熒光光度分析法測(cè)定維生素B2

熒光分析法簡(jiǎn)述指導(dǎo)教師：趙成國(guó)、概述#2022直到1852年在考察奎寧和葉綠素的熒光時(shí)，用分光計(jì)觀察到其熒光的波長(zhǎng)比入射光的波長(zhǎng)稍長(zhǎng)些，才判明這種現(xiàn)象是這些物質(zhì)在吸收光能后重新發(fā)射不同波長(zhǎng)的光，而不是由光的漫射作用所引起的，才確立了熒光是光發(fā)射的概念。到19世紀(jì)末人們已經(jīng)知道了包括熒光素、曙紅、多環(huán)芳烴等600種以上的熒光物質(zhì)。20世紀(jì)以來(lái)，熒光現(xiàn)象被研究得更多了，發(fā)現(xiàn)了共振熒光、增感熒光，能夠進(jìn)行熒光產(chǎn)率得絕對(duì)測(cè)定，還進(jìn)行了熒光壽命的直接測(cè)定等等。PARTONE二、熒光發(fā)生機(jī)理當(dāng)一些物質(zhì)被光照射后，物質(zhì)的分子吸收光以后，便以基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，成為激發(fā)分子，然后通過(guò)相互碰撞或和其它溶劑分子碰撞等去活化的過(guò)程而消耗了能量，回到第一激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，這種躍遷稱為無(wú)輻射躍遷，它不會(huì)發(fā)光。當(dāng)電子由激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)躍遷回基態(tài)的不同振動(dòng)能級(jí)時(shí)，則以熒光的形態(tài)發(fā)出能量。激發(fā)通常在室溫下物質(zhì)分子大部分處于基態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)（=0）。當(dāng)電子吸收一定頻率的電磁輻射發(fā)生能級(jí)躍遷時(shí)，可上升至不同激發(fā)態(tài)的各振動(dòng)能級(jí)，其中大部分分子上升至第一激發(fā)單重態(tài)（S1），這一過(guò)程稱為激發(fā)。去活化過(guò)程處于激發(fā)態(tài)的分子是不穩(wěn)定，它可以通過(guò)01不同的途徑回到基態(tài)，這一過(guò)程稱為去活化。02去活化過(guò)程有以下幾種：03振動(dòng)馳豫溶液中分子間碰撞機(jī)會(huì)很04多，通過(guò)碰撞溶質(zhì)分子將過(guò)剩的能量轉(zhuǎn)移給溶05劑分子，通過(guò)非輻射躍遷而降至同一能態(tài)的最06低振動(dòng)能級(jí)，這一過(guò)程稱為振動(dòng)馳豫。07內(nèi)部轉(zhuǎn)換同一多重態(tài)的不同電子能級(jí)間可能發(fā)生內(nèi)部轉(zhuǎn)換。S2S1或T2T1條件：當(dāng)S2較低振動(dòng)能級(jí)與S1較高振動(dòng)能級(jí)的能量相當(dāng)，且發(fā)生重疊時(shí)分子才有可能S2S1或T2T1熒光發(fā)射處于第一激發(fā)的最低振動(dòng)能級(jí)的分子，躍遷回基態(tài)的各振動(dòng)能級(jí)，這一過(guò)程稱為熒光發(fā)射。體系間跨越躍遷分子從激發(fā)單重態(tài)轉(zhuǎn)至能量較低的激發(fā)三重態(tài)的過(guò)程，稱體系間跨越躍遷。三重態(tài)：電子自旋方向相同單重態(tài):電子自旋方向相反這些分子從第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)下降至第一基態(tài)的各振動(dòng)能級(jí)，所發(fā)出的輻射即為磷光。單擊此處添加副標(biāo)題，文字是您思想的提煉，為了演示發(fā)布的良好效果，請(qǐng)言簡(jiǎn)意賅地闡述您的觀點(diǎn)。您的內(nèi)容已經(jīng)簡(jiǎn)明扼要，字字珠璣，但信息卻千絲萬(wàn)縷、錯(cuò)綜復(fù)雜，需要用更多的文字來(lái)表述；但請(qǐng)您盡可能提煉思想的精髓，否則容易造成觀者的閱讀壓力，適得其反。正如我們都希望改變世界，希望給別人帶去光明，但更多時(shí)候我們只需要播下一顆種子，自然有微風(fēng)吹拂，雨露滋養(yǎng)。恰如其分地表達(dá)觀點(diǎn)，往往事半功倍。當(dāng)您的內(nèi)容到達(dá)這個(gè)限度時(shí)，或許已經(jīng)不純粹作用于演示，極大可能運(yùn)用于閱讀領(lǐng)域；無(wú)論是傳播觀點(diǎn)、知識(shí)分享還是匯報(bào)工作，內(nèi)容的詳盡固然重要，但請(qǐng)一定注意信息框架的清晰，這樣才能使內(nèi)容層次分明，頁(yè)面簡(jiǎn)潔易讀。