k第十一章抗生素類藥物分析

第十一章抗生素類藥物分析(fēnxī)

Chapter11TheAnalysisof

Antibiotics

藥物分析(fēnxī)課件系列共五十四頁INDEXContentsFundamentalRequirementSection1introductionSection2β-lactamantibioticsSection3AminoglycosidesantibioticsSection4TetracyclineantibioticsSection5QualityresearchofAntibioticsSummary共五十四頁Thestructures,properties,identificationandassayofβ-lactamAntibiotics;

β-內(nèi)酰胺抗生素化學(xué)(huàxué)結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、鑒別試驗(yàn)與含量測(cè)定；ContentThestructures,chemicalproperties,andassayofaminoglycosidesandimpuritytestsofstreptomycinBandgentamycincomponentC;

氨基糖苷類抗生素結(jié)構(gòu)化學(xué)性質(zhì)、鑒別試驗(yàn)、含量測(cè)定(cèdìng)及鏈霉素B雜質(zhì)檢查慶大霉素Ｃ組分測(cè)定(cèdìng)；共五十四頁Thestructures,identification,specialimpuritytestsandassayoftetracyclines;

四環(huán)素類抗生素化學(xué)結(jié)構(gòu)性質(zhì)(xìngzhì)、鑒別試驗(yàn)、含量測(cè)定及鹽酸四環(huán)素中特殊雜質(zhì)檢查;

Thequalityresearchreviewofantibiotics抗生素類藥物質(zhì)量考察(kǎochá)研究。.共五十四頁FundamentalRequirements掌握本類藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)(tèdiǎn)理化性質(zhì)，主要鑒別試驗(yàn)及主要含量測(cè)定方法；Masteringthestructures,physicalandchemicalproperties,primaryidentificationtestsandassaymethodsofantibiotics.了解典型(diǎnxíng)抗生素有關(guān)雜質(zhì)的分離研究進(jìn)展。Understandingthedevelopmentofrelevantsubstanceresearchfortypicaldrugs.

共五十四頁

Section1Introduction

Definition

抗生素(antibiotics)是指某些微生物代謝產(chǎn)生(chǎnshēng)的，在很低的濃度即可對(duì)某些生物的生命活動(dòng)有特異抑制或殺滅作用的化學(xué)物質(zhì)。

Classification

共五十四頁抗生素β-內(nèi)酰胺類抗生素四環(huán)素類抗生素氨基(ānjī)糖苷類抗生素大環(huán)內(nèi)酯類抗生素氯霉素類抗生素青霉素及半合成(héchéng)青霉素類頭孢菌素及半合成頭孢菌素類其他抗生素青霉素、氨芐西林、阿莫西林、青霉素V頭孢噻吩鈉、頭孢氨芐、頭孢哌酮鈉金霉素、土霉素、四環(huán)素、鹽酸多西環(huán)素、鹽酸美他環(huán)素鏈霉素、卡那霉素、慶大酶素、新酶素鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、新霉素紅霉素、麥迪霉素、螺旋霉素氯霉素、甲砜霉素鹽酸林可霉素、磷霉素共五十四頁

抗生素在質(zhì)量控制上的特殊性.

生產(chǎn)的特殊性性質(zhì)的特殊性(穩(wěn)定性差)

質(zhì)量問題

化學(xué)(huàxué)純度低,三多:同系物多(G),異構(gòu)體多(P),降解物多(T)

共五十四頁

抗生素理化測(cè)定法與微生物測(cè)定法的關(guān)系.

微生物測(cè)定法:用抗生素對(duì)微生物的殺傷和抑制程度為指標(biāo)來衡量抗生素的效價(jià)(potency).

原理:對(duì)數(shù)劑量和反應(yīng)成直線,用管碟瓊脂擴(kuò)散法.

特點(diǎn)

理化測(cè)定法:根據(jù)抗生素的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),利用其特有的化學(xué)或物理化學(xué)(wùlǐhuàxué)性質(zhì)及反應(yīng)而建立的方法.

