿法（富漿法）第一次離心為輕離心，使全血分兩層。紅細(xì)胞和白細(xì)胞沉淀形成下層，而上層中血小板不沉淀，形成富含血小板的血漿層；取上層富含血小板血漿，行第二次離心，為重離心，使血小板沉淀，棄去部分上層的貧血小板血漿后，形成符合要求的PRP。本法的特點(diǎn)是血小板回收率高，但白細(xì)胞和紅細(xì)胞殘留率也較高。(2)白膜法同樣包括兩次離心。首先將全血重離心，形成三層，即貧血小板血漿層、白膜層（血小板、白細(xì)胞層）和少白細(xì)胞的紅細(xì)胞層。然后分離白膜層，行第二次離心（輕離心），得上清液為少白PRP。本法的特點(diǎn)是所得PRP中白細(xì)胞混入少，但血小板回收率偏低。濾膜式分離法人體全血中血小板直徑為2～3μm，紅細(xì)胞平均直徑為9μm左右，白細(xì)胞直徑為7～20μm，濾膜式分離法是利用特定孔徑濾膜的分子篩特性，將全血中不同顆粒大小的成分（紅細(xì)胞、白細(xì)胞等）與血小板分離的方法。比如第一層大孔徑膜截留紅細(xì)胞和白細(xì)胞，第二層小孔徑膜獲得血小板，洗脫后形成符合要求的PRP。濾膜式分離法也可與離心法組合使用，以提高PRP制備純度和效率。PRP制備對(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)基本要求機(jī)構(gòu)資質(zhì)要求雖然目前PRP制備及臨床應(yīng)用尚無(wú)嚴(yán)格統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的醫(yī)療機(jī)構(gòu)資質(zhì)要求，但考慮到PRP是血液相關(guān)制品，PRP制備必須遵循血液制品制備和使用規(guī)范，具備嚴(yán)格的無(wú)菌條件及操作流程，符合國(guó)家規(guī)定的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)和要求。制備環(huán)境要求空間布局。設(shè)置PRP制備無(wú)菌治療室或手術(shù)室，面積應(yīng)滿足PRP采集及制備工作需求。治療室內(nèi)空間布局合理，治療床、操作臺(tái)、儀器設(shè)備、無(wú)菌物品等有序擺放。治療室制度、技術(shù)操作規(guī)范與流程圖上墻。衛(wèi)生環(huán)境。PRP制備需在潔凈室條件下進(jìn)行，采血、制備等工作區(qū)域環(huán)境須達(dá)到醫(yī)院消毒衛(wèi)生國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中的Ⅱ類(lèi)及以上環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)要求。無(wú)法達(dá)到潔凈室標(biāo)準(zhǔn)的醫(yī)療機(jī)構(gòu)應(yīng)配置超凈工作臺(tái)，在超凈工作臺(tái)內(nèi)完成PRP制備。無(wú)菌操作。須使用無(wú)菌預(yù)防措施制備PRP。操作前，醫(yī)務(wù)人員應(yīng)佩戴一次性口罩和帽子，手消毒，穿戴無(wú)菌的一次性手套，制備過(guò)程中嚴(yán)格遵循技術(shù)規(guī)范，保證全程無(wú)菌操作，防止感染事件的發(fā)生。制備場(chǎng)地要求基本設(shè)施。PRP制備應(yīng)符合感染控制要求，無(wú)菌區(qū)、緩沖區(qū)、污染區(qū)布局合理，醫(yī)務(wù)人員及患者通道相對(duì)獨(dú)立。治療室內(nèi)配置層流系統(tǒng)或必要的消毒設(shè)施，安裝溫度調(diào)節(jié)裝置，設(shè)置必要的供氧及負(fù)壓吸引系統(tǒng)。基本設(shè)備(1)PRP制備設(shè)備。離心機(jī)是必備的設(shè)備，建議配備PRP專(zhuān)用離心機(jī)。