如果您的內(nèi)容確實(shí)非常重要又難以精簡(jiǎn)，也請(qǐng)使用分段處理，對(duì)內(nèi)容進(jìn)行簡(jiǎn)單的梳理和提煉，這樣會(huì)使邏輯框架相對(duì)清晰。單擊添加大標(biāo)題三、熒光的特性激發(fā)光譜和發(fā)射光譜任何熒光化合物都有兩個(gè)特征性光譜：激發(fā)光譜和發(fā)射光譜激發(fā)光譜繪制激發(fā)光譜時(shí)，固定熒光的最大發(fā)射波長(zhǎng)，然后改變激發(fā)光的波長(zhǎng)，所測(cè)得的熒光強(qiáng)度與激發(fā)波長(zhǎng)的譜線關(guān)系即為激發(fā)光譜。發(fā)射光譜簡(jiǎn)稱熒光光譜。繪制發(fā)射光譜時(shí)，固定熒光的最大激發(fā)波長(zhǎng)，然后改變發(fā)射光的波長(zhǎng)，所測(cè)得的熒光強(qiáng)度與發(fā)射波長(zhǎng)的譜線關(guān)系即為發(fā)射光譜。發(fā)射光譜熒光光譜形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)由于分子無(wú)論被激發(fā)到高于S1哪一個(gè)激發(fā)態(tài)，都經(jīng)過(guò)無(wú)輻射的振動(dòng)馳豫或內(nèi)部轉(zhuǎn)換等過(guò)程，最終回到S1態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，然后躍遷回基態(tài)產(chǎn)生熒光。蒽的吸收光譜和發(fā)射光譜—吸收光譜—發(fā)射光譜由于分子的S0態(tài)和S1態(tài)中各振動(dòng)能級(jí)的能量分吸收光譜和熒光光譜有很好的鏡像關(guān)系01單擊此處添加正文，文字是您思想的提煉，請(qǐng)盡量言簡(jiǎn)意賅地闡述觀點(diǎn)。布情況相似決定的。因此吸收光譜和發(fā)射光譜的形02單擊此處添加正文，文字是您思想的提煉，請(qǐng)盡量言簡(jiǎn)意賅地闡述觀點(diǎn)。狀相似。03四、熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系（１）發(fā)光分子中要具有共軛π鍵體系共軛的程度越大，π電子越容易激發(fā)，分子放光越容易產(chǎn)生。（2）具有剛性平面結(jié)構(gòu)分子有利于熒光發(fā)射分子的共平面越大，其π電子的共軛程度越大。如熒光素和酚酞結(jié)構(gòu)十分相似，熒光素有很強(qiáng)的熒光，而酚酞沒有，這是由于熒光素有剛性平面結(jié)構(gòu)，減少了分子振動(dòng)，減少了去活化的概率。取代基的作用給電子基增強(qiáng)熒光:－OH,－NH2,－NHR,NR2,－C≡N吸電子基減弱熒光：－Br,－Cl,－NO2,N＝N,－COOH五、影響熒光強(qiáng)度的因素0102熒光物質(zhì)經(jīng)紫外線長(zhǎng)時(shí)間照射及空氣的氧化作用，會(huì)使熒光逐漸減退。熒光的減退在稀溶液中：F＝KcF為熒光強(qiáng)度K—檢測(cè)效率（由儀器決定）c為液體的濃度2.熒光強(qiáng)度與溶液濃度的關(guān)系F高濃度時(shí)，熒光物質(zhì)發(fā)生熄滅和自吸收現(xiàn)象，使F與c不呈線性關(guān)系c溫度的影響溫度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響較敏感。溶液溫度下降時(shí)，介質(zhì)的粘度增大，熒光物質(zhì)與分子的碰撞也隨之減少，去活化過(guò)程也減少，則熒光強(qiáng)度增加。相反，隨著溫度上升，熒光物質(zhì)與分子的碰撞頻率增加，使去活化幾率增加，則熒光強(qiáng)度下降。4.pH的影響帶有酸性或堿性官能團(tuán)的大多數(shù)芳香族化合物的熒光一般都與溶液PH值有關(guān)，例如：在pH=7~12的溶液中苯胺以分子形式存在，會(huì)發(fā)出藍(lán)色熒光；而在pH<2或pH>13的溶液中苯胺以離子形式存在，都不會(huì)發(fā)出熒光。同時(shí)所用酸的種類也影響熒光的強(qiáng)度，例如：奎寧在硫酸溶液中的熒光比在鹽酸中的要強(qiáng)。5.溶劑許多有機(jī)物及金屬的有機(jī)絡(luò)合物，在乙醇01添加標(biāo)題溶液中的熒光比在水溶液中強(qiáng)。乙醇、甘油、02添加標(biāo)題丙酮、氯仿及苯都是常用的有機(jī)溶劑，其中大03添加標(biāo)題多有熒光，應(yīng)設(shè)法避免；一般避免的辦法是稀04添加標(biāo)題釋，或加入一部分水。