2024年人教版高考生物一輪復(fù)習(xí)：綜合PCR的基因工程問題

復(fù)習(xí)材料

專題突破10綜合PCR的基因工程問題

闡述常規(guī)PCR、重疊延伸PCR、熒光定量PCR等的過程與原理，舉例說明不

課標(biāo)要求

同的PCR技術(shù)有著不同的應(yīng)用。

2023?江蘇-T222023?山東-T252022-江蘇-T24

2022?山東?T25

考情分析幾種不同PCR的應(yīng)用

2021?全國甲-T382021?山東?T252020?北京-T12

2020?江蘇-T33

類型一利用PCR技術(shù)獲取目的基因

【基本模型】

獲取目的基因是基因工程操作的第一步。獲取目的基因的方法有多種，現(xiàn)在常用PCR特異性

地快速擴增目的基因。PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫。它是一項根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原

理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對目的基因的核甘酸序列進(jìn)行大量

復(fù)制的技術(shù)。該技術(shù)由穆里斯等人于1985年發(fā)明，為此，穆里斯于1993年獲得了諾貝爾化

學(xué)獎。

【典例突破】

1.“X基因”是DNA分子上一個有遺傳效應(yīng)的片段，若要用PCR技術(shù)特異性地拷貝“X

基因”，需在PCR反應(yīng)中加入兩種引物，兩種引物及其與模板鏈的結(jié)合位置如圖1所示。下

列敘述錯誤的是（）

A.第一輪復(fù)制得到2個DNA分子，即①②各一個

B.第二輪復(fù)制得到4個DNA分子，即①②③④各一個

C.第四輪復(fù)制得到16個DNA分子，其中有4個X基因

D.經(jīng)五輪循環(huán)后產(chǎn)物中有五種不同的DNA分子

答案C

解析據(jù)圖分析可知，第一輪復(fù)制形成2個DNA分子，即①②各一個，A正確；第二輪復(fù)制

得到22=4（個）DNA分子，即①復(fù)制得①和③、②復(fù)制得②和④，即得到①②③④各一個，B

正確；第四輪復(fù)制得到16個DNA分子，其中有8個⑤（X基因），C錯誤；經(jīng)五輪循環(huán)后共

形成32個DNA分子，其中①②各一個，③④各四個，22個⑤，故產(chǎn)物中有五種不同的DNA

分子，D正確。

類型二利用PCR技術(shù)鑒定目的基因的連接方式

【基本模型】

檢測目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)是否穩(wěn)定存在是基因工程操作的重要步驟，可以借助載體上的標(biāo)

記基因、PCR技術(shù)和核酸分子雜交技術(shù)等方法鑒定受體細(xì)胞中是否轉(zhuǎn)入了目的基因。在實際

復(fù)習(xí)材料

操作中，PCR技術(shù)不僅可以精準(zhǔn)地鑒定受體細(xì)胞是否轉(zhuǎn)入目的基因，還可以通過引物的巧妙

設(shè)計鑒定目的基因的連接方式。

【典例突破】

2.(2019?江蘇，33節(jié)選)為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質(zhì)粒，擬

設(shè)計引物進(jìn)行PCR鑒定。圖示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質(zhì)粒中的相應(yīng)位置，PCR

鑒定時應(yīng)選擇的一對引物是。某學(xué)生嘗試用圖中另外一對引物從某一菌落的質(zhì)粒中

擴增出了400bp片段，原因是。

答案乙、丙目的基因反向連接

解析分析題圖可知，理論上可以選擇的引物組合有甲和丙、乙和丙兩種情況。如果選擇甲和

丙這對引物，則無論目的基因是否正確插入，擴增的片段都是50+300+100=450(bp),不符

合要求；如果選擇乙和丙這對引物，正向連接和反向連接后所得結(jié)果不同，所以應(yīng)選擇乙和

丙這對引物進(jìn)行PCR鑒定。如果目的基因和質(zhì)粒反向連接，則引物乙會出現(xiàn)在重組質(zhì)粒的外

側(cè)，此時若加入引物甲和乙，則可以擴增出300+100=400(bp)的片段。

類型三利用PCR技術(shù)引導(dǎo)基因定點突變

【基本模型】

重疊延伸PCR技術(shù)是指在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，采用具有互補末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成

