第六講 高效液相色譜法在農藥殘留分析檢測中的應用

第六講

高效液相色譜法在農藥殘留分析檢測中的應用本講內容6.1基本原理、特點和分類6.2高效液相色譜儀6.3色譜條件的選擇6.4HPLC在農藥殘留分析中的應用舉例農藥殘留分析大都采用氣相色譜配以選擇性檢測器,但現(xiàn)在使用的農藥極性更強、揮發(fā)性更低，對它們以及對那些熱不穩(wěn)定的農藥氣相色譜就無能為力,這樣液相色譜就成為農藥殘留檢測領域中的又一主要技術。高效液相色譜法（HPLC）是20世紀60年代末70年代初發(fā)展起來的一種新型分離分析技術，隨著不斷改進與發(fā)展，目前已成為應用極為廣泛的化學分離分析的重要手段。它是在經(jīng)典液相色譜基礎上，引入了氣相色譜的理論，在技術上采用了高壓泵、高效鍵合固定相和高靈敏度檢測器，因而具備分析速度快、分離效率高、操作自動化的特點。6.1

基本原理、特點和分類基本原理特點

分離效能高選擇性高檢測靈敏度高分析速度快分類

吸附色譜分配色譜離子色譜體積排阻色譜

高效液相色譜分離模式6.2高效液相色譜儀6.2.1

高效液相色譜儀流程

高效液相色譜儀一般可分為5個主要部分：高壓輸液系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)、計算機控制及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。此外還配有輔助裝置：如梯度淋洗，自動進樣及數(shù)據(jù)處理等。其工作過程如下：首先高壓泵將貯液器中流動相溶劑經(jīng)過進樣器送入色譜柱，然后從控制器的出口流出。當注入欲分離的樣品時，流經(jīng)進樣器貯液器的流動相將樣品同時帶入色譜柱進行分離，然后依先后順序進入檢測器，記錄儀將檢測器送出的信號記錄下來，由此得到液相色譜圖。

1-貯液器2–攪拌、超聲脫氣器3–梯度洗脫裝置4–高壓輸液泵5–流動相流量顯示6–柱前壓力表7–輸液泵泵頭8–過濾器9–阻尼器10–六通進樣閥11–色譜柱12–檢測器13–記錄儀(或數(shù)據(jù)處理裝置)14–回收廢液罐高效液相色譜儀流程示意圖由于高效液相色譜所用固定相顆粒極細，因此對流動相阻力很大，為使流動相較快流動，必須配備有高壓輸液系統(tǒng)。它是高效液相色譜儀最重要的部件，一般由儲液器及脫氣裝置、高壓輸液泵、梯度洗脫裝置、過濾器、壓力脈動阻力器等組成，其中高壓輸液泵是核心部件。對于一個好的高壓輸液泵應符合密封性好，輸出流量恒定，壓力平穩(wěn)，可調范圍寬，便于迅速更換溶劑及耐腐蝕等要求。常用的輸液泵分為恒流泵和恒壓泵兩種。恒流泵特點是在一定操作條件下，輸出流量保持恒定而與色譜柱引起阻力變化無關；恒壓泵是指能保持輸出壓力恒定，但其流量則隨色譜系統(tǒng)阻力而變化，故保留時間的重現(xiàn)性差，它們各有優(yōu)缺點。6.2.2高壓輸液系統(tǒng)6.2.2.1貯液器

耐腐蝕，可為玻璃、聚醚醚酮（PEEK）材料。0.5~2L，入罐前過濾。6.2.2.2流動相流動相是影響分離的一個重要調節(jié)因素。一種理想的液相色譜流動相溶劑應具有低粘度，檢測器兼容性好，樣品容易回收和低毒等特性。正相高效液相色譜法流動相常以己烷做基礎溶劑。當洗脫極性較強的組分時，通常用二氯甲烷、四氫呋喃來調節(jié)極性。反相高效液相色譜法采用的流動相多為甲醇、乙腈配合水。一般情況下甲醇–水體系能夠滿足多數(shù)樣品的分離要求。流動相選擇注意事項：純度：采用“HPLC”級溶劑避免使用會引起柱效損失或保留特性變化的溶劑對試樣有適宜的溶解度溶劑粘度要小與檢測器相匹配流動相前處理過濾：采用0.45

m或0.22

m濾膜

目的：除去溶劑中的微小顆粒，避免堵塞色譜柱，尤其是使用無機鹽配制的緩沖液。脫氣

目的：除去流動相中溶解或因混合（例如甲醇和水）而產(chǎn)生的氣泡方法：◎超聲波振蕩+抽真空：5min+5min

◎吹氦氣法（鼓泡法）：氦氣在流動相中的溶解度比空氣低，可以將溶解的氣體驅逐出去。脫氣效果好，但成本高。在0.5MPa的壓力下，先以100ml/min，鼓泡15min，然后以20ml/min保持著?！?/p>