05添加標(biāo)題有機(jī)溶劑中常有產(chǎn)生熒光的雜質(zhì)，可用蒸餾法提純。橡皮塞、軟木塞及濾紙中也常有能溶于溶劑的一些帶熒光的物質(zhì)。6.熒光強(qiáng)度達(dá)到最高點(diǎn)所需要的時(shí)間不同，有的反應(yīng)加入試劑后熒光強(qiáng)度立即達(dá)到最高峰。有的反應(yīng)需要經(jīng)過(guò)15~30分鐘才能達(dá)到最高峰。包括有光源、單色器、樣品池、檢測(cè)器和記錄顯示裝置五個(gè)部分。熒光分析儀器的基本組成部件章節(jié)一1.激發(fā)光源光源應(yīng)具有足夠的強(qiáng)度、適用波長(zhǎng)范圍寬、穩(wěn)定等特點(diǎn)。常用的光源有高壓汞燈和氙弧燈。

氙弧燈又稱氙燈，是目前熒光分光分度計(jì)中應(yīng)用最廣泛的一種光源。它是一種短弧氣體放電燈，外套為石英，內(nèi)充氙氣，光強(qiáng)度大氙燈的燈內(nèi)氣壓高，啟動(dòng)時(shí)的電壓高（2040KV）,因此使用時(shí)一定要注意安全。2.單色器熒光分析儀中應(yīng)用最多的單色器為光柵單色器單色器有兩塊：第一塊為激發(fā)單色器，用于選擇激發(fā)光的波長(zhǎng)；第二塊為發(fā)射單色器，用于選擇熒光發(fā)射波長(zhǎng)。一般后者的光柵閃耀波長(zhǎng)比前者來(lái)得長(zhǎng)一些。第一濾光片用以分離出所需用的激發(fā)光，第二濾光片用以濾去雜散光、拉曼光和雜質(zhì)所發(fā)射的熒光。3.樣品池?zé)晒夥治龅谋壬笸ǔＳ檬⒉牧献龀桑瑹晒獗壬笏拿婢鶠槟ス馔该髅?，同時(shí)一般僅有一種厚度為1cm的液池。PART14.檢測(cè)器多采用光電倍增管進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)器的方向應(yīng)與激發(fā)光的方向成直角，以消除樣品池中透射光和雜散光的干擾。5.記錄、顯示裝置的讀出裝置有數(shù)字電壓表或記錄儀?，F(xiàn)代儀器都配上計(jì)算機(jī)，進(jìn)行自動(dòng)控制和顯示熒光光譜及各種參數(shù)。熒光分析儀光源樣本池第一（激發(fā)）單色器第二（發(fā)射）單色器檢驗(yàn)器顯示、記錄裝置七、熒光測(cè)定方法后，配成一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并測(cè)定他們的貳將已知量的標(biāo)準(zhǔn)物經(jīng)過(guò)與試樣相同的處理壹度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后測(cè)定未知樣的濃度。肆熒光強(qiáng)度，繪制一條以熒光強(qiáng)度和標(biāo)準(zhǔn)溶液濃叁標(biāo)準(zhǔn)曲線法熒光猝滅法在一般熒光分析中，熒光的猝滅現(xiàn)象是不可避免的，但是我們可以利用猝滅現(xiàn)象，進(jìn)行熒光分析。例如一物質(zhì)本身不會(huì)發(fā)光，也不會(huì)與其它物質(zhì)形成熒光物質(zhì)，但它會(huì)使另外一種會(huì)發(fā)射熒光的物質(zhì)熒光強(qiáng)度降低，熒光強(qiáng)度的下降程度與該物質(zhì)的濃度成比例，此法成為熒光猝滅法。熒光分析法的特點(diǎn)及應(yīng)用1.特點(diǎn)靈敏度高：測(cè)定下限0.1～0.001μg·mL-1,比分光光度法高2～4個(gè)數(shù)量級(jí).儀器設(shè)備相對(duì)簡(jiǎn)單、體積小操作較簡(jiǎn)便反應(yīng)時(shí)間也較快2.熒光光度法的應(yīng)用生物化學(xué)分析、生理醫(yī)學(xué)研究、臨床檢測(cè)直接測(cè)定能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)帶苯環(huán)的氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯基丙氨酸測(cè)定能與熒光試劑反應(yīng)生成熒光化合物的物質(zhì)熒光生色團(tuán)標(biāo)記蛋白質(zhì)，研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)；致癌物同核酸結(jié)合常引起顯著的熒光熒光熄滅法測(cè)定猝滅劑實(shí)驗(yàn)一熒光法測(cè)定醫(yī)用維生素B2中核黃素的含量一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?2學(xué)會(huì)使用熒光分光度計(jì)學(xué)習(xí)和掌握熒光光度分析法的基本原理和方法01二、實(shí)驗(yàn)原理核黃素易溶于水而不溶于乙醚等有機(jī)溶劑，在中性或酸性溶液中穩(wěn)定，光照易分解，對(duì)熱穩(wěn)定。核黃素在堿性溶液中經(jīng)光線照射會(huì)發(fā)生分解而轉(zhuǎn)化為光黃素，光黃素的熒光比核黃素的熒光強(qiáng)的多，故測(cè)核黃素時(shí)溶液要控制在酸性范圍內(nèi)，且在避光條件下進(jìn)行?；瘜W(xué)名：7,8-二甲基－10［(2S,3S,4R)-2,3,4,5-四羥基戊基］苯并蝶啶-2,4（3H，10H）-二酮