冰箱、酶標(biāo)儀、血細(xì)胞分析儀、血小板震蕩保存箱、生物安全柜或超凈工作臺(tái)等都屬于可選設(shè)備，根據(jù)所在單位的實(shí)際情況有選擇地配備。(2)搶救設(shè)備。如呼吸機(jī)、簡(jiǎn)易呼吸器、氣管插管等。(3)監(jiān)護(hù)設(shè)備。如多功能生命體征監(jiān)測(cè)儀、聽(tīng)診器、血壓計(jì)、體溫計(jì)等。搶救藥品(1)補(bǔ)充體液類(lèi)。5%、10%葡萄糖注射液，0.9%氯化鈉溶液等。(2)抗過(guò)敏抗休克類(lèi)。地塞米松、腎上腺素、阿托品、多巴胺等。(3)抗驚厥類(lèi)。地西泮、硫酸鎂等。(4)呼吸興奮劑。尼可剎米等。(5)其他。必要的鈣劑、止吐及其他藥品。所有藥品須在有效期內(nèi)使用，存藥近效期前應(yīng)及時(shí)更新為較新批號(hào)的藥品。制備人員資質(zhì)要求PRP制備應(yīng)當(dāng)由具有執(zhí)業(yè)醫(yī)師資格、執(zhí)業(yè)護(hù)士資格等醫(yī)療資質(zhì)人員操作。制備者需經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的無(wú)菌操作培訓(xùn)和PRP制備技術(shù)培訓(xùn)并取得培訓(xùn)合格認(rèn)證，熟練掌握PRP制備的基礎(chǔ)理論知識(shí)和相關(guān)操作流程，熟悉PRP配套耗材及制備設(shè)備的使用方法，對(duì)可能的設(shè)備故障等具有初步應(yīng)急處理能力。PRP制備需要的材料PRP制備所用材料應(yīng)符合國(guó)家或/和行業(yè)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，滿足Ⅲ類(lèi)醫(yī)療器械管理規(guī)定。試劑抗凝劑、激活劑、生長(zhǎng)因子檢測(cè)試劑盒等。耗材PRP制備套裝。專(zhuān)用于PRP制備而設(shè)計(jì)的整套制備耗材，國(guó)產(chǎn)PRP制備套裝（如山東威高等）和進(jìn)口PRP制備套裝（如韓國(guó)瑞維、瑞士瑞珍、德國(guó)銳適、美國(guó)泰爾茂比司特等）均為Ⅲ類(lèi)醫(yī)療器械。單采機(jī)配套耗材。成分血單采機(jī)一次性配套耗材為Ⅲ類(lèi)醫(yī)療器械。自配耗材。在國(guó)家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)注冊(cè)PRP專(zhuān)用離心管之前，臨床上不推薦自配耗材制備PRP。設(shè)備見(jiàn)制備場(chǎng)地要求中基本設(shè)備內(nèi)容。PRP制備系統(tǒng)模式完全開(kāi)放系統(tǒng)將PRP制備暴露在工作區(qū)域內(nèi)環(huán)境中，與制備PRP所需的材料和設(shè)備接觸。雖然這種系統(tǒng)成本低、方便快捷，但存在血小板易被激活、感染控制風(fēng)險(xiǎn)高、制備效率難均一等問(wèn)題。半密閉系統(tǒng)采血后，將血液注入密閉制備套件中，通過(guò)制備套件內(nèi)部的分離分割裝置制備PRP，制備過(guò)程中血液處于密閉系統(tǒng)。這種系統(tǒng)具有方便快捷、成本稍高、感染風(fēng)險(xiǎn)較低、制備效率高等特點(diǎn)。制備環(huán)境要求同開(kāi)放式系統(tǒng)。完全密閉系統(tǒng)整個(gè)制備過(guò)程都在密閉容器內(nèi)完成，不與外界直接接觸，避免轉(zhuǎn)移操作中的污染和血小板激活。優(yōu)先選擇在完全封閉系統(tǒng)內(nèi)采集制備PRP，以防止血液和細(xì)胞組分暴露在空氣中受到污染。雖然這種系統(tǒng)感染控制風(fēng)險(xiǎn)較低、容易質(zhì)控，但存在價(jià)格昂貴、高紅細(xì)胞污染等問(wèn)題。PRP的制備流程患者評(píng)估