特點(diǎn)

共五十四頁

Section2β-LactamAntibiotics

StructureandCharacteristics

β-內(nèi)酰胺類抗生素是指分子中含有四個(gè)原子組成的β-內(nèi)酰胺環(huán)的抗生素。β-內(nèi)酰胺環(huán)是該類抗生素發(fā)揮生物活性的必須基團(tuán),由四個(gè)原子組成的，其分子張力比較大，化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，易發(fā)生(fāshēng)開環(huán)導(dǎo)致失活。共五十四頁共五十四頁Identificationtest

鉀鈉鹽的火焰(huǒyàn)反應(yīng)Flamereactionβ-內(nèi)酰胺類藥品中許多為鉀鹽和鈉鹽，可用此反應(yīng)進(jìn)行鑒別呈色反應(yīng)Colorreaction

羥肟酸鐵反應(yīng)堿性環(huán)境中與羥胺作用β-內(nèi)酰胺環(huán)破裂生成羥肟酸在稀酸中與高鐵離子呈色.2.硫酸硝酸呈色反應(yīng)頭孢菌素類可與之反應(yīng)呈色，機(jī)理(jīlǐ)多不明.共五十四頁茚三酮反應(yīng)α-氨基酸的反應(yīng),如氨芐西林與斐林試劑反應(yīng)分子中具有(jùyǒu)(-CONH-)結(jié)構(gòu)，可使堿性酒石酸銅還原顯紫色,如阿莫西林5.其他呈色反應(yīng):如重氮苯磺酸呈色反應(yīng)共五十四頁Orangeyellow

共五十四頁沉淀(chéndiàn)反應(yīng)Precipitationreaction

1.在稀鹽酸中生成白色沉淀：青霉素鉀(鈉)白色游離(yóulí)基沉淀2.有機(jī)胺鹽的特殊反應(yīng)：A. 重氮化偶合反應(yīng)：如普魯卡因青霉素B. 與三硝基苯酚的反應(yīng)：如芐星青霉素加水溶解加稀鹽酸

共五十四頁＋共五十四頁 光譜法Spectroscopy1. 紫外分光光度法(UV)a. 最大吸收波長(zhǎng)鑒定法b. 水解產(chǎn)物的最大吸收波長(zhǎng)鑒定法2. 紅外吸收光譜(xīshōuɡuānɡpǔ)法(IR)3. 核磁共振光譜(HMR) 色譜法Chromatography1. 薄層色譜法(TLC)2. 高效液相色譜法(HPLC)共五十四頁IRspectrumofphenoxymethylpenicillinpotassium.ObtainedasaKBrdisc.共五十四頁AssayIodometrictitrationPrinciple：青霉素或頭孢菌素分子不消耗碘，其降解產(chǎn)物消耗碘，例如青霉素族經(jīng)水解后產(chǎn)生青霉噻唑酸可與碘作用，根據(jù)消耗的碘量計(jì)算青霉素的含量。Reactionprocess:Note：

一般認(rèn)為碘與青霉素噻唑酸的作用以pH4.5溫度(wēndù)24~26℃為最好；

青霉素的降解產(chǎn)物等雜質(zhì)亦可消耗碘而影響測(cè)定結(jié)果，可以用未經(jīng)水解的樣品液作；

共五十四頁在滴定近終點(diǎn)時(shí)放慢滴定速度，并強(qiáng)力振搖；如果滴定至終點(diǎn)時(shí)又反現(xiàn)藍(lán)色，說明真正(zhēnzhèng)的終點(diǎn)尚未到達(dá)；由于每摩爾青霉素能吸收較多摩爾的碘（1摩爾青霉素能消耗8摩爾碘），故本法的靈敏度較高。需作標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照試驗(yàn)；嚴(yán)格按規(guī)定操作。共五十四頁本試驗(yàn)(shìyàn)含量計(jì)算公式：

含量(hánliàng)%=××100%VTo－VT

CS×DVSo－VS

W式中：VTo、VSo：滴定供試品空白液和對(duì)照品空白液消耗的硫代硫酸鈉液(0.02mol/L),ml;VT、VS：滴定供試品和對(duì)照品消耗的硫代硫酸鈉液(0.02mol/L),ml;CS：對(duì)照品濃度，g/ml；W：供試品取樣量，g；D：供試品稀釋倍數(shù)。共五十四頁Thefirststep:(penicillin青霉素)

青霉噻唑(sāizuò)二鈉

共五十四頁第2步反應(yīng)(fǎnyìng)thesecondstepreaction：

Thesecondstep:+4I2+5H2O+2HCl

＋NaCl＋8HI＋共五十四頁汞量法(Mercurimetry)Principle：青霉素分子不與汞鹽反應(yīng)，而其堿性水解(shuǐjiě)產(chǎn)物青霉噻唑酸及繼續(xù)水解(shuǐjiě)生成的青霉胺都能與汞鹽定量反應(yīng)，根據(jù)消耗的汞鹽量可以計(jì)算青霉素的含量。Hg2++2R-SH(RS)2Hg+2H+