在線脫氣器:膜過濾器。溶解在流動相中的氣體可以從膜中被真空脫出，而液體不會從膜中出來。脫氣效果最好。濾膜水

水是反相高效液相色譜法最重要的溶劑，它也是最難純化和保持其特性的流動相之一。水的純度至關重要，特別是在痕量分析?？勺灾苹驈某兯苽鋬x上獲得。超純水制備儀純水制備儀乙腈

這是反相高效液相色譜常用的溶劑，實驗室常用的只能滿足紫外檢測器的需要。這樣的試劑很難符合熒光和電化學檢測器的要求。甲醇

反相高效液相色譜常用的溶劑之一，其雜質主要是水。市面上能夠買到紫外光譜純的商品，但它的主要問題也是有些特性滿足不了熒光和電化學檢測分析。氯代烴類溶劑在正相高效液相色譜中常用的二氯甲烷等氯代烴類溶劑中，添加穩(wěn)定劑甲醇或乙醇。乙醇能夠提高流動相的極性，縮短正相高效液相色譜分析中各組分的保留時間。各批次之間濃度的變化也許會影響重復性。6.2.2.3

輸液泵要求：◎泵體耐化學腐蝕。使用優(yōu)質耐酸不銹鋼（Cr18Ni2Mo2）◎能在高壓下連續(xù)工作。40~50MPa?！蜉敵隽髁糠秶鷮??！蜉敵隽髁糠€(wěn)定，重復性高。Waters600系列泵600系列泵是自帶微機控制的色譜泵四元梯度、流速范圍寬，大屏幕顯示，鍵盤操作MPa(兆帕)(N/m2)PSI(磅/英寸2)(b/in2)標準大氣壓（atm）毫米汞柱(托Torr)(0℃,mmHg)巴(bar)公斤力/厘米3(kgf/cm3)1145.0389.8697500.621010.197常用壓力單位換算表

控制方式：

恒流控制:恒流泵有注射型泵和往復泵，后者廣泛采用。優(yōu)點：組分保留時間重現(xiàn)性好。

缺點：壓力有脈動；柱塞直接與流動相接觸；長期運載，單向閥易堵塞。恒壓控制：恒壓泵。6.2.2.4

梯度洗脫裝置所謂的梯度洗脫，就是將兩種或兩種以上的不同極性的溶劑進行混合，作為流動相使用。在進樣過程中，連續(xù)不斷地按預先擬定的程序改變流動相的濃度和極性。由于流動相極性發(fā)生變化，使得選擇性得以改善，從而提高了分辨能力，縮短了分離時間。常用的梯度洗脫有低壓洗脫、高壓洗脫。高壓梯度裝置是用高壓泵分別將兩種或三種不同極性的溶劑輸入混合器，充分混合后進入色譜柱。多元低壓梯度洗脫只需要一個高壓泵，而多元高壓梯度洗脫就需要多個高壓泵。低壓梯度和高壓梯度洗脫裝置示意圖低壓梯度洗脫高壓梯度洗脫典型的高壓梯度洗脫程序

6.2.3進樣系統(tǒng)

高效液相色譜柱比氣相色譜柱短得多（約5～30cm），所以柱外展寬（又稱柱外效應）較突出。柱外展寬是指色譜柱外的因素所引起的峰展寬，主要包括進樣系統(tǒng)、連接管道及檢測器中存在死體積。柱外展寬可分柱前和柱后展寬。進樣系統(tǒng)是引起往前展寬的主要因素，因此高效液相色譜法中對進樣技術要求較嚴。

