項(xiàng)目十八-B淋巴細(xì)胞功能檢測(cè)

項(xiàng)目十八B淋巴細(xì)胞功能檢測(cè)一、溶血空斑試驗(yàn)(Plaqueformingcellassay)【實(shí)驗(yàn)原理】將SRBC免疫動(dòng)物，隔一定時(shí)間取其脾臟制成細(xì)胞懸液，當(dāng)與SRBC混合孵育時(shí)，其中抗體形成細(xì)胞釋放的抗體會(huì)與周圍SRBC特異性結(jié)合，在補(bǔ)體作用下，使這些致敏的SRBC溶解，從而在瓊脂凝膠中的每個(gè)抗體形成細(xì)胞周圍形成一個(gè)肉眼可見的溶血空斑。測(cè)定與補(bǔ)體結(jié)合力強(qiáng)的IgM形成細(xì)胞采用直接方法；測(cè)定與補(bǔ)體結(jié)合力弱的IgG或IgA形成細(xì)胞采用間接法，即實(shí)驗(yàn)中需加入抗免疫動(dòng)物Ig的抗體(二抗)，才能促進(jìn)溶血空斑形成。此處只介紹小鼠瓊脂直接溶血空斑技術(shù)?！驹噭┖推鞑摹?．小白鼠體重18~22g。2．補(bǔ)體豚鼠混合新鮮血清。3．SRBC懸液用Gey液將SRBC洗3次，分別配成2.5×108個(gè)細(xì)胞/ml和5×108個(gè)細(xì)胞/ml濃度的紅細(xì)胞懸液。4．Gey液、瓊脂糖。5．注射器、剪刀、鑷子、不銹鋼網(wǎng)、小平皿、試管、吸管、顯微鏡、溫箱、水浴箱?！静襟E和方法】1．免疫小鼠取1ml2.5×108個(gè)細(xì)胞/ml濃度的SRBC懸液注入小鼠腹腔，或取0.2mlSRBC懸液經(jīng)小鼠尾靜脈注入。2．制備脾細(xì)胞懸液將免疫4天后的小鼠處死，取脾臟制備細(xì)胞懸液(制備方法見動(dòng)物組織中免疫細(xì)胞收集)，用Gey液配成1×107個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液(每只小鼠約加6~10mlGey液)。3．制備底層瓊脂將14g/L瓊脂糖(用Gey液配制)溶化后取2~3ml傾注于水平的小平皿內(nèi)，凝固后去蓋反扣于37℃4．制備頂層瓊脂將5g/L瓊脂糖(用Gey液配制)溶化，置48℃水浴中平衡備用。取脾細(xì)胞懸液和5×108個(gè)細(xì)胞/mlSRBC懸液各0.1ml，再加入未稀釋補(bǔ)體0.05ml，混勻，置48℃水浴平衡片刻。加入0.8ml已平衡好的瓊脂糖，混勻后倒入底層瓊脂上，旋轉(zhuǎn)平皿使之均勻平鋪，凝固后置【結(jié)果判定】1．將平皿置低倍顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。溶血空斑中心有淋巴細(xì)胞，周圍為透明區(qū)。2．全脾中PFC數(shù)計(jì)算：每個(gè)平皿PFC數(shù)×10×脾細(xì)胞懸液體積(ml)或以每百萬脾細(xì)胞所含PFC數(shù)來表示?！咀⒁馐马?xiàng)】1．試驗(yàn)選用Gey液為洗滌液和培養(yǎng)液，優(yōu)于Hanks液、Eagle液和Dullecco液，但工作液需現(xiàn)用現(xiàn)配。2．最好選用近交系小鼠，且鼠齡和體重應(yīng)基本一致。3．制備脾細(xì)胞過程所用Gey液應(yīng)預(yù)先4℃預(yù)冷，制好的細(xì)胞懸液應(yīng)及時(shí)放44．制備頂層瓊脂時(shí)，溫度應(yīng)控制在45～48℃之間，溫度太高細(xì)胞會(huì)失活，過低會(huì)使瓊脂凝固，細(xì)胞不能分散，無法倒入平皿。各細(xì)胞成分要充分混勻，同時(shí)避免出現(xiàn)氣泡；與瓊脂糖混勻、傾倒平皿時(shí)動(dòng)作要敏捷，以免凝固?！痉椒ㄔu(píng)價(jià)】本方法為改良平皿法，穩(wěn)定性較好，常用于體液免疫功能測(cè)定，是臨床研究的可靠指標(biāo)。與經(jīng)典平皿法比較具有簡便、節(jié)省試劑、標(biāo)本可長期保存、敏感性高等優(yōu)點(diǎn)。【臨床意義】可用于研究機(jī)體免疫機(jī)制；篩選藥物并探討其作用機(jī)理及對(duì)免疫功能的影響?！靖健縂ey液配制1液NaCl35gKCl1.85gNa2HPO4·12H2O1.5gKH2PO40.119g葡萄糖5g酚紅50mg加蒸餾水至1000ml。2液MgCl2·6H2O0.42gMgSO4·7H2O0.14CaCl20.34g加蒸餾水至1000ml。3液NaHCO32.25g加蒸餾水至1000ml。