第九章 免疫學(xué)應(yīng)用課件

第九章免疫學(xué)應(yīng)用第九章

免疫學(xué)應(yīng)用第九章免疫學(xué)應(yīng)用第一節(jié)免疫學(xué)防治（一）人工自動(dòng)免疫給機(jī)體輸入疫苗或類毒素等抗原物質(zhì)，刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫力。免疫力出現(xiàn)較慢但持久，多用于預(yù)防。1、死疫苗：用物理、化學(xué)方法殺死病原微生物制備而成的疫苗。如傷寒、霍亂、百日咳等。2、活疫苗：通過(guò)毒力變異或人工選擇法獲得的減毒或無(wú)毒株。類似于輕癥或隱性感染。如卡介苗、麻疹、風(fēng)疹、脊灰疫苗。3、類毒素：外毒素經(jīng)0.3%~0.4%甲醛處理后失去毒性但保持抗原性的生物制品。如白喉、破傷風(fēng)類毒素。4、新型疫苗：亞單位疫苗、合成疫苗和基因工程疫苗。第九章免疫學(xué)應(yīng)用（二）人工自動(dòng)免疫的注意事項(xiàng)1、接種對(duì)象2、接種劑量、次數(shù)和間隔時(shí)間3、接種途徑4、接種后反應(yīng)5、禁忌癥第九章免疫學(xué)應(yīng)用二、免疫學(xué)治療（一）人工被動(dòng)免疫是給機(jī)體輸入抗體，使機(jī)體獲得特異性免疫力。維持時(shí)間短，一般2~3周，多用于緊急預(yù)防。如抗毒素、人丙種球蛋白、人特異性免疫球蛋白。（二）免疫增強(qiáng)劑是增強(qiáng)、促進(jìn)和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的生物或非生物制劑。主要用于腫瘤、免疫缺陷病和傳染病的輔助治療。（三）過(guò)繼免疫：分特異性和非特異性兩種。（四）免疫抑制劑第九章免疫學(xué)應(yīng)用第二節(jié)免疫學(xué)診斷

一、體液免疫檢測(cè)（抗原或抗體的檢測(cè)）抗原-抗體反應(yīng)包括沉淀反應(yīng)、凝集反應(yīng)、溶解反應(yīng)、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)和中和反應(yīng)等?？乖?抗體反應(yīng)可用已知的特異性抗體檢測(cè)未知的抗原；也可用已知的抗原檢測(cè)未知的抗體。免疫熒光技術(shù)、免疫酶技術(shù)、同位素標(biāo)記技術(shù)、發(fā)光免疫分析等免疫標(biāo)記技術(shù)提高了抗原抗體反應(yīng)的敏感性。第九章免疫學(xué)應(yīng)用抗原-抗體反應(yīng)的特點(diǎn)

抗原-抗體的結(jié)合是特異性結(jié)合

抗原抗體結(jié)合是分子表面的非共價(jià)鍵結(jié)合

抗原抗體反應(yīng)可分為兩個(gè)階段特異性結(jié)合階段可見(jiàn)的反應(yīng)階段

抗原和抗體結(jié)合是否呈現(xiàn)可見(jiàn)的反應(yīng)現(xiàn)象，于兩者的分子比例密切相關(guān)第九章免疫學(xué)應(yīng)用抗原抗體比例對(duì)反應(yīng)現(xiàn)象的影響第九章免疫學(xué)應(yīng)用抗原-抗體反應(yīng)受多種因素影響1電解質(zhì)：抗原-抗體反應(yīng)通常應(yīng)用0.85%的氯化鈉作為稀釋液，以供給適應(yīng)濃度的電解質(zhì)。2溫度：一般常使用反應(yīng)在37度水浴或孵育箱中進(jìn)行。3.酸堿度：抗原-抗體反應(yīng)適應(yīng)的酸堿度

為PH6~8?？乖?抗體反應(yīng)受多種因素影響第九章免疫學(xué)應(yīng)用抗原抗體的檢測(cè)方法凝集反應(yīng)沉淀反應(yīng)補(bǔ)體溶血反應(yīng)和補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)中和反應(yīng)用標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)第九章免疫學(xué)應(yīng)用凝集反應(yīng)