了重疊鏈，通過重疊鏈的延伸，將不同來源的片段重疊拼接起來的一項新技術(shù)。該技術(shù)在基

因的定點突變、長片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的擴增等方面有著獨特的應(yīng)用。

【典例突破】

3.水蛭素是一種蛋白質(zhì)，可用于預(yù)防和治療血栓。某科研團隊運用重疊延伸PCR技術(shù)在水

蛭素基因中的特定位點引入特定突變，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密碼子為AAC、AAU)

替換為賴氨酸(密碼子為AAA、AAG),從而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如圖。

注：圖中的引物2和3的突起處代表與模板鏈不能互補的突變位點。

(1)由以上事例可知，要對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，需要通過來完成。

(2)若擬突變位點的堿基對為A-T,則需要讓其突變?yōu)椴拍苓_(dá)到目的。引物2

的突變位點(突起處)應(yīng)設(shè)計為(假設(shè)引物為單鏈DNA)。

(3)在第一階段獲得2種具有重疊片段DNA的過程中，引物1、引物2組成的反應(yīng)系統(tǒng)和引

物3、引物4組成的反應(yīng)系統(tǒng)中均進(jìn)行一次復(fù)制，共產(chǎn)生一種DNA分子。該階段必須將引

物1、2和引物3、4置于不同反應(yīng)系統(tǒng)中，這是因為

O

(4)利用重疊延伸PCR技術(shù)還可以將兩個不同來源的DNA片段拼接起來。有人想利用該技術(shù)

把基因M和N拼接在一起，設(shè)計基因M的引物Mi、M2,基因N的引物NI、N2O在設(shè)計這

4種引物時，特別要注意的問題是

復(fù)習(xí)材料

答案(1)改造基因(或基因定點突變)(2)T—A或C-GA或G(3)3引物2和3中存在互補配對片

段，置于同一反應(yīng)系統(tǒng)時會結(jié)合而失去作用

(4)Mi、M2中的一種引物與Ni、用中的一種引物必須具有互補配對的片段

解析(2)若擬突變位點的堿基對為A-T,則需要讓其突變?yōu)門-A或C-G,對應(yīng)的密碼子由

AAU變成AAA或由AAC變成AAG,可使天冬酰胺替換為賴氨酸。(3)若兩個反應(yīng)系統(tǒng)均進(jìn)

行一次復(fù)制，則會產(chǎn)生3種不同的DNA分子，因為引物1和4產(chǎn)生的DNA分子是一樣的。

(4)重疊互補引物的設(shè)計是重疊延伸PCR技術(shù)成功的關(guān)鍵。拼接基因M和N時，設(shè)計引物時

需要注意的是，需要找到兩種基因的重疊部分，即Mi、M2中的一種引物與Ni、N2中的一種

引物必須具有互補配對的片段。

類型四利用PCR技術(shù)擴增未知基因序列

【基本模型】

利用PCR技術(shù)進(jìn)行基因擴增時，為了便于設(shè)計引物，要求目的基因兩側(cè)的序列是已知的。

當(dāng)DNA的某些序列已知，而需要擴增已知序列兩端的未知序列時，可采用反向PCR技術(shù)。

【典例突破】

4.(2020?江蘇，33節(jié)選)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，簡捷地分析出

已知序列兩側(cè)的序列，具體流程如圖(以EcoRi酶切為例)：

請據(jù)圖回答問題：

(1)步驟I用的EcoRI是一種酶，它通過識別特定的切

割特定位點。

(2)步驟H用的DNA連接酶催化相鄰核昔酸之間的3,一羥基與5'—磷酸間形成

；PCR循環(huán)中，升溫到95℃是為了獲得；ThqDNA聚合酶的

作用是催化

(3)若如表所列為已知的DNA序列和設(shè)計的一些PCR引物，步驟III選用的PCR引物必須是

(從引物①②③④中選擇，填編號)。

DNA序列(虛線處省略了部分核甘酸序列)

5^-AACTATGCGCTCATGA----GCAATGCGTAGCCTCT-3Z

已知序列11111111111111111111111111111111

3^-TTGATACGCGAGTACT----CGTTACGCATCGGAGA-5Z

①5'—AACTATGCGCTCATGA-3'

(2)5,-GCAATGCGTAGCCTCT-3'

PCR弓I物

③5'-AGAGGCTACGCATTGC-3'

@5'-TCATGAGCGCATAGTT-3'