一般情況評(píng)估患者性別、年齡、健康狀況、既往病史、心理狀態(tài)、教育程度、經(jīng)濟(jì)狀況等。疾病主訴、現(xiàn)病史、治療經(jīng)過(guò)、治療效果、治療需求等。詳細(xì)的體格檢查，以及必要的影像學(xué)檢查、實(shí)驗(yàn)室檢查等。排除治療影響因素，妥善進(jìn)行醫(yī)患溝通和患者教育，操作前簽署知情同意書(shū)。禁忌證排查(1)絕對(duì)禁忌證。血小板功能障礙綜合征、重度血小板減少癥、血液動(dòng)力學(xué)不穩(wěn)定、脾功能亢進(jìn)、敗血癥、注射部位或手術(shù)部位存在局部感染、不愿意接受血液制品治療風(fēng)險(xiǎn)者、明確患有心理疾病、對(duì)治療期望值過(guò)高等患者禁用PRP。(2)相對(duì)禁忌證。以下情況慎用PRP：服用NSAIDS類(lèi)藥物停藥未超過(guò)48h；1個(gè)月內(nèi)治療部位局部注射糖皮質(zhì)激素；全身性使用糖皮質(zhì)激素停用未超過(guò)2周；抗凝藥停用未超過(guò)5d；近期發(fā)熱或其他疾?。ㄗ陨砻庖咝裕┗颊?；惡性腫瘤（尤其是造血系統(tǒng)或骨骼系統(tǒng)腫瘤）患者；血紅蛋白<100g/L，血小板計(jì)數(shù)<100×109/L等。注意事項(xiàng)避開(kāi)女性月經(jīng)期等。采血采血條件。采血前應(yīng)對(duì)患者進(jìn)行安全性綜合評(píng)估，確保患者身體機(jī)能處于良好狀態(tài)；檢查患者備采血血管充盈良好，局部皮膚無(wú)異常表現(xiàn)；采血環(huán)境符合無(wú)菌要求等。安全檢查。相關(guān)試劑、耗材包裝完好，生產(chǎn)日期及失效期標(biāo)注明確，且在有效保質(zhì)期內(nèi)；制備設(shè)備、監(jiān)護(hù)設(shè)備、搶救設(shè)備、搶救物品等狀態(tài)良好；消毒設(shè)施及溫度調(diào)節(jié)裝置處于良好工作狀態(tài)等。操作規(guī)范。嚴(yán)格執(zhí)行查對(duì)制度，遵守?zé)o菌操作及PRP制備等相關(guān)操作規(guī)范和指南，采血過(guò)程中密切關(guān)注患者反應(yīng)，及時(shí)處理各種可能的意外情況。采血操作(1)采血部位。采血部位常規(guī)選取肘部靜脈，也可采用其他部位作為備選方法，如尺動(dòng)脈、橈動(dòng)脈、股靜脈等。如果患者過(guò)度肥胖或其他原因造成體表血管難以定位時(shí)，可考慮使用超聲儀器引導(dǎo)下輔助定位。(2)血液類(lèi)型。多數(shù)采集靜脈血，少數(shù)采集動(dòng)脈血。(3)采血方法。操作者佩戴無(wú)菌手套，對(duì)患者皮膚常規(guī)消毒后，用采血針進(jìn)行穿刺采血，等待軟管中出現(xiàn)血液，將采血針與PRP制備套裝中采血管或注射器連接。(4)血液混勻。血液采集完畢后，操作者需將采血管輕輕地反復(fù)倒置幾次，使抗凝劑與血液充分混合，防止血液凝固。血液和抗凝劑混勻后取適量（約0.1ml）混合血用于測(cè)定其中血液中血小板的數(shù)量，以便用于后續(xù)過(guò)程比照和監(jiān)控。(5)采血量。抽取全血量通常為8～50ml，常用采血量為30ml。抽取的血液量根據(jù)所需的PRP量和血小板富集度不同而有所變化，比如要制備5ml的PRP，假如血小板富集度為5倍，血小板回收率為80%，那至少需要抽取31.25ml（5×5÷80%=31.25）血液。(6)采血針。建議使用寬口徑針，最好是21G或更粗的針頭或蝴蝶套管用于抽血，以避免血小板意外激活。(7)采血時(shí)間。臨床上基本采用“現(xiàn)采現(xiàn)制”，少數(shù)采用庫(kù)存血來(lái)提取PRP。如果從抽血到離心開(kāi)始所耗的時(shí)間超120s，會(huì)減少23%的PRP產(chǎn)量。