第二十一章 免疫學(xué)所有實驗課件

第二十一章免疫學(xué)所有實驗第二十一章免疫學(xué)檢測原理免疫學(xué)檢測乃借助免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)理論或技術(shù)，對抗原、抗體、免疫細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子等進行定性或定量檢測。免疫學(xué)檢測技術(shù)在醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，并在臨床實踐中用于探討免疫相關(guān)疾病的發(fā)病機制及其診斷、病情監(jiān)測與療效評價等。隨著現(xiàn)代免疫學(xué)以及細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等相關(guān)學(xué)科的進展，免疫學(xué)檢測技術(shù)不斷發(fā)展和更新。第一節(jié)基于抗原-抗體反應(yīng)的檢測方法第二節(jié)免疫細(xì)胞的檢測第三節(jié)免疫分子的檢測第二十一章免疫學(xué)所有實驗學(xué)習(xí)指導(dǎo)1、掌握凝集反應(yīng)和沉淀反應(yīng)的概念2、掌握免疫細(xì)胞和免疫分子常用檢測方法的名稱3、熟悉三大標(biāo)記技術(shù)的原理和方法及其應(yīng)用4、了解免疫學(xué)方法的研究概況、進展及在臨床中的應(yīng)用第二十一章免疫學(xué)所有實驗第一節(jié)基于抗原-抗體反應(yīng)的檢測方法一、抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的特點（熟悉）（一）特異性和交叉反應(yīng)（二）抗原-抗體結(jié)合的帶現(xiàn)象與可見性抗體反應(yīng)中，可能出現(xiàn)抗原或抗體過剩的情況，由于過剩一方的結(jié)合價不能被完全占據(jù)，多呈游離的小分子復(fù)合物形式，或所形成的復(fù)合物易解離，不能被肉眼察見，此為前帶現(xiàn)象（prozone）即抗體過剩，或后帶現(xiàn)象(postzone)即抗原過剩。（三）可逆性抗原-抗體反應(yīng)為分子表面的非共價結(jié)合，結(jié)合雖穩(wěn)定但可逆。第二十一章免疫學(xué)所有實驗第一節(jié)二、抗原-抗體反應(yīng)的影響因素（熟悉）（一）電解質(zhì)（二）酸堿度抗原抗體反應(yīng)的最適pH是6~8。（三）溫度抗體-抗原反應(yīng)的最適溫度為37℃。（四）抗原和抗體的性質(zhì)抗體的特異性和親和力是決定抗原-抗體反應(yīng)的關(guān)鍵因素?？乖涂贵w的濃度、比例對抗原-抗體反應(yīng)的影響最大，是決定性因素第二十一章免疫學(xué)所有實驗第一節(jié)三、抗原抗體反應(yīng)的基本檢測方法（一）凝集反應(yīng)（圖21-1）（掌握）細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆粒性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后，在一定條件下出現(xiàn)肉眼可見的凝集物，此為凝集反應(yīng)(agglutination)。

1．直接凝集2．間接凝集3．間接凝集抑制試驗第二十一章免疫學(xué)所有實驗各種凝集反應(yīng)示意圖第二十一章免疫學(xué)所有實驗第一節(jié)三、抗原抗體反應(yīng)的基本檢測方法（二）沉淀反應(yīng)（掌握）可溶性抗原（血清蛋白質(zhì)、細(xì)胞裂解液或組織浸液、各種微生物蛋白分子等）與相應(yīng)抗體結(jié)合后，在一定條件下出現(xiàn)肉眼可見的沉淀，此為沉淀反應(yīng)(precipitation)。1．單向免疫擴散(singleimmunodiffusion)2．雙向免疫擴散(doubleimmunodiffusion)3．免疫電泳(immunoelectrophoresis)