答案⑴限制性內(nèi)切核酸(或限制)核甘酸序列

(2)磷酸二酯鍵DNA單鏈以DNA為模板的DNA鏈的延伸(3)②④

解析(3)PCR過程中，根據(jù)已知的DNA序列合成兩個引物，要注意模板鏈和引物的方向是相

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反的，引物的核昔酸序列要能夠和相應(yīng)模板的核昔酸序列發(fā)生堿基互補配對，環(huán)狀DNA圖

中顯示PCR過程是從已知DNA序列的兩端分別向相反方向形成子鏈，一個引物是與已知

DNA序列的第一條鏈的左端互補結(jié)合，向右側(cè)方向延伸形成子鏈，該引物是④，另一個引物

是與已知DNA序列的第二條鏈的右端互補結(jié)合，向左側(cè)方向延伸形成子鏈，該引物是②。

類型五利用PCR技術(shù)快速檢測病原體

【基本模型】

病原體檢測是診斷和控制傳染病的重要手段，為迅速而準(zhǔn)確地確定病原體的存在和種類，發(fā)

展了許多快速檢測方法。PCR技術(shù)是一種基于DNA擴增原理的快速病原體檢測方法，它能

夠在幾小時內(nèi)擴增和檢測極小量的病原體DNA,并且具備高度的特異性和敏感性。

【典例突破】

5.(2024?煙臺高三一模)人類猴痘由Yaba猴病毒(雙鏈DNA病毒)引起，實時熒光定量

PCR(qPCR)可用于Yaba猴病毒的快速檢測。進(jìn)行qPCR時，在反應(yīng)體系加入Taqman探針,

Taqman探針兩端連有熒光基團(R)和抑制熒光發(fā)出的淬滅基團(Q),完整的Taqman探針不發(fā)

出熒光，當(dāng)探針被水解后R基團會發(fā)出熒光(如圖所示)，隨循環(huán)次數(shù)的增加，熒光信號強度

增加。

(1)采用qPCR檢測Yaba猴病毒需在一定的溶液中才能進(jìn)行，反應(yīng)體系中還需提

供DNA模板、原料、、Tagman探針、7agDNA聚合酶、Mg2+等。qPCR過程中，

ZhqDNA聚合酶的兩個作用是o

⑵qPCR檢測病毒的核酸一般具有特異性強和靈敏度高的特點，這與反應(yīng)體系中加入的

和有關(guān)。但有時也可能會出現(xiàn)“假陰性”的結(jié)果。可能的原因有

_______________________________________________________________________(答出兩點)。

(3)在PCR反應(yīng)體系中一般都要加入Mg2+,原因是。為了探

究Mg2+對PCR擴增效果的影響，科研人員在PCR反應(yīng)體系中加入不同濃度的Mg2+進(jìn)行了

實驗。結(jié)果如圖所示，據(jù)此可得出的結(jié)論有________________________________________

答案(1)緩沖引物催化合成DNA子鏈；催化探針?biāo)?2)引物探針取樣不規(guī)范；取樣所獲樣本

量不足；病毒發(fā)生了基因突變(3)7hqDNA聚合酶需要Mg2+激活在不含Mg2+的緩沖液中靶基

因幾乎無法擴增；在不同濃度的Mg2+緩沖液中靶基因的擴增效果不同；在實驗濃度下，4mM

為最佳濃度

解析(3)真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶(7aqDNA聚合酶)都需要Mg2+激活；分析題圖可知，⑥

為陰性對照組，其熒光強度非常弱，意味著不加Mg2+的緩沖液中靶基因幾乎無法擴增；而加

了不同濃度的Mg2+的緩沖液對應(yīng)的曲線①②③④⑤熒光強度均高于⑥，且③曲線(Mg2+濃度

為4mM)的峰值對應(yīng)的熒光強度最高，說明在不同濃度的Mg2+緩沖液中靶基因的擴增效果不

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同；在實驗濃度下，4mM為最佳濃度。

課時精練

一、選擇題

1.（2024?廈門高三質(zhì)檢）如圖表示PCR過程中某個階段反應(yīng)體系的情況，①②③④表示相關(guān)