以上均高壓滅菌(112℃【思考題】溶血空斑試驗(yàn)有哪些方法類型？檢測(cè)人不同Ig形成細(xì)胞的溶血空斑試驗(yàn)常用何種方法？它們的原理如何？二、溶血素測(cè)定法(Hemolysinquantitativedetermination)【實(shí)驗(yàn)原理】SRBC免疫的動(dòng)物血清中存在有溶血素，在補(bǔ)體存在下能使溶血素致敏的SRBC發(fā)生溶血反應(yīng)，用分光光度計(jì)檢測(cè)溶血釋放的血紅蛋白，即可確定免疫動(dòng)物血清中溶血素的含量，從而可評(píng)價(jià)機(jī)體體液免疫功能狀態(tài)?！驹噭┖推鞑摹?．小白鼠18~22g。2．SRBC懸液將SRBC用生理鹽水洗3次，按壓積用生理鹽水配成10％濃度(約2×109/ml)，用于免疫小鼠。另按壓積用工作BBD配成4％的濃度，用于測(cè)定溶血素。3．補(bǔ)體豚鼠混合新鮮血清，用時(shí)用工作BBD1:30稀釋。4．貯存BBD(5×)和工作BBD配制見補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)。5．氰化高鐵血紅蛋白試劑(都氏試劑)NaHCO31.0gKCN0.05gK3Fe(CN)60.2g吐溫800.5ml加蒸餾水至1000ml。6．注射器、眼科鑷子、試管、離心管、吸管、水浴箱、分光光度計(jì)?！静襟E和方法】1．溶血素制備(1)取0.2ml10％SRBC懸液給小鼠腹腔注射，每天1次，連續(xù)注射3天。(2)未次注射后6~8天時(shí)摘除小鼠眼球取血，分離血清。(3)將血清用工作BBD1:10稀釋，置56℃作用30min后備用2．溶血素測(cè)定(1)取1:10稀釋血清及4％SRBC懸液各0.2ml，混勻后置37℃(2)加入工作BBD0.8ml，1:30稀釋補(bǔ)體0.8ml，混勻，置37℃水浴1h(或放4(3)到時(shí)取出離心2000r/min10min。取上清液1ml，加入氰化高鐵血紅蛋白試劑3ml，混勻，置室溫10min后測(cè)A540nm吸光度。3．50％溶血(CH50)管制備。(1)取0.1ml4％SRBC懸液，加入1.5ml蒸餾水，完全溶血后再加入貯存BBD0.4ml，混勻。(2)取出1ml，加入氰化高鐵血紅蛋白試劑3ml，混勻，置室溫10min后測(cè)吸光度，用氰化高鐵血紅蛋白試劑做空白對(duì)照。測(cè)值為1個(gè)CH50的吸光度?！窘Y(jié)果判定】1．CH50單位計(jì)算：2．以CH50單位數(shù)表示溶血素含量?！咀⒁馐马?xiàng)】1．溶血素測(cè)定所用玻璃器材必需十分潔凈。2．補(bǔ)體最好用混合的新鮮豚鼠血清，用前臨時(shí)稀釋。3．溶血素測(cè)定管離心后發(fā)現(xiàn)完全溶血，或溶血甚微，應(yīng)將測(cè)試血清稀釋度調(diào)整后再重新測(cè)定。4．SRBC不能溶血，應(yīng)作SRBC-補(bǔ)體對(duì)照：取4％SRBC懸液0.2ml，加入工作BBD1.0ml，1:30稀釋補(bǔ)體0.8ml；按實(shí)驗(yàn)溫育、離心后應(yīng)無溶血現(xiàn)象?？瞻讓?duì)照：取該上清液1.0ml，加入氰化高鐵血紅蛋白試劑3.0ml，置室溫10min，應(yīng)以此作為溶血素比色測(cè)定的空白對(duì)照管。5．收獲免疫血清時(shí)應(yīng)避免溶血，若溶血嚴(yán)重，測(cè)定結(jié)果應(yīng)予校正：取1:10稀釋血清0.1ml，加入工作BBD0.5ml，1:30稀釋補(bǔ)體0.4ml，氰化高鐵血紅蛋白試劑3ml，混勻，置室溫10min后以氰化高鐵血紅蛋白試劑為空白對(duì)照測(cè)吸光度，并以下式校正結(jié)果。6．溶血素測(cè)定時(shí)4℃【方法評(píng)價(jià)】此法簡便、重復(fù)性好、結(jié)果準(zhǔn)確、客觀?！九R床意義】常用于藥物篩選及免疫藥理作用的研究?！舅伎碱}】該試驗(yàn)與補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)中的溶血素測(cè)定、血清總補(bǔ)體活性測(cè)定在原理、方法和應(yīng)用上有何異同？三、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(Enzyme-linkedimmunospotassay)【實(shí)驗(yàn)原理】酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISPOT)試驗(yàn)是一種直接檢測(cè)細(xì)胞分泌產(chǎn)物的方法，以此可評(píng)價(jià)被測(cè)細(xì)胞的功能、特性。