4．免疫比濁(immunonephelometry)第二十一章免疫學(xué)所有實驗單向免疫擴散(singleimmunodiffusion)第二十一章免疫學(xué)所有實驗雙向免疫擴散(doubleimmunodiffusion)第二十一章免疫學(xué)所有實驗免疫電泳(immunoelectrophoresis)第二十一章免疫學(xué)所有實驗對流免疫電泳第二十一章免疫學(xué)所有實驗火箭免疫電泳第二十一章免疫學(xué)所有實驗第一節(jié)三、抗原抗體反應(yīng)的基本檢測方法（三）補體參與的反應(yīng)（了解）應(yīng)用抗體與紅細(xì)胞表面抗原結(jié)合，激活反應(yīng)體系中的補體成分，根據(jù)溶血現(xiàn)象判定試驗結(jié)果。補體結(jié)合試驗和溶血空斑試驗（后敘）均屬此類反應(yīng)。補體結(jié)合試驗曾用于檢測多種細(xì)菌、病毒的抗原或抗體，因易受多種試驗條件影響，已漸被其他方法取代。此外，補體依賴的微量細(xì)胞毒實驗曾用于HLA的血清學(xué)分型，方法是：將標(biāo)準(zhǔn)分型血清與待檢淋巴細(xì)胞反應(yīng)，再加入兔補體，若細(xì)胞表面表達相應(yīng)HLA抗原，則被溶解。溶解細(xì)胞可被臺盼藍或伊紅染料著色，而活細(xì)胞不著色，藉此判定結(jié)果。第二十一章免疫學(xué)所有實驗第一節(jié)三、抗原抗體反應(yīng)的基本檢測方法（四）免疫標(biāo)記技術(shù)（熟悉）免疫標(biāo)記技術(shù)（immunolabellingtechnique）乃用熒光素、酶、放射性核素或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等標(biāo)記抗體或抗原，進行抗原-抗體反應(yīng)的檢測，是目前應(yīng)用最為廣泛的免疫學(xué)檢測技術(shù)。標(biāo)記物與抗體或抗原連接后并不改變抗原抗體的免疫特性，具有靈敏度高、快速、可定性、定量、定位等優(yōu)點。。第二十一章免疫學(xué)所有實驗第一節(jié)三、抗原抗體反應(yīng)的基本檢測方法（四）免疫標(biāo)記技術(shù)1．免疫熒光法(immunofluorescence，IF)

此法乃用熒光素與抗體連接成熒光抗體，再與待檢標(biāo)本中抗原反應(yīng)，置熒光顯微鏡下觀察，抗原-抗體復(fù)合物散發(fā)熒光，借此對抗原進行定性或定位。

（1）直接熒光法：

（2）間接熒光法：第二十一章免疫學(xué)所有實驗免疫熒光法(immunofluorescence，IF)第二十一章免疫學(xué)所有實驗第一節(jié)三、抗原抗體反應(yīng)的基本檢測方法（四）免疫標(biāo)記技術(shù)2．酶免疫測定(enzymeimmunoassay，EIA)（1）酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)：是酶免疫測定中應(yīng)用最廣的技術(shù)，用于測定可溶性抗原或抗體。其基本方法是：將已知抗原或抗體吸附在固相載體（聚苯乙烯微量反應(yīng)板）表面，使抗原-抗體反應(yīng)在固相表面進行，借助洗滌將固相上的抗原-抗體復(fù)合物與液相中游離成分分離（圖21-6）。ELISA的操作方法很多，以下簡介幾種基本方法。第二十一章免疫學(xué)所有實驗第一節(jié)基本檢測方法---（四）免疫標(biāo)記技術(shù)1）雙抗體夾心法：2）間接法：

3)酶聯(lián)免疫斑點試驗(ELISPOT):其原理是：4）BAS-ELISA：ELISA技術(shù)的優(yōu)點是靈敏度高、操作簡便、穩(wěn)定性強，可自動化檢測，從而被廣泛用于檢測多種病原體抗原或抗體、血液及其他體液中微量蛋白成分、細(xì)胞因子等第二十一章免疫學(xué)所有實驗間接法第二十一章免疫學(xué)所有實驗第一節(jié)三、抗原抗體反應(yīng)的基本檢測方法（四）免疫標(biāo)記技術(shù)（2）免疫組化技術(shù)(immunohitochemistrytechenique)：應(yīng)用標(biāo)記的抗體與組織或細(xì)胞抗原發(fā)生反應(yīng)，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，對組織或細(xì)胞表面抗原進行定性、定量、定位。常用技術(shù)包括酶免疫組化（辣根過氧化物酶標(biāo)記）、免疫金組化（膠體金顆粒標(biāo)記）、免疫電鏡技術(shù)（鐵蛋白、膠體金、過氧化物酶標(biāo)記）等第二十一章免疫學(xué)所有實驗第一節(jié)三、抗原抗體反應(yīng)的基本檢測方法（四）免疫標(biāo)記技術(shù)3．放射免疫測定法(radioimmunoassay，RIA)