物質(zhì)，L、R表示方向。下列敘述正確的是（）

A.②鏈從L到R的方向為3'-5',①②鏈均可作為子鏈合成的模板

B.PCR過程需要通過解旋酶斷開氫鍵，且為邊解旋邊復(fù)制

C.以1個DNA為模板經(jīng)3次循環(huán)需消耗8個引物③

D.物質(zhì)③的5,端添加了某序列，至少需經(jīng)2次循環(huán)才可獲得該序列的雙鏈產(chǎn)物

答案D

解析根據(jù)DNA分子中兩條鏈的反向平行關(guān)系可判斷，②鏈從L到R的方向為5,-3',A

錯誤；PCR過程是通過高溫將雙鏈DNA之間的氫鍵斷開，并且是全部解旋之后才進(jìn)行復(fù)制,

B錯誤；以1個DNA為模板經(jīng)3次循環(huán)產(chǎn)生的DNA分子數(shù)目為23=8,需消耗7個引物③,

C錯誤。

2.（2024?重慶高三質(zhì)檢）不對稱PCR是利用不等量的一對引物來產(chǎn)生大量單鏈DNA（ssDNA）

的方法，如圖所示。不對稱PCR中加入的一對引物中含量較少的被稱為限制性引物，含量較

多的被稱為非限制性引物，兩者的比例通常為1：100,PCR反應(yīng)最初的若干次循環(huán)中，其擴

增產(chǎn)物主要是雙鏈DNA（dsDNA）,但當(dāng)限制性引物消耗完后，就會產(chǎn)生大量的ssDNA。下列

相關(guān)說法錯誤的是0

A.用不對稱PCR方法擴增目的基因時，不需要知道基因的全部序列

B.進(jìn)行最初若干次循環(huán)的目的是增加模板DNA的量

C.最后大量獲得的ssDNA與圖中乙鏈的堿基序列一致

D.因為雙鏈DNA和單鏈DNA的分子量大小不同，可通過電泳方法將其分離

答案C

解析不對稱PCR中加入的一對引物中含量較多的被稱為非限制性弓I物，非限制性引物是與乙

鏈結(jié)合，最后大量獲得的ssDNA與圖中甲鏈的堿基序列一致，C錯誤。

3.（2024?無錫高三模擬）重疊延伸PCR可實現(xiàn)定點基因誘變，其操作過程如圖所示（凸起處代

表突變位點）。下列說法正確的是0

A.過程①需要把兩對引物同時加入一個擴增體系以提高擴增效率

B.過程①需要2輪PCR才能得到圖中所示PCR產(chǎn)物

C.過程②的產(chǎn)物都可以完成延伸過程

D.若過程④得到16個突變基因則需要消耗15個通用引物RP2

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答案D

解析兩種突變引物能互補配對，因此過程①必須分兩個反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行，A錯誤；過程①至少