2.Method(potentiometrictitration)Indicatorelectrode:Pt;referenceelectrode：Hg-mercuroussulfateelectrode；Standardsolution：mercuricnitratesolution(0.02mol/L)共五十四頁3.討論：a.本次滴定只有一次突躍。但滴定曲線上出現(xiàn)兩個(gè)指示點(diǎn)，即兩次突躍。青霉素含量的計(jì)算系以第二次滴定終點(diǎn)為依據(jù)，此時(shí)青霉素與巰基汞化物的摩爾比為1︰1。b.水解必須(bìxū)完全。溶液的pH值和反應(yīng)時(shí)間直接影響水解的完全程度，水解如不完全，將使測(cè)定結(jié)果偏低。共五十四頁

c. 本法的空白試驗(yàn)的做法與碘量法類似，空白試驗(yàn)的目的也是為了消除(xiāochú)供試品中可能存在的降解產(chǎn)物的干擾。d.本法與碘量法比較主要優(yōu)點(diǎn)是不需要青霉素標(biāo)準(zhǔn)品作對(duì)照，汞鹽滴定液用EDTA標(biāo)定即可。共五十四頁

酸堿滴定法(Acid/basetitration)

Principle：青霉素或頭孢菌素的β-內(nèi)酰胺環(huán)可被堿水解，此水解系定量完成，可用于含量測(cè)定。如苯唑西林鈉在水溶液中加過量的氫氧化鈉滴滴定液水解后，產(chǎn)生(chǎnshēng)的青霉噻唑酸被中和，再以鹽酸滴定液滴定剩余的氫氧化鈉液，以氫氧化鈉滴定液的消耗量求得苯唑西林鈉的含量。共五十四頁UV

銅鹽法:青霉素族抗生素在弱酸性下的降解產(chǎn)物青霉烯酸具有紫外吸收特征。青霉烯酸在320~360nm處有最大吸收,但此水解產(chǎn)物不穩(wěn)定(wěndìng)，可加Cu2+，與青霉烯酸形成較穩(wěn)定的螯合物，在320nm處有最大吸收。2. 汞鹽法:青霉素族抗生素在咪唑的催化下與氯化高汞能定量的反應(yīng)轉(zhuǎn)化呈相應(yīng)的青霉烯酸硫醇汞鹽，在324~325nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)有最大吸收。共五十四頁羥肟酸比色法青霉素族和頭孢菌素族抗生素能與羥胺作用生成羥肟酸衍生物，在烯酸中與高鐵離子生成紅色絡(luò)合物，在一定波長(zhǎng)下測(cè)定吸收(xīshōu)度而進(jìn)行定量。高效(ɡāoxiào)液相色譜法HPLC

填充劑：十八烷基硅烷鍵合硅膠流動(dòng)相：磷酸氫二鈉、枸櫞酸溶液檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm保留時(shí)間：7.5min分離度：>4內(nèi)標(biāo)溶液：乙酰苯胺測(cè)定法：內(nèi)標(biāo)法計(jì)算：按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算中國(guó)藥典測(cè)定頭孢唑林鈉共五十四頁

第三節(jié)氨基糖甙類抗生素

Section3Aminoglycosidesantibiotics

本類抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)都是以堿性環(huán)己多元醇為甙元，與氨基縮合(suōh(huán)é)而成的甙，故稱為氨基糖甙類抗生素(aminoglycosidesantibiotics)。

鏈霉素(Streptomycin)Structureandproperties共五十四頁

streptidinestreptoseN-methyl-L-glucosamine

streptobiosamine共五十四頁Characteristics鏈霉素的構(gòu)成為一分子鏈霉胍和一分子鏈霉雙糖(shuānɡtánɡ)胺結(jié)合而成的堿性甙。鏈霉素分子中有三個(gè)堿性中心，可與無機(jī)酸或有機(jī)酸形成可溶于水的鹽，臨床上多用其硫酸鹽。Properties酸性條件下，鏈霉素水解為鏈霉胍與鏈霉雙糖胺，進(jìn)一步水解則得到N-甲基-L-葡萄糖胺。弱堿性條件下能使之水解為鏈霉胍及鏈霉雙糖胺，但繼之即將鏈霉糖部分分子重排為麥芽酚(maltol),這一性質(zhì)為鏈霉素所特有，可用于鑒別。共五十四頁IdentificationTests