(Agglutination)細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆粒性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后形成凝集現(xiàn)象，稱為凝聚反應(yīng)。1、直接凝集：將細(xì)菌或紅細(xì)胞與相應(yīng)的抗體直接反應(yīng)，出現(xiàn)細(xì)菌凝集或紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。又分為玻片法和試管法。2、間接凝集：將可溶性抗原包被在紅細(xì)胞或乳膠顆粒表面，與相應(yīng)抗體反應(yīng)出現(xiàn)顆粒凝集現(xiàn)象。第九章免疫學(xué)應(yīng)用血球凝集第九章免疫學(xué)應(yīng)用

沉淀反應(yīng)

（Precipitation)血清蛋白質(zhì)、細(xì)胞裂解液或組織浸液等可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后出現(xiàn)沉淀物，這一類反應(yīng)稱為沉淀反應(yīng)。沉淀反應(yīng)可在液體中進(jìn)行，如絮狀沉淀。大多沉淀反應(yīng)是用半固體瓊脂凝膠為介質(zhì)，進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散故也稱免疫擴(kuò)散。第九章免疫學(xué)應(yīng)用單向免疫擴(kuò)散

(SingleImmunodiffusion)是將一定量已知抗體混于瓊脂凝膠中制瓊脂板，在適當(dāng)位置打孔后將抗原加入孔中擴(kuò)散?？乖跀U(kuò)散過(guò)程中與凝膠中的抗體相遇，形成以抗原孔為中心的沉淀環(huán)，環(huán)的直徑與抗原含量成正比相關(guān)。本法常用于測(cè)定血清IgG、IgM、IgA和C3等的含量。含抗體的凝膠沉淀環(huán)第九章免疫學(xué)應(yīng)用雙向免疫擴(kuò)散

（DoubleImmunodiffusion)是將抗原與抗體分別加入瓊脂凝膠的小孔中，二者自由向周圍擴(kuò)散并相遇，在比例合適處形成沉淀線。如果反應(yīng)體系中含兩種以上的抗原抗體系統(tǒng)，則小孔間可出現(xiàn)兩條以上的沉淀線。本法常用于抗原或抗體的定性、組成和兩種抗原相關(guān)性分析的檢測(cè)。第九章免疫學(xué)應(yīng)用免疫電泳

（Immunoelectrophoresis)是先將待側(cè)血清標(biāo)本作瓊脂凝膠電泳，血清中各蛋白組分被分成不同的區(qū)帶，然后與電泳方向平行挖一小槽，加入相應(yīng)的抗血清，把分成區(qū)帶的蛋白抗原成分作雙向免疫擴(kuò)散，在各區(qū)帶相應(yīng)的位置形成沉淀弧。該法常用于血清蛋白種類分析，以觀察Ig的異常增多或缺失。第九章免疫學(xué)應(yīng)用火箭電泳（RocketElectrophoresis)

火箭電泳也稱免疫擴(kuò)散，是把單向免疫擴(kuò)散同電泳結(jié)合在一起的方法。抗原在含有定量抗體的瓊脂中泳動(dòng)，兩者比例適宜時(shí)，在較短時(shí)間內(nèi)生成錐形的沉淀峰。在一定濃度范圍內(nèi)，沉淀峰的高度與抗原含量成正比。此法的特點(diǎn)是需時(shí)較短，故可用于快速沉淀標(biāo)本中抗原的含量。第九章免疫學(xué)應(yīng)用火箭電泳示意圖第九章免疫學(xué)應(yīng)用補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)（ComplementFixation,CFT)

敏感性和特異性均較高，但該試驗(yàn)影響因素較多，現(xiàn)在已有被其它新方法取代的趨勢(shì)。第九章免疫學(xué)應(yīng)用免疫標(biāo)記技術(shù)用熒光素、同位素或酶等示蹤物質(zhì)標(biāo)記抗體（或抗原）進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)。標(biāo)記物質(zhì)與抗體（或抗原）的化學(xué)連接未改變抗體（或抗原）的免疫學(xué)特性，同時(shí)標(biāo)記物的性質(zhì)依然存在，因而極大的提高了反應(yīng)的靈敏度，可以對(duì)微量物質(zhì)進(jìn)行定量、定性或定位檢測(cè)。免疫標(biāo)記技術(shù)主要有三種基本類型：免疫熒光技術(shù)、免疫酶技術(shù)和同位素標(biāo)記技術(shù)。第九章免疫學(xué)應(yīng)用免疫熒光顯微技術(shù)