乃用放射性核素標(biāo)記抗原或抗體進行免疫學(xué)檢測。該法兼有放射性核素的高靈敏度和抗原-抗體反應(yīng)的特異性，檢測靈敏度達pg水平。常用于標(biāo)記的放射性核素為125I和131I，分為液相和固相兩種方法。該法常用于測定微量物質(zhì)，如胰島素、生長激素、甲狀腺素、孕酮等激素，嗎啡、地高辛、IgE等。第二十一章免疫學(xué)所有實驗第一節(jié)三、抗原抗體反應(yīng)的基本檢測方法（四）免疫標(biāo)記技術(shù)4．化學(xué)發(fā)光免疫分析

將發(fā)光物質(zhì)（如吖啶酯、魯米諾等）標(biāo)記抗原或抗體，發(fā)光物質(zhì)在反應(yīng)劑（如過氧化陰離子）激發(fā)下生成激發(fā)態(tài)中間體，當(dāng)回復(fù)至穩(wěn)定的基態(tài)時發(fā)射光子，通過自動發(fā)光分析儀測定光子產(chǎn)量，可反映待檢樣品中抗體或抗原含量。該法靈敏度高，常用于檢測血清超微量活性物質(zhì)（甲狀腺素等激素）。第二十一章免疫學(xué)所有實驗第一節(jié)三、抗原抗體反應(yīng)的基本檢測方法（四）免疫標(biāo)記技術(shù)5．免疫印跡法(immunoblot)

該法又稱Western印跡法，其結(jié)合凝膠電泳與固相免疫技術(shù)，將借助電泳所區(qū)分的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至固相載體，再應(yīng)用酶免疫、放射免疫等技術(shù)進行檢測。該法能對分子大小不同的蛋白質(zhì)進行分離并確定其分子量，常用于檢測多種病毒抗體或抗原（圖21-10）。第二十一章免疫學(xué)所有實驗第二節(jié)免疫細(xì)胞的檢測一、免疫細(xì)胞及其亞類計數(shù)（了解）

（一）外周血單個核細(xì)胞的分離體外檢測淋巴細(xì)胞，首先需制備外周血單個核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcell，PBMC)，常用的方法是葡聚糖-泛影葡胺（又稱淋巴細(xì)胞分離液）密度梯度離心法。第二十一章免疫學(xué)所有實驗第二節(jié)一、免疫細(xì)胞及其亞類計數(shù)（了解）（二）淋巴細(xì)胞亞群的分離1．尼龍棉分離法2．E花結(jié)分離法3．洗淘法4．流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry，F(xiàn)CM)

5．磁分離技術(shù)第二十一章免疫學(xué)所有實驗第二節(jié)一、免疫細(xì)胞及其亞類計數(shù)（三）淋巴細(xì)胞亞群計數(shù)1．免疫熒光技術(shù)2．微量細(xì)胞毒試驗在補體存在下，針對淋巴細(xì)胞CD分子的McAb與相應(yīng)CD分子結(jié)合，可激活補體而使細(xì)胞溶解，通過活細(xì)胞和死細(xì)胞對染料著色的不同，即可判斷待檢細(xì)胞是否表達特定CD分子，從而對淋巴細(xì)胞亞群進行計數(shù)第二十一章免疫學(xué)所有實驗第二節(jié)二、淋巴細(xì)胞功能測定（了解）（一）淋巴細(xì)胞功能測定的體外試驗1.淋巴細(xì)胞增殖試驗（1）3H-TdR摻入法：（2）MTT法：（3）形態(tài)學(xué)計數(shù)法：第二十一章免疫學(xué)所有實驗第二節(jié)二、淋巴細(xì)胞功能測定（了解）2．細(xì)胞毒試驗