其原理與ELISA類似，此處以測(cè)定B細(xì)胞分泌抗體活性介紹其檢測(cè)原理。該方法是用已知抗原包被組織培養(yǎng)板或平皿，再加入B細(xì)胞培養(yǎng)3～4h，B細(xì)胞沉積到底部，分泌的抗體可與鄰近包被抗原結(jié)合，就像一個(gè)細(xì)胞的足印。因此在加入酶標(biāo)抗相應(yīng)同種型Ig抗體(二抗)并經(jīng)酶促反應(yīng)后，底物形成不溶性顏色斑點(diǎn)，據(jù)此可檢測(cè)抗體的含量；并可在低倍光學(xué)顯微鏡下通過計(jì)數(shù)斑點(diǎn)即可知抗體形成細(xì)胞數(shù)?！驹噭┖推鞑摹?．抗原包被緩沖液PBS。2．封閉液含5%的新生小牛血清(NCS)或含1%的牛血清白蛋白(BSA)的PBS。3．PBS-T加入0.005%Tween-20及0.1%BSA的PBS。4．RPMI-1640培養(yǎng)液含5%NCS。4．HRP或堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗。6．1.2％瓊脂糖用雙蒸水配制，加熱溶化。7．1％瓊脂糖用PBS-T溶液配制。用前加熱溶化，置46℃水浴平衡8．凝膠底物(1)HRP-底物：將50mg1,4-對(duì)苯二胺(1,4-p-phenylenediamine，PPD)溶于2ml甲醇中，在應(yīng)用前加入50μl30%H2O2和46℃預(yù)溫的1％(2)堿性磷酸酶底物：5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸(5-bromo-4-chloro-3-indolylpho-sphate，BCIP)與等體積的1.2％瓊脂糖混合。BCIP與堿性磷酸酶反應(yīng)形成藍(lán)色斑點(diǎn)。9．可溶性底物(1)HRP底物：25mg3-氨基-9-乙基咔巴唑(3-amino-9-ethycarbazole，AEC)溶于2ml二甲基甲酰胺(dimethylformamide，DMF)中，加入95ml0.1mol/L醋酸鈉緩沖液(pH5.0)。經(jīng)0.45m濾膜過濾，除去沉淀，獲無色溶液，加入40l30%H2O(2)堿性磷酸酶底物：將15mgBCIP和30mgNBT分別溶于1mlDMP中。BCIP和NBT溶液與100ml0.1mol/LNaHCO3-1.0mol/LMgCl2(pH9.8)混合。BCIP或BCIP-NBT與堿性磷酸酶反應(yīng)形成藍(lán)色斑點(diǎn)。10．96孔板聚苯乙烯培養(yǎng)板(亦可用6孔、24孔、48孔板)，或聚苯乙烯平皿(直徑為40~50mm)，或帶有硝酸纖維膜的96孔板；微量移液器、CO2孵育箱、光學(xué)顯微鏡等。【步驟和方法】1．包被用PBS將抗原作適當(dāng)稀釋后包被聚苯乙烯培養(yǎng)板或聚苯乙烯平皿，4℃過夜或37℃孵育2h。用PBS洗滌平皿或培養(yǎng)板3次，每次2~3min。包被好的平皿或培養(yǎng)板置2．封閉加入封閉液，每孔200l，平皿為2ml，置373．加樣反應(yīng)加入用RPMI-1640稀釋的抗體分泌細(xì)胞(1×106/ml)，每孔100~200l，平皿為2ml。置37℃5%CO2的溫箱3~4h或過夜。用PBS-T洗滌去除細(xì)胞，方法同上。注意防止4．結(jié)果測(cè)定：每孔加入酶標(biāo)二抗50~100l(2ml/平皿)，置室溫(25℃)2~3h或4℃過夜。用PBS洗滌3次。(1)凝膠底物法加凝膠底物，每孔50~100l，平皿為2ml，快速振搖微孔板或平皿使凝膠平鋪，置室溫使凝膠凝固(需(2)可溶性底物法加可溶性底物50l至96孔板(盛有硝酸纖維膜)。首先加入堿性磷酸酶底物，置室溫5~10min，顯藍(lán)色斑點(diǎn)，用PBS漂洗；然后加入HRP底物，再置【結(jié)果判定】可在低倍鏡下計(jì)數(shù)斑點(diǎn)形成細(xì)胞(spot-fomingcells，SFC)。陰性和空白對(duì)照應(yīng)無斑點(diǎn)出現(xiàn)。有斑點(diǎn)形成為陽性，無斑點(diǎn)出現(xiàn)為陰性?！咀⒁馐马?xiàng)】1．實(shí)驗(yàn)條件應(yīng)統(tǒng)一；并做好陰性、陽