5-分子生物學研究方法1

第五章分子生物學研究法（上）——DNA、RNA及蛋白質(zhì)操作技術(shù)分子生物學研究之所以從20世紀中葉開始得到高速發(fā)展，其中最主要的原因就是現(xiàn)代分子生物學研究方法、特別是基因操作和基因工程技術(shù)的進步。DNA分子的切割與連接核酸分子雜交凝膠電泳細胞轉(zhuǎn)化核酸序列分析基因的人工合成基因操作基因的定點突變PCR擴增等核心技術(shù)基因工程是指在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)粒或其它載體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，使之進入原先沒有這類分子的寄主細胞內(nèi)并進行持續(xù)穩(wěn)定的繁殖和表達?；蚬こ碳夹g(shù)是核酸操作技術(shù)的一部分，只不過它強調(diào)了外源核酸分子在另一種不同的寄主細胞中的繁衍與性狀表達。事實上，這種跨越物種屏障、把來自其它生物的基因置于新的寄主生物細胞之中的能力，是基因工程技術(shù)區(qū)別于其它技術(shù)的根本特征。第五章分子生物學研究法（上）內(nèi)容：重組DNA技術(shù)回顧DNA基本操作技術(shù)RNA基本操作技術(shù)基因克隆技術(shù)蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學技術(shù)重組DNA技術(shù)史話第一節(jié)重組DNA技術(shù)回顧三大成就40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題；50年代提示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復制機制，解決了基因的自我復制和世代交替問題；50年代末至60年代，相繼提出了“中心法則”和操縱子學說，成功地破譯了遺傳密碼，充分認識了遺傳信息的流動和表達。但是，如果沒有分離和富集單一DNA分子的技術(shù)，科學家就無法對這類物質(zhì)進行直接的生化分析。

限制性核酸內(nèi)切酶切割DNADNA連接酶生成3′-5′磷酸二酯鍵DNA聚合酶Ⅰ探針標記、補平3′末端反轉(zhuǎn)錄酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5′磷酸化、探針標記末端轉(zhuǎn)移酶3′末端多聚尾堿性磷酸酶3′切除末端磷酸基DNA外切酶Ⅲ3′末端切除單核苷酸λ噬菌體DNA外切酶5′末端切除單核苷酸重組DNA實驗中常見的主要工具酶1、常用的工具酶是一類能識別雙鏈DNA分子特異性核酸序列的DNA水解酶。（1）限制性核酸內(nèi)切酶“分子剪刀”按限制酶的組成、與修飾酶活性關(guān)系以及切斷核酸的情況不同，分為三類：

Ⅰ型

Ⅱ型*

Ⅲ型限制性核酸內(nèi)切酶的類型及特性能識別專一的核苷酸順序，并在識別點附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的雙鏈，但是切割的核苷酸順序沒有專一性，是隨機的。這類限制性內(nèi)切酶在DNA重組技術(shù)或基因工程中用處不大，無法用于分析DNA結(jié)構(gòu)或克隆基因。這類酶如EcoB、EcoK等。第一類（I型）限制性內(nèi)切酶能識別專一的核苷酸順序，并在該順序內(nèi)的固定位置上切割雙鏈。由于這類限制性內(nèi)切酶的識別和切割的核苷酸都是專一的。因此，這種限制性內(nèi)切酶是DNA重組技術(shù)中最常用的工具酶之一。這種酶識別的專一核苷酸順序最常見的是4個或6個核苷酸，少數(shù)也有識別5個核苷酸以及7個、8個、9個、10個和11個核苷酸的。II型限制性內(nèi)切酶的識別順序是一個回文對稱順序，即有一個中心對稱軸，從這個軸朝二個方向“讀”都完全相同。這種酶的切割可以有兩種方式：第二類(II型)限制性內(nèi)切酶粘性末端；是交錯切割，結(jié)果形成兩條單鏈末端，這種末端的核苷酸順序是互補的，可形成氫鍵，所以稱為粘性末端。如EcoRI的識別順序為：

5’……G’AA|TT_C……3’3’……C_TT|AA’G……5’垂直線表示中心對稱軸，從兩側(cè)“讀”核苷酸順序都是GAATTC或CTTAAG，這就是回文順序（palindrome）。_和‘表示在雙鏈上交錯切割的位置，切割后生成5’……G和AATTC……3’、3’……CTTAA和G……5’二個DNA片段，各有一個單鏈末端，二條單鏈是互補的，其斷裂的磷酸二酯鍵以及氫鍵可通過DNA連接酶的作用而“粘合”。

II型酶切割方式的另一種是在同一位置上切割雙鏈，產(chǎn)生平頭末端。例如EcoRV

的識別位置是：5’……GAT’|ATC……3’3’……CTA’|TAG……5’