CTL、NK細(xì)胞可直接殺傷不同靶細(xì)胞（如腫瘤細(xì)胞、移植供體細(xì)胞等）。通過檢測殺傷活性可用于腫瘤免疫、移植排斥反應(yīng)、病毒感染等方面研究。（1）51Cr釋放法：（圖21-11）。（2）乳酸脫氫酶（LDH）酶釋放法：（3）細(xì)胞凋亡檢查法：第二十一章免疫學(xué)所有實驗第二節(jié)二、淋巴細(xì)胞功能測定3．分泌功能測定（了解）（1）細(xì)胞因子分泌細(xì)胞的測定：（2）抗體形成細(xì)胞測定：常用溶血空斑試驗(hemolyticplaqueassay)，即測定針對SRBC表面已知抗原的抗體形成細(xì)胞數(shù)目。其原理是：抗體形成細(xì)胞分泌的Ig與SRBC表面抗原結(jié)合，在補體參與下出現(xiàn)溶血反應(yīng)。每一空斑中央含一個抗體形成細(xì)胞，空斑數(shù)目即為抗體形成細(xì)胞數(shù)（圖21-12）。亦可采用RHPA和ELISPOT法檢測抗體分泌細(xì)胞。圖21-12溶血空斑試驗第二十一章免疫學(xué)所有實驗第二節(jié)二、淋巴細(xì)胞功能測定（二）淋巴細(xì)胞功能測定的體內(nèi)試驗（了解）正常機體對特定抗原產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答后，再用相同抗原作皮膚試驗，即出現(xiàn)以局部紅腫為特征的遲發(fā)型超敏反應(yīng)，細(xì)胞免疫低下者呈陰性反應(yīng)。皮膚試驗方法簡便，可輔助診斷某些病原微生物感染（結(jié)核桿菌、麻風(fēng)桿菌）、免疫缺陷病等。皮膚試驗常用的生物性抗原多從病原體中提取，如結(jié)核菌素、麻風(fēng)菌素、鏈激酶-鏈道酶、念珠菌素、腮腺炎病毒等。第二十一章免疫學(xué)所有實驗第三節(jié)免疫分子的檢測一、免疫球蛋白的測定（了解）免疫球蛋白的測定有兩類方法：①在體外用已知抗原檢測相應(yīng)抗體，用于多種感染性疾病的輔助診斷與流行病學(xué)調(diào)查（前已述及）；②用已知抗體對各類免疫球蛋白作定性、定量測定。檢測血清含量高的IgG、IgA、IgM時，可用免疫比濁法；檢測IgD、IgE選用ELISA、RIA等靈敏度高的方法。診斷免疫球蛋白異常性疾?。ㄈ绻撬枇?、性聯(lián)無丙種球蛋白血癥等），可用免疫電泳等方法第二十一章免疫學(xué)所有實驗第三節(jié)二、補體測定（熟悉）測定血清補體含量與活性有助于了解體內(nèi)補體激活狀況，輔助有關(guān)疾病的診斷。對血清含量高的C3、C4、B因子等，可用免疫比濁法，其他含量低的成分則借助ELISA、RIA等方法。血清總補體活性測定常采用50%補體溶血法（CH50），其原理是：用SRBC和兔抗SRBC作為抗原抗體復(fù)合物，通過經(jīng)典途徑激活待檢血清中的補體，導(dǎo)致SRBC溶解。若待檢血清補體含量減少或成分缺失，則影響溶血結(jié)果，通常以50%溶血所需的最小補體量表示總補體活性第二十一章免疫學(xué)所有實驗第三節(jié)三、細(xì)胞因子檢測

（了解）

細(xì)胞因子檢測可分為免疫學(xué)測定法、生物學(xué)活性測定法及分子生物學(xué)測定法。（一）免疫學(xué)測定法1．分泌性細(xì)胞因子檢測常用方法為雙抗體夾心法、ELISA、免疫斑點法、放射免疫法（RIA）、ELISPOT、免疫印跡法等。某些細(xì)胞因子含量甚微的樣品（如腦脊液）可用免疫聚合酶鏈反應(yīng)（immuno-PCR）。2．胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測采用FCM免疫熒光技術(shù)可從單細(xì)胞水平檢測不同細(xì)胞亞群中的細(xì)胞因子，用兩種不同的熒光素分別標(biāo)記抗不同細(xì)胞因子的抗體，可在同一細(xì)胞內(nèi)同時檢測兩種不同的細(xì)胞因子，也可用多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)對胞內(nèi)多種細(xì)胞因子進行檢測。第二十一章免疫學(xué)所有實驗第三節(jié)三、細(xì)胞因子檢測（二）生物活性測定法1．促進細(xì)胞增殖和增殖抑制法2．抗病毒活性測定法3．直接殺傷法4．趨化活性測定法此外，某些細(xì)胞因子能誘導(dǎo)靶細(xì)胞表達某些膜分子或可溶性蛋白質(zhì)，可用熒光素標(biāo)記抗體檢測表達相應(yīng)分子的細(xì)胞數(shù)，或測定細(xì)胞所分泌的蛋白質(zhì)，間接了解細(xì)胞因子活性。第二十一章免疫學(xué)所有實驗第三節(jié)三、細(xì)胞因子檢測（三）分子生物學(xué)測定法具體方法為聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、實時定量PCR、RNA印跡法、核酸酶保護分析法和原位雜交法等，例如：根據(jù)細(xì)胞因子基