需要3輪PCR才能得到圖中所示PCR產(chǎn)物，B錯誤；過程②獲得的產(chǎn)物不都可以完成延伸

過程，因為子鏈只能從引物的3'端開始延伸，C錯誤；若過程④得到16個突變基因，由于

模板中不含有通用弓I物，則產(chǎn)生16個突變基因共需要消耗16X2—2=30（個）通用弓I物，而需

要通用引物RP2的數(shù)量為30+2=15（個），D正確。

4.反向PCR是一種通過已知序列設(shè)計引物對未知序列（圖中L、R）進(jìn)行擴增的技術(shù)，其過程

如圖所示。下列相關(guān)敘述不正確的是（）

A.過程①用同一種限制酶對未知序列兩端進(jìn)行切割

B.過程②需要使用DNA連接酶，形成磷酸二酯鍵

C.過程③PCR體系需要添加耐高溫的DNA聚合酶和解旋酶

D.該技術(shù)可檢測T—DNA整合到植物染色體DNA的位置

答案C

解析過程③即PCR擴增，PCR技術(shù)中DNA解旋是在高溫下實現(xiàn)的，不需要加入解旋酶，C

錯誤。

5.IKK激酶參與動物體內(nèi)免疫細(xì)胞的分化。臨床上發(fā)現(xiàn)某重癥聯(lián)合免疫缺陷（SCID）患兒的

區(qū)即基因編碼區(qū)第1183位堿基T突變?yōu)镃。為研究該患兒發(fā)病機制，研究人員應(yīng)用大引物

PCR定點誘變技術(shù)獲得突變基因，如圖所示。下列說法錯誤的是（）

A.PCR中使用的引物有引物/、引物C

B.PCR2中使用的引物有引物8、大引物b鏈

C.PCR1過程需要擴增3輪才能獲得目標(biāo)產(chǎn)物

D.PCR2過程中，為減少錯誤DNA片段的產(chǎn)生可適當(dāng)升高復(fù)性溫度

答案C

解析在PCR中，需要兩種弓I物，將來在切取IKKp基因時，在基因的左側(cè)需要用限制酶HindHI

來切割，在基因的右側(cè)用限制酶SacI切割，因此在PCR|中結(jié)合到基因右端的引物選擇引物

C,從題圖中看，另一個引物應(yīng)含有突變堿基C,所以選擇引物/,A正確；在PCR2中，有

一個引物結(jié)合到了基因的左端，應(yīng)含有限制酶/"dill識別的序列，所以要用到引物3,而另

外的一個引物就是大引物中的一條鏈，它應(yīng)該結(jié)合到基因的右端，且從5,端到3,端的序列

中開始部位應(yīng)含有SacI識別的序列，從圖中看，它是大引物的b鏈，B正確；PCR過程主

要是為了獲得大引物，則擴增2輪即可獲得目標(biāo)產(chǎn)物，C錯誤；由于大引物較長，含C與G

的堿基較多，為減少非目的基因的獲得，在PCR?復(fù)性過程中應(yīng)適當(dāng)提高溫度，便于引物與

模板鏈的結(jié)合，D正確。

6.（2024?安順高三調(diào)研）熒光定量PCR技術(shù)可定量檢測樣本中DNA含量，用于病毒檢測。其

原理是在PCR反應(yīng)體系中加入引物的同時，加入與某條模板鏈互補的熒光探針。當(dāng)耐高溫的

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DNA聚合酶催化子鏈延伸至探針處會水解探針，使熒光監(jiān)測系統(tǒng)接收到熒光信號，即每擴增

一次，就有一個熒光分子生成（如圖）。通過實時檢測熒光信號強度，可得Ct值（熒光信號達(dá)到

設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù)）。下列相關(guān)敘述錯誤的是（）

A.PCR每個循環(huán)包括變性、復(fù)性（引物和模板結(jié)合）、延伸3個階段

B.耐高溫的DNA聚合酶在該反應(yīng)中的作用是形成磷酸二酯鍵

C.最終監(jiān)測的熒光強度與起始時反應(yīng)管內(nèi)樣本DNA的含量呈正相關(guān)