NinhydrinreactionElson-Morganreaction

鏈霉素經(jīng)水解，產(chǎn)生N-甲基葡萄糖胺，在堿性溶液中與乙酰丙酮縮和成吡咯衍生物，與對(duì)二甲氨基苯甲醛的酸性溶液反應(yīng)即生成紅色縮合物。

Maltolreaction鏈霉素在堿性溶液中，鏈霉糖經(jīng)分子重排使環(huán)擴(kuò)大形成六元環(huán)，然后(ránhòu)消除N-甲基葡萄糖胺，再消除鏈霉胍生成麥芽酚(α-甲基-β-羥基-γ-吡喃酮)。麥芽酚可與鐵離子在微酸性環(huán)境中形成紫紅色配位化合物。Sakaguchireactoin本品水溶液加氫氧化鈉試液，水解生成鏈霉胍。共五十四頁鏈霉素B雜質(zhì)(zázhì)檢查

BP（1993）規(guī)定了鏈霉素B的檢查項(xiàng)目。甘露糖鏈霉素稱作鏈霉素B，它是鏈霉素分子中N-甲基葡萄糖胺的C4〞位上的羥基連接一個(gè)(yīɡè)D-甘露糖組成的。含量測(cè)定Assay

目前各國(guó)藥典仍采用微生物檢測(cè)法。共五十四頁茚三酮反應(yīng)(fǎnyìng)Ninhydrinreaction

＋2＋＋3H2O共五十四頁H+

Fe3+

H2ONaOHMaltolreactionMaltol共五十四頁慶大霉素(Gentamycin)

StructureandCharacteristicsStructureCharacteristics慶大霉素是由絳紅糖胺、脫氧鏈霉胺和加洛糖胺縮和而成的甙。慶大霉素有五個(gè)堿性中心，其堿性相似。能與無機(jī)酸或有機(jī)酸形成可溶于水的鹽，多用硫酸鹽。Property硫酸慶大霉素水中易溶，在乙醇、丙酮、氯仿或乙醚中不溶。對(duì)光、熱、空氣(kōngqì)均較穩(wěn)定，水溶液穩(wěn)定，pH2~12時(shí)，100℃加熱30min活性無明顯變化。慶大霉素在紫外無吸收。共五十四頁purpurosaminedeoxystreptosaminegarosamineStructure共五十四頁鑒別(jiànbié)反應(yīng)Identification

茚三酮反應(yīng)Ninhydrinreaction本品與鏈霉素一樣具有氨基糖甙類結(jié)構(gòu)，羥基胺類和α-氨基酸的性質(zhì)，可與茚三酮生成藍(lán)紫色縮和物。Elson-Morganreaction與鏈霉素一樣，經(jīng)水解后也產(chǎn)生N-甲基葡萄糖胺(加洛糖胺)在堿性(jiǎnxìnɡ)溶液中與乙酰丙酮縮和成吡咯衍生物，與對(duì)二甲基苯甲醛的酸性醇溶液反應(yīng)，生成紅色縮和物。共五十四頁紫外分光光度法Ultravioletspectroscopy慶大霉素分子中無共軛雙鍵系統(tǒng)，故在紫外區(qū)無吸收。薄層色譜法TLC高效(ɡāoxiào)液相色譜法HPLC紅外光譜法IR硫酸鹽反應(yīng)Sulfatereaction共五十四頁檢查(jiǎnchá)－慶大霉素C組分測(cè)定

慶大霉素C1、C2、C1a對(duì)微生物的活性無明顯差異，但其毒副作用和耐藥性有差異，導(dǎo)致各組分的多少影響產(chǎn)品的效價(jià)和臨床研究。中國(guó)藥典(2000)、USP(24)和BP(1993)均采用高效液相色譜法，JP(13)采用薄層(báocénɡ)色譜法和薄層(báocénɡ)微生物顯像法測(cè)定各組分的含量。含量測(cè)定Assay