6.2.3.1

進樣器自動進樣器手動進樣器定量管（10

L，20

L，50

L，100

L）原理：（六通閥）注入方式：

1）全量注入

2）部分注入

進樣廢液樣品

淋洗液至分離柱進樣閥樣品裝樣廢液

淋洗液至分離柱

定量管（環(huán)）進樣演示（ＬＯＡＤ）（ＩＮＪＥＣＴ）樣品環(huán)Rheodyne7125i六通進樣閥自動進樣器

可以用全自動或半自動的方式進多個樣品一般的設計用Rheodyne閥，氣閥驅動

Waters的717+的設計特點全電子設計，精度極好、可靠性高，最多96個樣品多方法編程，自動標樣程序，優(yōu)先樣品等模式可單獨操作也可外部控制(IEEE)樣品的冷卻及加熱-選件U6K設計，交叉污染小、進樣范

圍寬大屏幕LCD顯示，容易使用6.2.4分離系統(tǒng)

色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管與固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內襯為光滑的聚合材料的其他金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。一般色譜柱長5~30cm，內徑為4～5mm，凝膠色譜柱內徑3～12mm，制備柱內徑較大，可達25mm

以上。一般在分離前備有一個前置柱，前置柱內填充物和分離柱完全一樣，這樣可使淋洗溶劑由于經(jīng)過前置柱為其中的固定相飽和，使它在流過分離柱時不再洗脫其中固定相，保證分離柱的性能不受影響。

柱子裝填得好壞對柱效影響很大。對于細粒度的填料（＜20μm）一般采用勻漿填充法裝柱，先將填料調成勻漿，然后在高壓泵作用下，快速將其壓入裝有洗脫液的色譜柱內，經(jīng)沖洗后，即可備用。

6.2.4.1

柱箱分析結果重現(xiàn)性好提高柱效降低柱壓保證檢測穩(wěn)定性

柱溫控制的優(yōu)點：6.2.4.2

色譜柱化學鍵合固定相1酯化鍵合（Si-O-R型），適用于正相色譜柱2硅烷化鍵合（Si-O-Si-R型）,適用于反相色譜柱液相色譜填料顆粒技術的沿革保護柱新型的保護柱—SentryGuard各種高效液相色譜柱1–柱管2–壓帽3,6–卡套4–篩板5–接口7–螺絲8–輸液管柱結構示意圖1）柱壓低于15MPa2）柱溫在40℃左右，最高使用溫度為50℃3）緩沖液pH使用范圍為2～7ODS柱的使用注意點：*硅膠在pH為3～4時穩(wěn)定性最好*堿濃度越低，流動相含水量越低，硅膠越穩(wěn)定。分離類型填料規(guī)格（柱長/內徑，mm）正相柱HypersilCN(CPS-1),5

m250×4.6HypersilNH2(APS-1),5

m250×4.6ZorbaxNH2,5

m250×4.6反相柱HypersilODS-2(C18),5

m250×4.6HypersilC18–BDS,3

m150×4.6LichrospherC18,5

m250×4.6XTerra

RP

18，5

m250×3.9XTerra

MSC18，2.5

m150×3.0常見的商品牌號液相色譜柱

ODS柱與C18柱的區(qū)別一般認為C18是連接了十八烷基碳鏈的反相固定相的總稱。除了硅膠基質外，還可以包括其他基質的填料，比如高聚物小球為基質，氧化鋁為基質，氧化鋯為基質等鍵合C18鏈形成的反相固定相。而ODS是以硅膠為基質鍵合的C18填料。由于大部分的C18柱是硅膠基質，因此，在很多場合內二者混為一體。RP柱，BDS柱，MS柱

RP柱：在100％的水相條件下對極性化合物有極高保留的C18柱。適用于分離超高極性化合物。在100％水做流動相時可保持穩(wěn)定。BDS柱：BaseDeactivedSilica，堿鈍化硅膠柱。特別適合于強極性含氮的堿性化合物分離。MS柱：超低流失，適用于液質分析用。1）柱壓低于15MPa2）柱溫在40℃左右，最高使用溫度為50℃3）緩沖液pH使用范圍為2～7ODS柱的使用注意事項：*硅膠在pH為3～4時穩(wěn)定性最好*堿濃度越低，流動相含水量越低，硅膠越穩(wěn)定。柱床損壞及處理6.2.5檢測系統(tǒng)

在液相色譜中，按檢測的對象分為溶質性質檢測器，它僅對被分離組分的物理或化學特性有響應，如紫外、熒光、電化學檢測器等；總體檢測器，它對試樣和洗脫液總的物理或化學性質有響應，如示差折光，電導檢測器等。按適用性分類分為選擇性檢測器，它只能選擇性的檢測某些物質，如紫外、熒光、電導；通用型檢測器，它對大多數(shù)物質的響應相差不大幾乎適用于所有物質，現(xiàn)將常用的檢測器介紹如下:6.2.5.1