D.Ct值越大表示被檢測樣本中病毒數(shù)目越多，患者危險性更高

答案D

解析Ct值越小，說明所需循環(huán)的次數(shù)越少，被檢測樣本中病毒數(shù)目越多，D錯誤。

7.（2024?襄陽高三模擬）通過設(shè)計引物，運用PCR技術(shù)可以實現(xiàn)目的基因的定點誘變。如圖

為基因工程中獲取突變基因的過程，其中引物1序列中含有一個堿基T不能與目的基因片段

配對，但不影響引物與模板鏈的整體配對，反應(yīng)體系中引物1和引物2的5,端分別設(shè)計增

加限制酶a和限制酶b的識別位點。下列有關(guān)敘述不正確的是（）

A.引物中設(shè)計兩種限制酶識別位點有利于目的基因定向插入

B.復(fù)性溫度過高會導(dǎo)致引物不能與模板牢固結(jié)合，PCR擴增效率下降

C.第3輪PCR,引物1能與圖中②結(jié)合并且形成兩條鏈等長的突變基因

D.第3輪PCR結(jié)束后，含突變堿基對且兩條鏈等長的DNA占1/2

答案D

解析引物中設(shè)計兩種限制酶識別位點，可以配合載體的限制酶識別位點，幫助目的基因定向

插入載體，避免發(fā)生自身連接，A正確；PCR技術(shù)中，復(fù)性溫度過高會導(dǎo)致引物不能與互補

DNA鏈（模板）牢固結(jié)合，PCR擴增效率下降，B正確；第3輪PCR結(jié)束后，含突變堿基對

且兩條鏈等長的DNA有1個，而子代DNA有23=8（個），故含突變堿基對且兩條鏈等長的

DNA占1/8,D錯誤。

8.（2024-南通高三調(diào)研）如圖是被農(nóng)桿菌侵染的水稻植株的DNA片段，研究者將其連接成環(huán)，

并以此環(huán)為模板進(jìn)行PCR,擴增出T—DNA插入位置兩側(cè)的未知序列，據(jù)此來確定T—DNA

插入的具體位置。下列有關(guān)說法錯誤的是（）

A.農(nóng)桿菌在自然條件下主要侵染雙子葉植物和裸子植物，T—DNA存在于其Ti質(zhì)粒上

B.利用圖中的引物②③組合可擴增出兩側(cè)的未知序列

C.若擴增循環(huán)〃次，需要2〃+i—2個引物

D.將擴增出的未知序列與水稻基因組序列比對可確定T—DNA的插入位置

答案B

解析農(nóng)桿菌在自然條件下主要侵染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能

力，A正確；耐高溫的DNA聚合酶可在引物的3,端延伸子鏈，因此利用圖中的引物①④組

合可擴增出兩側(cè)的未知序列，B錯誤；擴增循環(huán)n次，得到2"個DNA分子，總單鏈數(shù)為2X2”

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即2"+1條，只有最初的2條母鏈不需要引物，因此共需要2。+1—2個引物，C正確；不同的

DNA分子或DNA區(qū)段具有特異性，將擴增出的未知序列與水稻基因組序列比對可確定T—

DNA的插入位置，D正確。

9.實時熒光定量RT—PCR技術(shù)需要在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上添加熒光染料或熒光探針，熒光染

料能特異性摻入DNA雙鏈中，從而發(fā)出熒光信號。在流感流行季節(jié)，對懷疑流感病毒感染

的患者，可以通過實時熒光定量RT—PCR技術(shù)進(jìn)行核酸檢測。下列相關(guān)敘述不正確的是0

A.圖中的探針可能是利用熒光分子標(biāo)記的流感病毒獨特的基因序列

B.核酸檢測是通過檢測熒光信號來確定樣本中是否有病毒核酸的

C.PCR技術(shù)利用了DNA雙鏈復(fù)制的原理，需要解旋酶和耐高溫的DNA聚合酶的催化

D.用熒光RT—PCR技術(shù)測定病毒的核酸具有特異性

答案C

解析PCR技術(shù)利用了DNA雙鏈復(fù)制的原理，不需要解旋酶，可通過高溫使DNA雙鏈解開,

但需要耐高溫的DNA聚合酶的催化，C錯誤。

二、非選擇題

10.(2023?江蘇，22節(jié)選)為了將某納米抗體和綠色熒光蛋白基因融合表達(dá)，運用重組酶技術(shù)

構(gòu)建質(zhì)粒，如圖1所示。請回答下列問題：

⑴分別進(jìn)行PCR擴增片段F1與片段F2時，配制的兩個反應(yīng)體系中不同的有

,擴增程序中最主要的不同是?

(2)將PCR產(chǎn)物片段與線性質(zhì)粒載體混合后，在重組酶作用下可形成環(huán)化質(zhì)粒，直接用于轉(zhuǎn)

化細(xì)菌。這一過程與傳統(tǒng)重組質(zhì)粒構(gòu)建過程相比，無需使用的酶主要有o

(3)轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌需采用含有抗生素的培養(yǎng)基篩選，下列敘述錯誤的有o

A.稀釋涂布平板需控制每個平板30-300個菌落

B.抗性平板上未長出菌落的原因一般是培養(yǎng)基溫度太高

C.抗性平板上常常會出現(xiàn)大量雜菌形成的菌落

D.抗性平板上長出的單菌落無需進(jìn)一步劃線純化

(4)為了驗證平板上菌落中的質(zhì)粒是否符合設(shè)計，用不同菌落的質(zhì)粒為模板、用引物Fl—F

和F2-R進(jìn)行了PCR擴增，質(zhì)粒P1?P4的擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖2。根據(jù)圖中結(jié)果判斷，

可以舍棄的質(zhì)粒有。

(5)對于PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果符合預(yù)期的質(zhì)粒，通常需進(jìn)一步通過基因測序確認(rèn)，原因是

