第九章 免疫學應用課件

第九章免疫學應用第九章

免疫學應用第九章免疫學應用第一節(jié)免疫學防治（一）人工自動免疫給機體輸入疫苗或類毒素等抗原物質，刺激機體產生特異性免疫力。免疫力出現較慢但持久，多用于預防。1、死疫苗：用物理、化學方法殺死病原微生物制備而成的疫苗。如傷寒、霍亂、百日咳等。2、活疫苗：通過毒力變異或人工選擇法獲得的減毒或無毒株。類似于輕癥或隱性感染。如卡介苗、麻疹、風疹、脊灰疫苗。3、類毒素：外毒素經0.3%~0.4%甲醛處理后失去毒性但保持抗原性的生物制品。如白喉、破傷風類毒素。4、新型疫苗：亞單位疫苗、合成疫苗和基因工程疫苗。第九章免疫學應用（二）人工自動免疫的注意事項1、接種對象2、接種劑量、次數和間隔時間3、接種途徑4、接種后反應5、禁忌癥第九章免疫學應用二、免疫學治療（一）人工被動免疫是給機體輸入抗體，使機體獲得特異性免疫力。維持時間短，一般2~3周，多用于緊急預防。如抗毒素、人丙種球蛋白、人特異性免疫球蛋白。（二）免疫增強劑是增強、促進和調節(jié)機體免疫功能的生物或非生物制劑。主要用于腫瘤、免疫缺陷病和傳染病的輔助治療。（三）過繼免疫：分特異性和非特異性兩種。（四）免疫抑制劑第九章免疫學應用第二節(jié)免疫學診斷

一、體液免疫檢測（抗原或抗體的檢測）抗原-抗體反應包括沉淀反應、凝集反應、溶解反應、補體結合反應和中和反應等?？乖?抗體反應可用已知的特異性抗體檢測未知的抗原；也可用已知的抗原檢測未知的抗體。免疫熒光技術、免疫酶技術、同位素標記技術、發(fā)光免疫分析等免疫標記技術提高了抗原抗體反應的敏感性。第九章免疫學應用抗原-抗體反應的特點

抗原-抗體的結合是特異性結合

抗原抗體結合是分子表面的非共價鍵結合

抗原抗體反應可分為兩個階段特異性結合階段可見的反應階段

抗原和抗體結合是否呈現可見的反應現象，于兩者的分子比例密切相關第九章免疫學應用抗原抗體比例對反應現象的影響第九章免疫學應用抗原-抗體反應受多種因素影響1電解質：抗原-抗體反應通常應用0.85%的氯化鈉作為稀釋液，以供給適應濃度的電解質。2溫度：一般常使用反應在37度水浴或孵育箱中進行。3.酸堿度：抗原-抗體反應適應的酸堿度

為PH6~8?？乖?抗體反應受多種因素影響第九章免疫學應用抗原抗體的檢測方法凝集反應沉淀反應補體溶血反應和補體結合反應中和反應用標記抗體或抗原進行的抗原抗體反應第九章免疫學應用凝集反應

(Agglutination)細菌、紅細胞等顆粒性抗原與相應抗體結合后形成凝集現象，稱為凝聚反應。1、直接凝集：將細菌或紅細胞與相應的抗體直接反應，出現細菌凝集或紅細胞凝集現象。又分為玻片法和試管法。2、間接凝集：將可溶性抗原包被在紅細胞或乳膠顆粒表面，與相應抗體反應出現顆粒凝集現象。第九章免疫學應用血球凝集第九章免疫學應用

沉淀反應

（Precipitation)血清蛋白質、細胞裂解液或組織浸液等可溶性抗原與相應抗體結合后出現沉淀物，這一類反應稱為沉淀反應。沉淀反應可在液體中進行，如絮狀沉淀。大多沉淀反應是用半固體瓊脂凝膠為介質，進行瓊脂擴散故也稱免疫擴散。第九章免疫學應用單向免疫擴散

(SingleImmunodiffusion)是將一定量已知抗體混于瓊脂凝膠中制瓊脂板，在適當位置打孔后將抗原加入孔中擴散?？乖跀U散過程中與凝膠中的抗體相遇，形成以抗原孔為中心的沉淀環(huán)，環(huán)的直徑與抗原含量成正比相關。本法常用于測定血清IgG、IgM、IgA和C3等的含量。含抗體的凝膠沉淀環(huán)第九章免疫學應用雙向免疫擴散