檢測器的種類

在農藥殘留分析上應用的檢測器主要有：◎

紫外檢測器（包括二極管陣列檢測器）◎

熒光檢測器

◎

電化學檢測器◎

蒸發(fā)光散射檢測器規(guī)

格UVFLDEChELSD類型專用專用通用通用梯度洗脫能能不能能線性范圍104105105106最小檢出量(g)10-1110-1410-810-9對流速敏感性無無有無對溫度敏感性低低2%，℃低信號單位吸光度，A熒光度電導率

s/cm光散射液相色譜檢測器性能一覽表

6.2.5.3

紫外檢測器原理：基于被分析組分對特定波長紫外光的選擇性吸收定量基礎：比耳定律，A＝KCL優(yōu)點：1）對溫度和流速不敏感

2）可用于梯度洗提缺點：僅適用于測定有紫外吸收的物質紫外檢測器的溶劑影響不同種類溶劑有其截止波長溶劑的質量好壞對其截止波長有影響為何溶劑質量不好?含紫外吸收的雜質溶解在其中的氧氣緩沖液溶質的紫外吸收二十一世紀標準紫外檢測器二極管陣列檢測器的優(yōu)點：1）采集三維譜圖2）峰純度檢驗3）光譜庫檢索4）可以發(fā)現(xiàn)單波長檢測時未測到的峰二極管陣列檢測器工作原理許多化合物有光致發(fā)光現(xiàn)象，熒光屬于其中的一種?；衔锸艿饺肷涔獾恼丈浜?，吸收輻射能，發(fā)出比吸收波長長的特征輻射，當入射光停止照射時，特征輻射也很快消失，這種輻射光線就是熒光。熒光產(chǎn)生的實質是原子中電子由最低振動能級下降到基態(tài)中的某些不同能級的能量釋放。被化合物吸收的光稱為激發(fā)光，產(chǎn)生的熒光稱為發(fā)射光。熒光的波長總要比分子吸收的紫外光波長長，這種光一般是可見光。對于稀溶液，熒光強度與熒光物質溶液濃度、摩爾吸光系數(shù)、吸收池厚度、入射光強度、熒光量子效率及熒光收集效率等成正相關，在相對條件下，物質的熒光強度與該物質溶液濃度成正比，這是熒光檢測器的定量依據(jù)。6.2.5.4熒光檢測器結構一臺熒光檢測器包括以下基本部件：激發(fā)光源；選擇激發(fā)波長用的單色器；流通池；選擇發(fā)射波長用的單色器及用于檢測發(fā)光強度的光電檢測器。由氙燈光源發(fā)出的光，經(jīng)激發(fā)光單色器后，得到所需要的激發(fā)光波長。激發(fā)光通過樣品流通池，一部分光線被熒光物質吸收。熒光物質激發(fā)后，向四面八方發(fā)射熒光。為消除入射光與散射光的影響，一般要取與激發(fā)光成直角的方向測量熒光。近年來，還出現(xiàn)一種激光誘導熒光檢測器，其主要區(qū)別是光源采用了激光器。熒光檢測器示意圖工作原理電化學檢測器是根據(jù)電化學原理和物質的電化學性質進行檢測的。在液相色譜中對那些沒有紫外吸收或不能發(fā)出熒光但具有電活性的化合物，可采用電化學檢測法。電化學檢測器在痕量分析上主要有安培檢測器和電導檢測器。前者是以測量電解電流的大小為基礎，后者則以測量液體的電阻變化為根據(jù)。6.2.5.5電化學檢測器6.2.5.5.1安培檢測器電化學檢測器中應用最廣泛的一種檢測器。它要求在電解池中發(fā)生電解反應，即在外加電壓的作用下，利用待測物質在電極表面上發(fā)生氧化還原反應引起電流的變化而進行測定的一種方法。工作電極是安培檢測器的心臟，通常用玻璃碳材料制成，參比電極一般為Ag/AgCl電極，輔助電極為不銹鋼或金、白金材料。三電極安培檢測器示意圖6.2.5.5.2電導檢測器

