熒光定量PCR在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

熒光定量PCR在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用內(nèi)容提要一、基因診斷技術(shù)簡介二、乙型肝炎的病原檢測三、丙型肝炎的病原檢測四、性病相關(guān)病原體的檢測基因診斷技術(shù)簡介概念基因診斷01免疫學(xué)診斷02臨床診斷03細胞膜04細胞核05DNA06轉(zhuǎn)錄07mRNA08翻譯09蛋白質(zhì)10形態(tài)學(xué)診斷11生化診斷12PCR與基因診斷技術(shù)基因診斷即通過核酸的分子生物學(xué)檢測直接檢測基因的存在狀態(tài)或缺陷對疾病作出診斷的方法。九十年代中期PCR臨床應(yīng)用在國內(nèi)全面開展，1998年，熒光定量PCR技術(shù)開始在中國應(yīng)用于臨床檢測。Polymerasechainreaction(PCR)，聚合酶鏈式反應(yīng)，是一種DNA的快速擴增技術(shù)。PCR技術(shù)通過兩個短的稱為引物的DNA小片段和一種耐熱酶的作用，可在3個小時內(nèi)把特定的DNA片段擴增1000萬倍。熒光定量PCR技術(shù)實時熒光定量PCR技術(shù)，是指在反應(yīng)體系中加入熒光標記，利用熒光信號積累實時檢測整個PCR過程，通過標準曲線對PCR終產(chǎn)物的分析，最終實現(xiàn)對未知的起始模版進行定量分析的一種技術(shù)，是迄今對已知基因序列的核酸測定中最靈敏的方法。熒光染料：SYBRGreenI、EVAGreen熒光探針：TaqMan、HybridizationProbes、MolecularBeacon熒光定量PCR技術(shù)的優(yōu)點01特異性強：直接擴增病原體的特異DNA或異?；蚱?2靈敏度高：可檢測到極少量的DNA，有效降低漏診率03高效省時：擴增周期短，有利于快速診斷04取材范圍廣：血清、痰液、體液、毛發(fā)等多種樣本05全封閉反應(yīng)：無需PCR后處理，降低污染06定量準確：利用標準曲線法，采用對數(shù)期分析07自動化程度高：操作安全，避免人為判斷RocheLightCycler熒光定量PCR技術(shù)的臨床應(yīng)用病毒性肝炎（HBV、HBV-YMDD、HCV）的基因檢測性病相關(guān)病原體（CT、NG、UU、HPV）的基因檢測優(yōu)生優(yōu)育項目診斷：人巨細胞病毒（HCMV）、單純皰疹病毒II型（HSV）、弓形蟲（TOX）、風(fēng)疹病毒其它病原體檢測：結(jié)核桿菌、肺炎支原體、EB病毒、傷寒桿菌、幽門螺旋桿菌等乙型肝炎的病原檢測乙肝病毒HBV的感染過程乙肝如何傳染？慢性HBV感染病毒持續(xù)6個月未被清除者免疫耐受期：HBV復(fù)制活躍免疫清除期非活動或低復(fù)制期慢性乙型肝炎HBeAg陽性慢性乙型肝炎HBeAg陰性慢性乙型肝炎乙型肝炎肝硬化代償期肝硬化失代償期肝硬化HBsAg與抗HBsHBsAg在感染HBV兩周后即可陽性。只要HBsAg陽性就可診斷HBV感染，陰性則不能排除HBV感染。抗HBs為保護性抗體，陽性表示對HBV有免疫力。HBsAg和抗HBs同時陰性：即所謂窗口期，此時HBsAg和抗HBs都未產(chǎn)生。HBsAg和抗HBs同時陽性：HBV感染恢復(fù)期，此時HBsAg未消失，抗HBs已產(chǎn)生?；蛘呤莵喰透腥尽槭裁碒BsAg陰性不能排除HBV感染？