抗凝劑PRP制備過(guò)程中，抗凝劑的選擇非常重要。是否加抗凝劑及何時(shí)加抗凝劑都會(huì)影響PRP中組分構(gòu)成和生長(zhǎng)因子的濃度?？鼓齽┓旁谠嚬?、注射器或血袋中，能夠避免血小板的自我激活。一旦血小板激活，大量生長(zhǎng)因子釋放出來(lái)，PRP生物學(xué)效應(yīng)就會(huì)下降?？鼓齽┓N類(lèi)。選擇正確的抗凝劑是制備PRP的關(guān)鍵步驟。常用的抗凝劑主要有檸檬酸葡萄糖A（ACDA）、檸檬酸鹽磷酸葡萄糖（CPD）、乙二胺四乙酸（EDTA）、肝素等。(1)ACDA。又名枸櫞酸鈉，是制備PRP的首選抗凝劑。ACDA具有更低的pH值和細(xì)胞外鈣離子濃度，能夠較長(zhǎng)時(shí)間保持血小板結(jié)構(gòu)的完整性，降低血小板的活化率，預(yù)防血小板聚集。研究表明ACDA制備PRP可獲得較高的血小板濃度，且血小板形態(tài)良好，細(xì)胞碎片及聚集體最少。(2)CPD?？勺鳛橹苽銹RP的備選抗凝劑。但與ACDA相比，其PRP制品中血小板計(jì)數(shù)較少，且細(xì)胞因形態(tài)改變、結(jié)塊或無(wú)細(xì)胞碎片的產(chǎn)生等可能會(huì)對(duì)PRP的生物學(xué)效應(yīng)產(chǎn)生影響。(3)EDTA。對(duì)血小板膜具有破壞作用，使得PRP制品中含有大量非細(xì)胞碎片及聚集體，不推薦用于PRP制備。(4)肝素。肝素與血小板表面結(jié)合可引起血小板聚集、釋放、破壞，造成血小板功能下降，不推薦用于PRP制備?？鼓齽┯昧?。建議抗凝劑體積與采血量的比例為1∶9或1∶10。離心PRP制備的核心步驟是離心。PRP最終制備效果與相對(duì)離心力、離心次數(shù)、離心時(shí)間、離心溫度等密切相關(guān)，臨床中應(yīng)根據(jù)治療需求、環(huán)境及設(shè)備的不同，選擇合適的離心參數(shù)。在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行離心，離心機(jī)必須始終保持水平，離心管必須相互保持平衡。相對(duì)離心力（RCF）RCF是離心機(jī)產(chǎn)生的離心力。離心機(jī)通過(guò)聯(lián)軸器帶動(dòng)轉(zhuǎn)頭高速運(yùn)轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的RCF可使全血中不同沉降系數(shù)的血液成分有效分離。RCF的大小取決于樣品所處的位置至軸心的水平距離即旋轉(zhuǎn)半徑r和轉(zhuǎn)速n，其計(jì)算公式為RCF=1.118×10-5?n2?r×g，其中n指轉(zhuǎn)速（rpm），r指旋轉(zhuǎn)半徑（cm），g為重力加速度。PRP制備時(shí)，無(wú)論所用離心機(jī)類(lèi)型如何，RCF都是相同的。RCF參數(shù)的大小對(duì)PRP中血小板的濃度、形態(tài)結(jié)構(gòu)、分布密度及生長(zhǎng)因子的釋放等均有影響。較高的RCF所產(chǎn)生的高剪切應(yīng)力可能會(huì)導(dǎo)致血小板破壞過(guò)多，或血小板激活誘導(dǎo)血小板自發(fā)聚集，減少PRP中生長(zhǎng)因子釋放，并進(jìn)一步影響到臨床效果。一次離心法中，常見(jiàn)的離心力設(shè)置范圍150～1500g，轉(zhuǎn)速設(shè)置范圍400～3400rpm。不同廠家的PRP制備套裝，不同的醫(yī)務(wù)人員選擇的離心參數(shù)都可能不一樣。在二次離心法中，第一次離心參數(shù)為離心力100～300g，離心時(shí)間5～10min，第二次離心參數(shù)為離心力400～700g，離心時(shí)間10～17min。離心次數(shù)制備PRP通常分為一次離心法、二次離心法和三次離心法。