（DoubleImmunodiffusion)是將抗原與抗體分別加入瓊脂凝膠的小孔中，二者自由向周圍擴散并相遇，在比例合適處形成沉淀線。如果反應體系中含兩種以上的抗原抗體系統，則小孔間可出現兩條以上的沉淀線。本法常用于抗原或抗體的定性、組成和兩種抗原相關性分析的檢測。第九章免疫學應用免疫電泳

（Immunoelectrophoresis)是先將待側血清標本作瓊脂凝膠電泳，血清中各蛋白組分被分成不同的區(qū)帶，然后與電泳方向平行挖一小槽，加入相應的抗血清，把分成區(qū)帶的蛋白抗原成分作雙向免疫擴散，在各區(qū)帶相應的位置形成沉淀弧。該法常用于血清蛋白種類分析，以觀察Ig的異常增多或缺失。第九章免疫學應用火箭電泳（RocketElectrophoresis)

火箭電泳也稱免疫擴散，是把單向免疫擴散同電泳結合在一起的方法?？乖诤卸靠贵w的瓊脂中泳動，兩者比例適宜時，在較短時間內生成錐形的沉淀峰。在一定濃度范圍內，沉淀峰的高度與抗原含量成正比。此法的特點是需時較短，故可用于快速沉淀標本中抗原的含量。第九章免疫學應用火箭電泳示意圖第九章免疫學應用補體結合反應（ComplementFixation,CFT)

敏感性和特異性均較高，但該試驗影響因素較多，現在已有被其它新方法取代的趨勢。第九章免疫學應用免疫標記技術用熒光素、同位素或酶等示蹤物質標記抗體（或抗原）進行抗原-抗體反應。標記物質與抗體（或抗原）的化學連接未改變抗體（或抗原）的免疫學特性，同時標記物的性質依然存在，因而極大的提高了反應的靈敏度，可以對微量物質進行定量、定性或定位檢測。免疫標記技術主要有三種基本類型：免疫熒光技術、免疫酶技術和同位素標記技術。第九章免疫學應用免疫熒光顯微技術

(ImmunofluorescenceTechnique)是用熒光素（常用的有異硫氰酸熒光素，FITC)與抗體連接成熒光抗體，再與待測標本的抗原反應，，置熒光顯微鏡下觀察，抗原抗體復合物散發(fā)出熒光，借此對標本中的抗原作鑒定和定位。包括直接熒光法、間接熒光法和補體法。第九章免疫學應用直接熒光法：將熒光素直接標記抗體作標本染色。該法的優(yōu)點是特異性強，但其缺點是每檢測一種抗原必須制備相應的熒光抗體。間接熒光法：用一抗與標本中的抗原結合，再用熒光素標記的二抗染色。該法的優(yōu)點是敏感性比直接法高，制備一種熒光素標記的二抗可用于多種抗原的檢測，但非特異性熒光亦會增加。補體結合免疫熒光法：此法是在間接法的第一步抗原—抗體反應時加入補體，使之與抗原——抗體復合物結合；再用熒光素標記的抗C3抗體進行示蹤。第九章免疫學應用間接免疫熒光法示意圖第九章免疫學應用免疫熒光顯微技術第九章免疫學應用流式細胞術（FlowCytometry,FCM)

FCM是將免疫熒光技術應用于流式細胞儀，對單個細胞的表面標志（抗原或受體）進行快速、精確的分析和自動檢測，并將不同類型的細胞分選收集。FCM還可對同一細胞的多種參數（如DNA、RNA、蛋白質和細胞體積等）進行多信息分析，為當代生命科學研究領域中廣泛使用的一項新技術。流式細胞術第九章免疫學應用流式細胞儀工作原理第九章免疫學應用酶免疫測定

(EnzymeImmunoassay,EIA)是用酶（常用的有辣根過氧化物酶，HRP和堿性磷酸酶，AP)標記的抗體進行的抗原抗體反應。EIA將抗原抗體反應的特異性與酶催化作用的高效性相結合，通過酶作用于底物后顯色來判定結果。常用的方法有酶聯免疫吸附試驗和酶免疫組化法，前者測定可溶性抗原或抗體，后者測定組織中或細胞表面的抗原。第九章免疫學應用酶聯免疫吸附試驗