窗口期檢測試劑不夠靈敏隱匿性慢性乙肝（S基因變異）重疊HCV感染（干擾HBsAg合成）抗HBs陽性就萬無一失了嗎？單一抗HBs陽性HBVDNA檢出率0-11.8%先后感染了不同的HBV亞型HBV病毒S基因變異如何診斷血清HBsAg陰性的HBV感染？添加標題提高檢測敏感性添加標題采用針對變異抗原的檢測試劑添加標題HBVDNA的檢測！HBeAg與抗HBeHBeAg的存在表示病毒復(fù)制活躍且有較強的傳染性。HBeAg消失而抗HBe產(chǎn)生稱為血清轉(zhuǎn)換?？笻Be陽轉(zhuǎn)后，病毒復(fù)制水平低，傳染性降低。但長期抗HBe陽性者并不代表病毒復(fù)制停止或無傳染性，研究顯示20%～50%仍可檢測到HBVDNA，部分可能由于前C區(qū)基因變異，導(dǎo)致不能形成HBeAg。HBeAg與抗HBe共存？01處于血清轉(zhuǎn)換過程中02野生株與變異株同時存在HBeAg水平與HBVDNA的關(guān)系添加標題HBeAg陽性標本HBVDNA檢出率90％左右01添加標題HBeAg與HBVDNA有著良好的相關(guān)性02HBeAg陰性/抗HBe陽性/HBVDNA陽性HBVDNA水平一般較低HBV低水平復(fù)制HBV病毒前C區(qū)基因變異重疊HCV感染“兩對半”缺陷“兩對半”是機體的免疫反應(yīng)狀態(tài)，為間接指標?！皵y帶者”、“大三陽”、“小三陽”等免疫學(xué)指標不能反應(yīng)體內(nèi)病毒復(fù)制水平與感染程度。HBsAg陰性或HBeAg陰性不能排除HBV感染。HBVDNAHBVDNA拷貝數(shù)＝乙肝病毒載量是病毒復(fù)制和傳染性的直接標志。HBVDNA定量對于判斷病毒復(fù)制程度、傳染性大小、病毒藥物療效等有重要意義。HBVDNA檢測的臨床意義HBVDNA是HBV存在最直接的依據(jù)HBVDNA是HBV復(fù)制的標志HBVDNA是患者具有傳染性的標志HBVDNA對乙肝兩對半起補充作用HBVDNA是目前判斷乙肝抗病毒藥物療效最敏感的指標HBVDNA可檢測出隱匿性慢性乙型肝炎HBVDNA檢測的臨床意義提供直接證據(jù)縮短“窗口期”有利于獻血員窗口期病毒核酸的篩查和早期診斷PCR檢測“窗口期”核酸檢測縮短的“窗口期”的天數(shù)HBV566-15HCV7041-60HIV2210-15logoHBVDNA檢測的臨床意義調(diào)查表明并不是所有“大三陽”的病人都處于HBV復(fù)制期，具有傳染性；也不是所有“小三陽”的病人HBV都無復(fù)制。因此，要準確知道HBV是否處于復(fù)制狀態(tài)，最準確的方法還是通過檢測HBVDNA來決定。斑點雜交（基本淘汰）定性PCR（基本淘汰）熒光定量PCR（主流）基因芯片（將來？）HBVDNA檢測方法為什么建議病人要進行

HBVDNA檢測？熒光定量PCR方法檢測HBV感染的各期血清標本Copies/mlHBeAg陽性慢性乙型肝炎病人8.3x108經(jīng)α干擾素治療后HBeAg轉(zhuǎn)陰6.2x103非活動性HBsAg攜帶者血清5.6x103原先血中HBVDNA陽性，已痊愈超過12個月的血清<103logoHBsAg和HBeAg均陽性而HBVDNA陰性？干擾素或拉米夫定等治療后病毒復(fù)制受抑制。PCR所用引物相應(yīng)的DNA序列發(fā)生突變，此引物與突變DNA不能配對結(jié)合。病毒DNA整合于宿主肝細胞染色體而血中游離HBVDNA很少或缺乏。乙肝的治療目前尚無一種能迅速、直接殺死清除乙肝病毒的藥物，最好的抗病毒藥物療效也僅能達到50％左右。目前國際醫(yī)學(xué)界公認的治療慢性乙肝有確切療效的抗病毒藥物主要有兩大類：干擾素：重組人α-1b干擾素、α-2a、α-2b干擾素等。