答案⑴模板、引物引物的設(shè)計(2)限制酶、(T4)DNA連接酶(3)ABC(4)P3、P4(5)電泳只能檢測

DNA分子的大小(長度)，無法確定待檢測DNA分子的堿基序列

解析⑴PCR反應(yīng)進(jìn)行的條件：弓I物、酶、dNTP、模板和緩沖液(其中需要Mg2+)。分別進(jìn)行

復(fù)習(xí)材料

PCR擴增片段Fl與片段F2時，配制的兩個反應(yīng)體系中不同的有模板（片段F1、片段F2）、

引物。PCR過程需要兩種引物，能分別與目的基因兩條鏈的3'端通過堿基互補配對結(jié)合。

引物設(shè)計是決定PCR反應(yīng)成敗的最主要因素。（2）傳統(tǒng)重組質(zhì)粒構(gòu)建需要使用限制性內(nèi)切核

酸酶（限制酶）切割質(zhì)粒，使其具有與目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA連接酶將目的

基因和質(zhì)粒連接成重組質(zhì)粒。將PCR產(chǎn)物片段與線性質(zhì)粒載體混合后，在DNA連接酶的作

用下可形成環(huán)化質(zhì)粒，不需要使用限制性內(nèi)切核酸酶（限制酶）。（3）用稀釋涂布平板法培養(yǎng)計

數(shù)時，為了使結(jié)果更準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)為30?300的平板，A錯誤；培養(yǎng)基冷卻后才接

種，故抗性平板上未長出菌落不是因為培養(yǎng)基溫度太高，B錯誤；轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌需采用

含有抗生素的培養(yǎng)基篩選，一般含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌才能發(fā)展為菌落，故不會出現(xiàn)大量

雜菌形成的菌落，C錯誤；稀釋涂布平板法和平板劃線法均為分離純化細(xì)菌的方法，用稀釋

涂布平板法接種后在抗性平板上長出的單菌落無需進(jìn)一步劃線純化，D正確。（4）EGFP為

720bp,AnBl為390bp,二者的總大小為720+390=1100（bp）,用引物Fl—F和F2-R進(jìn)行

PCR擴增，其大小接近于Pl、P2,根據(jù)圖中結(jié)果判斷，可以舍棄的質(zhì)粒有P3、P4o（5）瓊脂

糖凝膠電泳技術(shù)僅能用于分析待檢測DNA分子的大小，無法確定待檢測DNA分子的堿基序

列，因此對于PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果符合預(yù)期的質(zhì)粒，通常需進(jìn)一步通過基因測序確認(rèn)。

11.基因工程在農(nóng)業(yè)方面的應(yīng)用發(fā)展迅速，我國轉(zhuǎn)基因作物的種植面積在世界有較高排名。

請回答下列相關(guān)問題：

（1）目的基因的篩選與獲取是基因工程的第一步。為提高機會和可能，目的基因往往從相關(guān)的

_______________________的基因中進(jìn)行篩選。

⑵目的基因可以人工合成、從基因文庫中獲取，還可以利用PCR技術(shù)獲取和擴增。如圖1

展示了PCR技術(shù)獲取和擴增目的基因的原理，請分析回答下列問題：

①PCR技術(shù)利用了DNA半保留復(fù)制原理和原理。PCR的一次循環(huán)包括變性、

復(fù)性和延伸三個過程，復(fù)性的作用是o

②將一個DNA分子進(jìn)行擴增，理論上目的基因最早在第次循環(huán)后獲得；第5次循環(huán)

后，可擴增得到個目的基因。

⑶反向PCR可用于擴增未知序列，其原理如圖所示。圖中鏈狀DNA分子內(nèi)側(cè)是已知序歹U,

外側(cè)為未知序列。請回答相關(guān)問題：

①EcoRI酶切后得到的一AATT稱為黏性末端，“黏性”的含義是,EcoRI切

割得到黏性末端的原因是_________________________________________________________

②不直接在圖2中DNA分子的兩端設(shè)計引物并進(jìn)行擴增，原因是

③圖4中環(huán)狀DNA進(jìn)行PCR的過程中，沿引物A延伸子鏈的延伸方向是（填”順時

針”或“逆時針”），PCR產(chǎn)物（填“含有”或“不含"）EcoRI的酶切位點。

復(fù)習(xí)材料

答案⑴已知結(jié)構(gòu)和功能清晰⑵①堿基互補配對使引物通過堿基互補配對與兩條單鏈結(jié)合

②322(3)①兩個末端互補的堿基之間可以自發(fā)形成氫鍵切割位點在識別序列中心軸線兩側(cè)

②DNA兩端序列未知，無法設(shè)計引物③逆時針含有

12.(2024?湖北華中師大附中高三模擬)幽門螺桿菌是一種常見的人類致病菌，其骨架蛋白

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