一次離心法常需較大RCF，盡管操作簡(jiǎn)單，但制備的PRP中血小板濃度較低，生長(zhǎng)因子含量相對(duì)較少。二次離心法獲得的PRP中血小板含量和血小板回收率均較高，但紅細(xì)胞混入量相對(duì)較高。三次離心法操作相對(duì)繁瑣，與二次離心法相比，雖可獲得血小板純度更高的PRP，但也會(huì)導(dǎo)致血小板回收率下降，目前臨床上幾乎很少采用。目前臨床上PRP制備主要采用二次離心法（80.2％），一次離心法較少（18.8％）。離心時(shí)間離心時(shí)間對(duì)制備的PRP中血小板濃度及活性有較大影響。離心時(shí)間過(guò)短，PRP中血小板濃度難以達(dá)到治療需求，但長(zhǎng)時(shí)間高速離心則可能破壞血小板細(xì)胞膜而影響生長(zhǎng)因子釋放。因此，應(yīng)根據(jù)臨床需求合理選擇離心參數(shù)，當(dāng)RCF較大時(shí)，離心時(shí)間應(yīng)盡量短，RCF較小時(shí)，離心時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng)。目前臨床上離心時(shí)間通常是5～15min。第一次離心時(shí)最常見(jiàn)的時(shí)間設(shè)置為10min（78.1％），第二次離心時(shí)最常見(jiàn)的時(shí)間設(shè)置為10min（70.3％）,這樣制備的PRP血小板含量較高。離心溫度溫度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響血小板的活性。常溫臺(tái)式離心機(jī)的離心速度越大，離心管表面的溫度越高，過(guò)高的溫度可能會(huì)導(dǎo)致血小板提前激活，致使血小板回收率下降。美國(guó)血庫(kù)學(xué)會(huì)推薦PRP的離心溫度為21～24℃，可獲得更佳的血小板回收率。離心機(jī)(1)離心機(jī)類(lèi)型①普通離心機(jī)和溫控離心機(jī)相較于普通離心機(jī)，溫控離心機(jī)可以設(shè)定并維持PRP制備溫度，提高PRP制備效率，但并非制備PRP所必需。②固定角度離心機(jī)和水平式離心機(jī)固定角度離心機(jī)由于向后的離心力，細(xì)胞首先被推到管的遠(yuǎn)端，然后沿著管后壁向上或向下移動(dòng)，可能導(dǎo)致試管后端的細(xì)胞活化或損傷；水平式離心機(jī)中血小板、紅細(xì)胞等成分的運(yùn)動(dòng)則不受阻礙。PRP制備時(shí)優(yōu)先選擇水平式離心機(jī)。(2)離心機(jī)要求只有刻度盤(pán)且沒(méi)有數(shù)字顯示的離心機(jī)不得用于PRP制備，因?yàn)闊o(wú)法設(shè)置所需的RCF。建議選擇合適的PRP制備專(zhuān)用離心機(jī)，離心操作簡(jiǎn)單，無(wú)需設(shè)置參數(shù)，只需離心按鍵即可完成離心，不僅使用方便，而且可有效防止人為誤差。離心管(1)材料要求離心管材料屬性在PRP制備中起著重要作用。玻璃管具有親水性，允許血小板與管壁接觸激活并促進(jìn)凝血；塑料管和PETA管是疏水性，可以排斥血小板，防止在離心過(guò)程中血小板激活，延遲血凝塊的形成。制備PRP時(shí)，塑料離心管優(yōu)于玻璃離心管。(2)容量要求根據(jù)所需制備的PRP量及采血量，選擇合適容量的PRP離心管，臨床上離心管容量多為10～50ml。(3)形狀要求離心管形狀不同可能影響PRP提取效率，臨床上主要有普通試管形狀、窄管形狀、特殊形狀等。(4)離心管是否預(yù)裝抗凝劑獨(dú)立的PRP專(zhuān)用離心管通常預(yù)裝抗凝劑，部分PRP制備套裝中離心管預(yù)裝抗凝劑。(5)離心開(kāi)始時(shí)間為避免所采集的全血中血小板損失和失活，采血完成后應(yīng)立即將血液轉(zhuǎn)移至裝有抗凝劑的離心管并搖勻，第一時(shí)間置于離心機(jī)中開(kāi)始離心。抽取離心后必須立即將