核苷類似物：拉米夫定、阿德福韋。乙肝的治療添加標題主要包括抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗炎保肝、抗纖維化等01添加標題對于HBVDNA≥105的患者應(yīng)進行抗病毒治療02拉米夫定此外拉米夫定還能抑制肝移植受體和AIDS病人體內(nèi)的HBV復(fù)制。尤其是拉米夫定不受病毒感染的模式、野生型或基因組前C區(qū)突變的影響。可迅速降低HBVDNA的濃度，改善肝臟組織的病變，還可能阻斷肝纖維化的進程，終止肝硬化的發(fā)展。拉米夫定治療人群添加標題添加標題添加標題添加標題添加標題干擾素治療失敗接受肝臟移植的患者代償期的慢性乙型肝炎前C區(qū)變異的慢性乙型肝炎有明顯HBVDNA復(fù)制者拉米夫定治療效果絕大多數(shù)患者HBVDNA水平顯著下降。用藥4周開始下降，12至16周約半數(shù)以上的病例血清HBVDNA降到可檢測水平以下。治療1年后HBeAg陰轉(zhuǎn)率約為20%。應(yīng)用抗病毒藥物后如何判斷療效？病毒學(xué)應(yīng)答：HBVDNA低于檢測下限血清學(xué)應(yīng)答生化學(xué)應(yīng)答組織學(xué)應(yīng)答應(yīng)用抗病毒藥物后如何判斷療效？隨訪1年持續(xù)應(yīng)答治療結(jié)束時完全應(yīng)答無應(yīng)答YMDD變異抗病毒治療中存在的問題YMDD：酪氨酸－蛋氨酸－天門冬氨酸－天門冬氨酸蛋氨酸（M）突變?yōu)楫惲涟保↖）或纈氨酸（V）形成YIDD變異株或YVDD變異株。HBV-YMDD變異檢測的臨床意義動態(tài)檢測：服用拉米夫定3個月開始，每月檢測1次提前發(fā)現(xiàn)：可在耐藥臨床表現(xiàn)發(fā)生前1-4個月檢測出突變株及時調(diào)整：適時調(diào)整用藥方案，防止因耐藥而導(dǎo)致病情惡化丙型肝炎的病原檢測丙肝病毒HCV是單鏈RNA病毒主要通過血液和血制品傳播感染后易轉(zhuǎn)變?yōu)槁愿窝谆虬l(fā)展為肝硬化、肝癌呈全球性分布，約1%普通人群感染抗HCVIgM和抗HCVIgGHCV抗體不是保護性抗體，是存在HCV感染的標志。1抗HCVIgM在發(fā)病后即可檢測到，一般持續(xù)1～3個月。2如果抗HCVIgM持續(xù)陽性，提示病毒持續(xù)復(fù)制，易轉(zhuǎn)為慢性。3低滴度抗HCVIgG提示病毒處于靜止狀態(tài)，高滴度提示病毒復(fù)制活躍。4HCV抗原檢測的困難HCV在血液中含量極低，僅為HBV的1%HCV病毒顆粒很難有效地分離純化、人工合成抗原丙型肝炎的窗口期很長，血清學(xué)檢測無法早期診斷抗體持續(xù)性存在，無法提示正確的病毒載量HCV的型別復(fù)雜，高突變率HCV核心抗原檢測試劑盒敏感性差：45.68%HCVRNA陽性是病毒感染和復(fù)制的直接標志。HCVRNA的定量測定有助于了解病毒復(fù)制程度、抗病毒治療的選擇及療效評估等。HCVRNA早期診斷：在免疫學(xué)檢測的“窗口期”或一部分不產(chǎn)生抗體的丙肝病毒攜帶者，都可出現(xiàn)HCVRNA陽性，抗HCV陰性的檢測結(jié)果。彌補ELISA方法的高漏檢率,HCVRNA可作為HCV感染診斷的指標。HCVRNA定量可指導(dǎo)用藥，為療效觀察及預(yù)后判斷提供客觀指標?？笻CV不能作為抗病毒療效的指標。