CD與安培檢測器不同，電導檢測池內沒有電化學反應發(fā)生，樣品的濃度是通過測量溶液中離子的電導變化獲得的。電導檢測器主要是用于離子分析。該檢測器在實際使用中對水、淋洗液有較嚴格的要求，離子分析時一般整個流路系統(tǒng)都用PEEK材料，避免不銹鋼材料對淋洗液產(chǎn)生影響或淋洗液對不銹鋼材料的腐蝕。電導池在使用前后發(fā)現(xiàn)有污染時，可用1:1硝酸溶液處理數(shù)分鐘，以消除污染。在分析過程中，要注意溫度對電導率的影響，一般每升高1℃，電導率會增加(2~2.5)%。1-流動相入口2-連接螺母3，6-硅橡膠密封

4-鉑電極5-有機玻璃7-電極導線

電導檢測器示意圖6.2.5.6蒸發(fā)光散射檢測器1985年世界上第一臺蒸發(fā)光散射檢測器問世，它標志著高效液相色譜儀通用型質量檢測器的誕生。

工作原理當一束光線通過一間充滿煙霧的房間就會發(fā)生光散射現(xiàn)象。在一定的角度測得的光散射強度與煙霧粒子大小和數(shù)量成正比，這就是ELSD定量分析的原理。原理上講它可以檢測揮發(fā)性低于流動相的所有化合物。經(jīng)色譜柱分離的組分隨流動相進入霧化器中，利用高速氣流噴成一薄霧，霧化為微小液滴的流動相進入加熱的蒸發(fā)器(漂移管)蒸發(fā)，不揮發(fā)的目標化合物微?；筮M入光路發(fā)生光散射，散射光被光電倍增管捕獲檢測。

ELSD檢測器結構示意圖霧化部分蒸發(fā)部分檢測部分ELSD在農藥殘留分析中的應用

目前的靈敏度難以滿足要求。報道極少。6.2.6計算機控制系統(tǒng)及數(shù)據(jù)處理

高效液相色譜數(shù)據(jù)處理單元：島津CLASS－VP色譜工作站EmpowerPro中文版色譜工作站6.3色譜條件的選擇高效液相色譜法操作條件的選擇應遵循色譜理論，主要包括兩個方面的問題，即色譜柱效率和溶劑效率。柱效率是指溶質通過色譜柱之后峰的寬度增加了多少，它與溶質在兩相中的擴散及傳質情況有關，這就是所謂的色譜動力學過程；溶劑效率是與兩個物質和固定相、流動相的分子間作用力不同有關，這就是所謂的熱力學過程。要提高柱效率，就得改善色譜柱性能和操作條件；要提高溶劑效率，就得提高固定相的選擇性。6.3.1固定液碳鏈長短對分離的影響采用反相鍵合相C1、C8、C18對以下6種化合物進行分離?？梢钥闯觯S著碳鏈增加，保留時間明顯增加，分離度明顯提高。(色譜條件：IBM柱200×4.5mm；流動相：

Ψ（CH3OH∶H2O）=50∶50；流速：1.0mL/min；檢測波長：254nm。)1-尿嘧啶2-苯酚3-乙酰苯4-硝基苯5-苯甲酸甲酯6-甲苯反相液相色譜固定液碳鏈長度對分離的影響6.3.2對異構體的分離氯氰菊酯有8種同分異構體，如果采用一根柱子無法將其全部異構體分開。若再與一根手性柱串聯(lián)使用，就可以分開全部異構體，見下圖。(色譜條件：左圖Chirex3019(Phenomenex)柱，250×4.0mm；右圖Chirex3019柱+Chirex3020(Phenomenex)柱；流動相：Ψ（己烷∶二氯甲烷∶乙醇）=500∶10∶0.05，流速：1.0mL/min；檢測波長：230nm。)氯氰菊酯8種同分異構體的分離1-對氨基苯磺酸

2-磺胺甲基嘧啶

3-磺胺異惡唑

4-磺胺嘧啶pH值對反相色譜法分離的影響4種磺胺藥物在pH1.25~10范圍內的分離。在pH1.25~3.0時磺胺異惡唑不穩(wěn)定，沒有流出。pH5.0~7.0流出就發(fā)生了。pH9.0有很好的分離，pH10.0分離很差。(色譜條件：ODS柱150×4.6mm，5

m；流動相：Ψ（20mMKH2PO4∶CH3CN）=95∶5，流速：1.0mL/min；檢測波長：270nm。)3.5.3pH值對分