PRP

與貧血小板血漿（PPP）分離，因?yàn)闈饪s的血小板會(huì)隨著時(shí)間慢慢擴(kuò)散到PPP中。操作人員的個(gè)人習(xí)慣、拿捏尺度、熟練程度等均會(huì)影響PRP制備效率。PRP制備量PRP制備量根據(jù)臨床治療需求的不同而有較大差異，文獻(xiàn)報(bào)道其范圍0.4～30ml不等。一般來(lái)說(shuō)，PRP制備量約占離心前全血（含抗凝劑）體積的12.9％。激活PRP制備完畢后，需要使用相應(yīng)的激活劑來(lái)激發(fā)它的生物學(xué)活性，激活劑的選擇對(duì)生長(zhǎng)因子的釋放方式及釋放量有明顯影響。血小板激活概念在正常血循環(huán)中血小板處于無(wú)活性狀態(tài)，當(dāng)血管內(nèi)皮損傷等凝血因素啟動(dòng)后，血小板被激活。血小板活化包括血小板粘附、聚集和釋放三個(gè)過(guò)程，幾乎同時(shí)發(fā)生。能引起血小板聚集的因素，多數(shù)能引起血小板釋放反應(yīng)。血小板釋放是指血小板受刺激后將儲(chǔ)存在d顆粒、α顆?；騦顆粒內(nèi)的物質(zhì)排出的現(xiàn)象。d顆粒釋放二磷酸腺苷、三磷酸腺苷、5羥色胺、鈣離子等；α顆粒釋放β血小板球蛋白、血小板因子4（PF4）、vWF、纖維蛋白原、凝血因子V（FV）、PDGF、TGFβ、IGF、EGF、VEGF等。血小板激活方式(1)外源性激活（體外激活）PRP使用前在體外通過(guò)化學(xué)方式或物理方式使血小板激活，稱(chēng)為外源性激活。血小板激活導(dǎo)致生長(zhǎng)因子快速釋放，10min內(nèi)可釋放大部分生長(zhǎng)因子。鑒于許多生長(zhǎng)因子的半衰期很短，在注射時(shí)或注射前激活PRP，可能會(huì)產(chǎn)生最大的生物學(xué)效果。一旦PRP被激活，纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)即開(kāi)始形成，凝固血漿并形成纖維蛋白凝塊或膜。常用的化學(xué)激活劑包括凝血酶、10%氯化鈣等，物理激活方式有創(chuàng)傷、光照、冷熱、凍融等。關(guān)于是否需要外源性激活的問(wèn)題仍存在爭(zhēng)議，因?yàn)椴煌腜RP激活劑會(huì)影響最終產(chǎn)物的物理形態(tài)，也可能影響生長(zhǎng)因子的釋放曲線。臨床中某些特殊治療需要外源性激活，如PRP治療骨折等硬組織時(shí)必須使用激活的PRP。目前臨床大多數(shù)商用PRP制備套裝通常不行體外激活PRP。(2)內(nèi)源性激活（體內(nèi)激活）未激活的PRP注入機(jī)體后，在體內(nèi)與纖維狀膠原蛋白、凝血酶等接觸時(shí)會(huì)被激活，稱(chēng)為內(nèi)源性激活。膠原蛋白、體內(nèi)凝血酶等是PRP的天然激活劑，也是一種較弱血小板激活劑。內(nèi)源性激活可使生長(zhǎng)因子長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)釋放，與外源性激活相比，其應(yīng)用于軟組織時(shí)PRP效率更高。血小板激活檢測(cè)血小板被激活后會(huì)釋放β血小板球蛋白、PF4、P選擇素、D二聚體、顆粒膜蛋白140（GMP140）等，臨床上可通過(guò)測(cè)定這些分子的含量，來(lái)了解體內(nèi)血小板的活化情況。保存保存溫度PRP在4、22、37和-80℃保存均有報(bào)道，部分學(xué)者推薦22℃震蕩保存。但低溫會(huì)啟動(dòng)血小板內(nèi)的活化過(guò)程，導(dǎo)致聚集和細(xì)胞死亡；而室溫保存時(shí)，介質(zhì)中細(xì)菌生長(zhǎng)有導(dǎo)致PRP制品污染的風(fēng)險(xiǎn)。因此建議PRP制備后立即使用，以保障最佳治療效果及治療安全。保