慢性丙型肝炎長期抗HCV陽性，這只表示曾經(jīng)感染了丙肝病毒并出現(xiàn)了相應(yīng)的免疫應(yīng)答，并不代表體內(nèi)仍有丙肝病毒的存在或復(fù)制，這時只能通過HCVRNA定量檢測鑒別丙肝病毒的活動性和復(fù)制程度。HCV主要通過輸血和血制品傳播，對獻血員及血制品進行檢測，以減少醫(yī)源性丙型肝炎的發(fā)生和傳播。單擊此處添加大標題內(nèi)容HCVRNA熒光定量PCR檢測的臨床意義核酸檢測在HCV感染的診斷中要比HBV感染的診斷重要得多！性病相關(guān)病原體的檢測性病在我國已成為一個重要的公共衛(wèi)生問題，自99年以來，性病的發(fā)生率居高不下，其發(fā)病率在傳染性疾病中位居第3位，03年我國累計報道性病病例數(shù)（HIV除外）73萬。浙江省為高發(fā)區(qū)，位居全國第三。常見性傳播疾病病原體添加標題添加標題添加標題添加標題添加標題人類免疫缺陷病毒(HIV)人類乳頭瘤病毒(HPV)解脲支原體(UU)沙眼衣原體(CT)淋病雙球菌(NG)淋病雙球菌的傳統(tǒng)檢測方法321涂片染色：對于女性患者檢出率低，易出現(xiàn)假陰性單擊此處添加小標題ELISA抗原檢測法：存在交叉反應(yīng)，非特異反應(yīng)較嚴重單擊此處添加小標題分離培養(yǎng)：培養(yǎng)較困難，生化鑒定復(fù)雜，時間長單擊此處添加小標題熒光定量PCR檢測NG的優(yōu)勢可在短時間內(nèi)快速、準確地直接從臨床各種標本中檢出含量極低的病原菌對女性疑似淋球菌引起的各種炎癥的診斷及鑒別診斷起決定性作用對癥狀輕者或無癥狀的淋球菌感染者做到早期診斷和鑒別診斷可用于療效考核沙眼衣原體沙眼衣原體感染與致病近年來在歐美等國，沙眼衣原體的感染率和危害性已超過淋球菌在我國，在非淋球菌性尿道炎中居首位泌尿生殖道感染，妨礙妊娠盆腔感染，可致生殖能力損害“窗口期”檢測不出不能判定是現(xiàn)癥感染還是既往感染傳統(tǒng)方法檢測沙眼衣原體的缺陷logo熒光定量PCR檢測衣原體的優(yōu)勢靈敏度98%以上、特異性100%提高陽性檢出率適用于感染的早期診斷和無癥狀攜帶者的檢查解脲支原體傳統(tǒng)方法檢測解脲支原體的缺陷UU難以分離，需特殊培養(yǎng)基培養(yǎng)，操作費時，需1-3天才能得到初步結(jié)果。血清學(xué)檢查，僅10%UU尿道炎患者在病程中特異性抗體滴度升高4倍，使其方法學(xué)應(yīng)用受限。一些非致病的脲原體或培養(yǎng)過程中的污染都可能導(dǎo)致假陽性的結(jié)果。熒光定量PCR檢測支原體的優(yōu)勢具有高度的敏感性和特異性，提高陽性檢出率快速、定量準確，可以為臨床評價療效提供依據(jù)CT、UU是美國FDA批準的PCR檢測試劑盒，作為首選方法，在臨床推廣應(yīng)用人類乳頭瘤病毒有100多個型只能感染人的皮膚和黏膜上皮細胞，人是HPV的惟一宿主免疫原性低，易形成持續(xù)性感染新生兒產(chǎn)道感染HPV宮頸癌傳統(tǒng)方法檢測HPV的缺陷傳統(tǒng)巴氏涂片漏診率可達30%從細胞學(xué)水平來觀察細胞的形態(tài)學(xué)改變，其中80%的患者確診時已是宮頸癌晚期熒光定量PCR檢測HPV的優(yōu)勢早期感染的病原檢測可對HPV進行分型可以評估病毒載量與患癌癥風(fēng)險可以考核療效與預(yù)后用于HPV感染與生殖器腫瘤相關(guān)性的研究是引起艾滋病的病原體人類免疫缺陷病毒熒光定量PCR檢測HIV可判定無癥狀且血清陰性患者潛在的HIV傳播性檢測長潛伏期的HIV攜帶者使“窗口期”縮短10天在治療過程中觀察患者血清HIV載量的變化預(yù)示病情的轉(zhuǎn)歸和指