(ImmunofluorescenceTechnique)是用熒光素（常用的有異硫氰酸熒光素，F(xiàn)ITC)與抗體連接成熒光抗體，再與待測(cè)標(biāo)本的抗原反應(yīng)，，置熒光顯微鏡下觀察，抗原抗體復(fù)合物散發(fā)出熒光，借此對(duì)標(biāo)本中的抗原作鑒定和定位。包括直接熒光法、間接熒光法和補(bǔ)體法。第九章免疫學(xué)應(yīng)用直接熒光法：將熒光素直接標(biāo)記抗體作標(biāo)本染色。該法的優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng)，但其缺點(diǎn)是每檢測(cè)一種抗原必須制備相應(yīng)的熒光抗體。間接熒光法：用一抗與標(biāo)本中的抗原結(jié)合，再用熒光素標(biāo)記的二抗染色。該法的優(yōu)點(diǎn)是敏感性比直接法高，制備一種熒光素標(biāo)記的二抗可用于多種抗原的檢測(cè)，但非特異性熒光亦會(huì)增加。補(bǔ)體結(jié)合免疫熒光法：此法是在間接法的第一步抗原—抗體反應(yīng)時(shí)加入補(bǔ)體，使之與抗原——抗體復(fù)合物結(jié)合；再用熒光素標(biāo)記的抗C3抗體進(jìn)行示蹤。第九章免疫學(xué)應(yīng)用間接免疫熒光法示意圖第九章免疫學(xué)應(yīng)用免疫熒光顯微技術(shù)第九章免疫學(xué)應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry,FCM)

FCM是將免疫熒光技術(shù)應(yīng)用于流式細(xì)胞儀，對(duì)單個(gè)細(xì)胞的表面標(biāo)志（抗原或受體）進(jìn)行快速、精確的分析和自動(dòng)檢測(cè)，并將不同類型的細(xì)胞分選收集。FCM還可對(duì)同一細(xì)胞的多種參數(shù)（如DNA、RNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞體積等）進(jìn)行多信息分析，為當(dāng)代生命科學(xué)研究領(lǐng)域中廣泛使用的一項(xiàng)新技術(shù)。流式細(xì)胞術(shù)第九章免疫學(xué)應(yīng)用流式細(xì)胞儀工作原理第九章免疫學(xué)應(yīng)用酶免疫測(cè)定

(EnzymeImmunoassay,EIA)是用酶（常用的有辣根過(guò)氧化物酶，HRP和堿性磷酸酶，AP)標(biāo)記的抗體進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。EIA將抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶催化作用的高效性相結(jié)合，通過(guò)酶作用于底物后顯色來(lái)判定結(jié)果。常用的方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和酶免疫組化法，前者測(cè)定可溶性抗原或抗體，后者測(cè)定組織中或細(xì)胞表面的抗原。第九章免疫學(xué)應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay,ELISA)是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體（聚苯乙烯微量反應(yīng)板）表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行。用洗滌法將液相中游離成分洗除。主要有雙抗體夾心法、間接法BAS-ELISA等。第九章免疫學(xué)應(yīng)用ELISA檢測(cè)抗體第九章免疫學(xué)應(yīng)用第九章免疫學(xué)應(yīng)用放射免疫測(cè)定法

(Radioimmunoassay,RIA)是用放射性核素標(biāo)記抗原進(jìn)行的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)。它將放射性核素顯示的高靈敏性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合，使檢測(cè)的敏感性達(dá)pg水平。常用于標(biāo)記的放射性核素有I125和I131。常用于胰島素、生長(zhǎng)激素、藥物等微量物質(zhì)的測(cè)定。第九章免疫學(xué)應(yīng)用

Ag*AbAg

標(biāo)記抗原特異性抗體待測(cè)抗原(Ag*-Ab)+(Ag-Ab)抗原抗體復(fù)合物分離Ag*-Ab和游離Ag*從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀知含量測(cè)定Ag*-Ab和/或游離Ag*放射性放射免疫測(cè)定法(RIA)示意圖第九章免疫學(xué)應(yīng)用RIA法原理及標(biāo)準(zhǔn)曲線