分子式：C17H20N4O6

分子量：376.36實(shí)驗(yàn)儀器RF-5301PC熒光光度計(jì)日本島津公司1.儀器介紹#20222.操作規(guī)程從“AcquireMode”菜單中選[Spectrum光譜]，進(jìn)入光譜模式。打開電腦和RF-5301系統(tǒng)的開關(guān)，點(diǎn)擊桌面的RF-5301的快捷圖標(biāo)，啟動(dòng)儀器的控制程序從“Configure設(shè)置”菜單中選擇[Parameters參數(shù)]若樣品激發(fā)光譜的發(fā)射波長(zhǎng)或發(fā)射光譜的激發(fā)波長(zhǎng)未知，則在上述對(duì)話框中設(shè)置合適的激發(fā)發(fā)射狹縫寬度，靈敏度，放置標(biāo)樣，在光度計(jì)按鍵中點(diǎn)擊，在彈出的對(duì)話框中選擇激發(fā)光和發(fā)射光的范圍以及激發(fā)光的波長(zhǎng)的間隔，點(diǎn)“Search”鍵，等待一段時(shí)間，由儀器給出最優(yōu)波長(zhǎng)。④掃描完成后出現(xiàn)的譜圖⑤定量分析的參數(shù)設(shè)置設(shè)置激發(fā)發(fā)射光波長(zhǎng)，激發(fā)發(fā)射狹縫寬度，靈敏度，反應(yīng)時(shí)間，單位，濃度以及強(qiáng)度范圍。將裝有蒸餾水的樣品池放入池槽中，點(diǎn)擊“”自動(dòng)回零。將第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品裝入池槽中，點(diǎn)擊彈出如下對(duì)話框，輸入標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度出現(xiàn)工作曲線，也會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。以此測(cè)完5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品后，屏幕上會(huì)在工作曲線繪制完成后，可以定量測(cè)定未知樣的濃度，點(diǎn)擊。然后將未知樣品放入池槽中，點(diǎn)擊開始濃度的測(cè)定。最后，在File菜單中選擇Save，儲(chǔ)存獲得的數(shù)據(jù)四、實(shí)驗(yàn)試劑10.0μg·mL-1核黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：稱取0.01g核黃素置于50mL燒杯中，以蒸餾水溶解后，定溶于1000mL容量瓶中，搖勻，備用。配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液

50ml容量瓶，分別加入1.00，2.00，00，4.00ml核黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液，用水稀釋至刻度，搖勻。掃描核黃素的最大激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)對(duì)核黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行熒光掃描，根據(jù)激發(fā)光譜曲線和發(fā)射光譜曲線，確定最大激發(fā)波長(zhǎng)和最大發(fā)射波長(zhǎng)。五、實(shí)驗(yàn)步驟繪制根未知試樣的測(cè)定取醫(yī)用維生素B2片劑1片，置于50mL燒杯中，加少量蒸餾水溶解，定溶于1000ml容量瓶中，搖勻、備用。六、數(shù)據(jù)處理1234未知樣品cF2）核黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度及其熒光強(qiáng)度4）計(jì)算藥片中核黃素的含量，用mg/片表示3)繪制核黃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線1）記錄核黃素的最大激發(fā)波長(zhǎng)和最大發(fā)射波長(zhǎng)EX