(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay,ELISA)是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體（聚苯乙烯微量反應板）表面，使抗原抗體反應在固相表面進行。用洗滌法將液相中游離成分洗除。主要有雙抗體夾心法、間接法BAS-ELISA等。第九章免疫學應用ELISA檢測抗體第九章免疫學應用第九章免疫學應用放射免疫測定法

(Radioimmunoassay,RIA)是用放射性核素標記抗原進行的免疫學檢測技術。它將放射性核素顯示的高靈敏性和抗原抗體反應的特異性結合，使檢測的敏感性達pg水平。常用于標記的放射性核素有I125和I131。常用于胰島素、生長激素、藥物等微量物質的測定。第九章免疫學應用

Ag*AbAg

標記抗原特異性抗體待測抗原(Ag*-Ab)+(Ag-Ab)抗原抗體復合物分離Ag*-Ab和游離Ag*從標準曲線上讀知含量測定Ag*-Ab和/或游離Ag*放射性放射免疫測定法(RIA)示意圖第九章免疫學應用RIA法原理及標準曲線

7550301001101001000未標記抗原濃度（ng/ml)結合/未結合的放射活性（%）第九章免疫學應用免疫印跡法(Immunoblotting)是將凝膠電泳與固相免疫測定結合，先把電泳分區(qū)的蛋白質轉移到固相載體，再用酶免疫、放射免疫等技術測定。該法能分離分子大小不同的蛋白質并確定其分子量。常用于檢測多種病毒如HIV的抗體或抗原。第九章免疫學應用免疫印跡法示意圖第九章免疫學應用第二節(jié)淋巴細胞的測定

檢測各群體淋巴細胞的數量與功能是觀察機體免疫狀態(tài)的重要手段。外周血是病人主要的檢測標本，但僅代表再循環(huán)的淋巴細胞。實驗動物還可取胸腺、脾、淋巴結等作為標本進行檢查。第九章免疫學應用(1)抗凝靜脈血(2)加等量NS(4)密度梯度離心血漿分離液RBCPBMCPMN(3)混勻后，緩慢加于分離液上第九章免疫學應用一、淋巴細胞類型和數目的測定1、花結試驗：E花結試驗可用于檢測T細胞數目。EA花結試驗可用于檢測B細胞數目。2、免疫熒光法：常采用間接免疫熒光法。3、流式細胞術：借助流式細胞儀（FCM)。第九章免疫學應用花結試驗示意圖第九章免疫學應用T細胞功能測定體外法：T細胞增殖試驗形態(tài)學檢查

3H-TdR摻入法

MTT法體內法：用生物抗原或化學抗原作皮內試驗。OT-PPD皮試SD-SK皮試

第九章免疫學應用培養(yǎng)液3H-TdRPHA淋巴細胞全血分層液離心過濾測量放射性淋巴細胞增殖試驗（3H-TdR摻入法）示意圖第九章免疫學應用靶細胞51Cr洗滌去除游離的51Cr效應細胞測量上清液中釋放的51Cr混合培養(yǎng)4-6小時細胞毒試驗（51Cr釋放法）示意圖第九章免疫學應用酶聯免疫斑點法

（Enzyme-LinkedImmunospot,ELISA)是在ELISA的基礎上建立的檢測抗體生成細胞及細胞因子產生細胞的方法。第九章免疫學應用CK抗體包被的反應板

CK抗原包被的反應板加入淋巴細胞加入酶標記二抗加入底物檢測抗原特異性B細胞加入底物T細胞產生CK的檢測加入淋巴細胞加入酶標的CK抗體第九章免疫學應用淋巴細胞轉化試驗（形態(tài)學示意圖）原理：人T細胞表面有PHA或ConA受體，T細胞在體外受PHA或ConA的刺激后能轉化為體積較大、代謝旺盛、且能進行分裂的淋巴細胞，以此測定T細胞的功能。

PHA刺激48~72小時第九章免疫學應用淋巴細胞增殖—3H-TdR摻入法原理：將單個核細胞中加入PHA共同培養(yǎng)，在終止培養(yǎng)前8~15小時加入氚標記的胸腺嘧啶核苷（3H-TdR),經β-液體閃爍儀檢測淋巴細胞DNA的3H-TdR摻入量，推測淋巴細胞增殖的程度。第九章免疫學應用MTT(四甲