7550301001101001000未標(biāo)記抗原濃度（ng/ml)結(jié)合/未結(jié)合的放射活性（%）第九章免疫學(xué)應(yīng)用免疫印跡法(Immunoblotting)是將凝膠電泳與固相免疫測(cè)定結(jié)合，先把電泳分區(qū)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體，再用酶免疫、放射免疫等技術(shù)測(cè)定。該法能分離分子大小不同的蛋白質(zhì)并確定其分子量。常用于檢測(cè)多種病毒如HIV的抗體或抗原。第九章免疫學(xué)應(yīng)用免疫印跡法示意圖第九章免疫學(xué)應(yīng)用第二節(jié)淋巴細(xì)胞的測(cè)定

檢測(cè)各群體淋巴細(xì)胞的數(shù)量與功能是觀察機(jī)體免疫狀態(tài)的重要手段。外周血是病人主要的檢測(cè)標(biāo)本，但僅代表再循環(huán)的淋巴細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物還可取胸腺、脾、淋巴結(jié)等作為標(biāo)本進(jìn)行檢查。第九章免疫學(xué)應(yīng)用(1)抗凝靜脈血(2)加等量NS(4)密度梯度離心血漿分離液RBCPBMCPMN(3)混勻后，緩慢加于分離液上第九章免疫學(xué)應(yīng)用一、淋巴細(xì)胞類型和數(shù)目的測(cè)定1、花結(jié)試驗(yàn)：E花結(jié)試驗(yàn)可用于檢測(cè)T細(xì)胞數(shù)目。EA花結(jié)試驗(yàn)可用于檢測(cè)B細(xì)胞數(shù)目。2、免疫熒光法：常采用間接免疫熒光法。3、流式細(xì)胞術(shù)：借助流式細(xì)胞儀（FCM)。第九章免疫學(xué)應(yīng)用花結(jié)試驗(yàn)示意圖第九章免疫學(xué)應(yīng)用T細(xì)胞功能測(cè)定體外法：T細(xì)胞增殖試驗(yàn)形態(tài)學(xué)檢查

3H-TdR摻入法

MTT法體內(nèi)法：用生物抗原或化學(xué)抗原作皮內(nèi)試驗(yàn)。OT-PPD皮試SD-SK皮試

第九章免疫學(xué)應(yīng)用培養(yǎng)液3H-TdRPHA淋巴細(xì)胞全血分層液離心過(guò)濾測(cè)量放射性淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)（3H-TdR摻入法）示意圖第九章免疫學(xué)應(yīng)用靶細(xì)胞51Cr洗滌去除游離的51Cr效應(yīng)細(xì)胞測(cè)量上清液中釋放的51Cr混合培養(yǎng)4-6小時(shí)細(xì)胞毒試驗(yàn)（51Cr釋放法）示意圖第九章免疫學(xué)應(yīng)用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法

（Enzyme-LinkedImmunospot,ELISA)是在ELISA的基礎(chǔ)上建立的檢測(cè)抗體生成細(xì)胞及細(xì)胞因子產(chǎn)生細(xì)胞的方法。第九章免疫學(xué)應(yīng)用CK抗體包被的反應(yīng)板

CK抗原包被的反應(yīng)板加入淋巴細(xì)胞加入酶標(biāo)記二抗加入底物檢測(cè)抗原特異性B細(xì)胞加入底物T細(xì)胞產(chǎn)生CK的檢測(cè)加入淋巴細(xì)胞加入酶標(biāo)的CK抗體第九章免疫學(xué)應(yīng)用淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)（形態(tài)學(xué)示意圖）原理：人T細(xì)胞表面有PHA或ConA受體，T細(xì)胞在體外受PHA或ConA的刺激后能轉(zhuǎn)化為體積較大、代謝旺盛、且能進(jìn)行分裂的淋巴細(xì)胞，以此測(cè)定T細(xì)胞的功能。

PHA刺激48~72小時(shí)第九章免疫學(xué)應(yīng)用淋巴細(xì)胞增殖—3H-TdR摻入法原理：將單個(gè)核細(xì)胞中加入PHA共同培養(yǎng)，在終止培養(yǎng)前8~15小時(shí)加入氚標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷（3H-TdR),經(jīng)β-液體閃爍儀檢測(cè)淋巴細(xì)胞DNA的3H-TdR摻入量，推測(cè)淋巴細(xì)胞增殖的程度。第九章免疫學(xué)應(yīng)用MTT(四甲