目前各國(guó)藥典仍用微生物檢定法。共五十四頁

第四節(jié)四環(huán)素類抗生素

Section4Tetracyclines

本類抗生素在化學(xué)結(jié)構(gòu)(jiégòu)上，都具有氫化四駢苯環(huán)，故統(tǒng)稱為四環(huán)素族或四環(huán)素類(tetrac-yclines)抗生素?；瘜W(xué)(huàxué)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

結(jié)構(gòu)Structure性質(zhì)Character

共五十四頁NameRR′R〞R’’’

tetracyclineHOHCH3

HchlortetracycineClOHCH3

HoxytetracyclineHOHCH3

OHdoxycyclineHHCH3

OHmetacyclineH=CH2

OHStructure共五十四頁兩性化合物Amphotericcompound；其鹽酸鹽易溶于水，并溶于堿或酸性溶液(róngyè)中；結(jié)晶性物質(zhì)，在水中結(jié)晶者，均含有結(jié)晶水；旋光性O(shè)pticalrotation；差向異構(gòu)化性質(zhì)Epimerization——差向四環(huán)素；酸性降解Aciddegradation——脫水四環(huán)素；堿性降解Basedegradation——異四環(huán)素；中性降解Neutraldegradation——紫紅色縮和物；與金屬離子形成配位化合物。

共五十四頁鑒別(jiànbié)試驗(yàn)Identification

i. 濃硫酸反應(yīng)(fǎnyìng)Con.Sulfuricacidii. 三氯化鐵反應(yīng)Ferricchloridereaction名稱鹽酸四環(huán)素鹽酸金霉素鹽酸土霉素鹽酸多西環(huán)素鹽酸美他環(huán)素濃硫酸反應(yīng)深紫色藍(lán)色變?yōu)殚蠙炀G色朱紅色黃色橙紅色三綠化鐵反應(yīng)紅棕色深褐色橙褐色褐色-共五十四頁氯化物反應(yīng)Chloridereaction本類抗生素多用鹽酸鹽，可與硝酸銀在酸性條件下生成氯化銀白色沉淀。iv. 紫外分光光度法UV本類抗生素分子內(nèi)含有共軛雙鍵系統(tǒng)，在紫外光區(qū)有吸收。熒光法Fluorescence本類抗生素分子內(nèi)含有共軛雙鍵系統(tǒng)，在紫外光照射下能產(chǎn)生熒光，它們的降解產(chǎn)物也具有熒光。vi. 薄層色譜法TLC四環(huán)素類抗生素的薄層色譜多采用硅藻土作載體，為獲得較好得分離(fēnlí)，在粘合劑中加有聚二乙醇400、共五十四頁甘油以及中性的EDTA緩沖液。EDTA可以克服因痕量的金屬離子存在而引起的脫尾現(xiàn)象。本類抗生素及其降解(jiànɡjiě)產(chǎn)物在紫外光(365nm)下產(chǎn)生熒光的性質(zhì)，可用與檢出斑點(diǎn)并以標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照進(jìn)行鑒別。其他方法Othermethod紅外光譜法及高效液相色譜法

鹽酸(yánsuān)四環(huán)素中特殊雜質(zhì)檢查(Impuritytestintetracycline)含量測(cè)定Assay

比色法Colorimetricmethod

高效液相色譜法HPLC

共五十四頁第五節(jié)

抗生素類藥物的質(zhì)量考察(kǎochá)研究

Section5QualityResearchReviewofAntibiotics青霉素中致敏雜質(zhì)的分離制備凝膠過濾法GelfiltrationmethodGDX104柱色譜GDX104columnchromatography雜質(zhì)的研究Researchofimpurity

光譜法SpectroscopyPenamaldate法測(cè)定青霉噻唑(sāizuò)基團(tuán)――青霉素過敏反應(yīng)主要抗原決定簇紫外光譜分析UV紅外光譜分析IR共五十四頁

色譜法Chromatography薄層色譜法TLC高效液相色譜法HPLC氣相色譜法GC凝膠過濾色譜法Gelfiltrationmethodchromatography生物(shēngwù)法Biologicalmethod電泳法Electrophoreticmethod－圓盤電泳分析免疫法Immunizingmethod－豚鼠被動(dòng)皮膚過敏試驗(yàn)(PCA試驗(yàn))共五十四頁TypeTypicaldrugsPropertyIdentification

AssayPenicillinAnoxicillinAmpicillinPiperaxillindissolvedinwater;opticalactivity;UVabsorption;unstabil