切割后形成5’……GAT和ATC……3’、3’……CTA和TAG……5’。這種末端同樣可以通過DNA連接酶連接起來。平頭末端：也有專一的識別順序，但不是對稱的回文順序,在識別順序旁邊幾個核苷酸對的固定位置上切割雙鏈。但這幾個核苷酸對不是特異性的。因此，這種限制性內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的一定長度DNA片段，具有各種單鏈末端。因此不能應用于基因克隆。第三類（III型）限制性內(nèi)切酶

DNA連接酶能把不同的DNA片段連接成一個整體。a.DNA的粘性末端；b.DNA的平末端；c.化學合成的具有EcoRI粘性末端的DNA片段。（2）DNA連接酶僅僅能在體外利用限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶進行DNA的切割和重組遠不能滿足基因研究的需要。DNA片段在體外不具備自我復制能力，要想得到足夠量和足夠純度的DNA，必須將它們連接到具備自主復制能力的DNA分子上（載體上），并轉(zhuǎn)入寄主細胞中進行繁殖。這就是基因克隆，或分子克隆。2、重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體（1）pSC101質(zhì)粒載體pSC101是一種嚴緊型復制控制的低拷貝數(shù)的大腸桿菌質(zhì)粒載體，平均每個寄主細胞僅有1～2個拷貝。其分子大小為9.09kb，編碼有一個四環(huán)素抗性基因（tetr）。它被選為第一個真核基因的克隆載體。缺點：它是一種嚴緊型復制控制的低拷貝質(zhì)粒，從帶有該質(zhì)粒的寄主細胞中提取pSC101DNA，其產(chǎn)量就要比其它質(zhì)粒載體低得多。（2）ColE1質(zhì)粒載體ColE1質(zhì)粒屬于松弛型復制控制的多拷貝質(zhì)粒。在正常生長條件下，當培養(yǎng)基中用于蛋白質(zhì)合成的氨基酸被耗盡，或是在對數(shù)生長末期的細胞培養(yǎng)物中加入氯霉素以抑制蛋白質(zhì)的合成，寄主染色體DNA的復制便被抑制，細胞的生長也隨之停止。此時，松弛型復制控制的質(zhì)粒DNA仍然可以繼續(xù)進行復制達數(shù)小時之久，使每個寄主細胞中所累積的ColE1質(zhì)?？截悢?shù)增加到1000~3000個之多，質(zhì)粒DNA大約可占細胞總DNA的50%左右。由此可見，由于質(zhì)?？截悢?shù)高，插入的外源DNA片段的產(chǎn)量也就得到相應的提高。

（3）pBR322質(zhì)粒載體為改進轉(zhuǎn)化子篩選技術(shù)，有必要用人工的方法構(gòu)建一種既帶有多種抗藥性的強選擇記號、又具有低分子量、高拷貝、以及外源DNA插入不影響復制功能的多種限制性核酸內(nèi)切酶單切割位點等優(yōu)點的新的質(zhì)粒載體。pBR322質(zhì)粒是由三個不同來源的部分組成的：第一部分來源于pSF2124質(zhì)粒轉(zhuǎn)座子Tn3的氨芐青霉素抗性基因（ampr）；第二部分來源于pSC101質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基因（tertr）；第三部分則來源于ColE1的派生質(zhì)粒pMB1的DNA復制起點（ori）。123第一個優(yōu)點：具有較小的分子量，其長度為4,363bp。由于分子量小，不僅易于純化，而且即使攜帶上一段6-8kb的外源DNA片段，操作起來仍較為便利。第二個優(yōu)點：具有兩種抗生素抗性基因以用作轉(zhuǎn)化子的選擇記號。質(zhì)粒DNA編碼的抗生素抗性基因的插入失活效應，是檢測重組體質(zhì)粒的一種十分有用的方法。第三個優(yōu)點：具較高的拷貝數(shù)，若經(jīng)過氯霉素擴增，每個細胞中可累積1000~3000個拷貝，為重組體DNA的制備提供了極大的方便。pBR322質(zhì)粒載體的優(yōu)點EcoRIAmpR.Tet.RpBR322EcoRITet.RTetracyclineEcoRIReplicaplatingprocessAddAmp.ThecellswewantCell抗生素抗性基因篩選法（4）

pUC質(zhì)粒載體pUC系列質(zhì)粒載體包括如下四個部分：(i)來自pBR322質(zhì)粒的復制起點（ori）；(ii)氨芐青霉素抗性基因（ampr），但它的核苷酸序列已經(jīng)發(fā)生了變化，不再含有原來的限制性核酸內(nèi)切酶的單識別位點；(iii)大腸桿菌β-半乳糖酶基因（lacZ）的啟動子及其編碼α-肽鏈的DNA序列，此結(jié)構(gòu)特稱為lacZ‘基因；(iv)位于lacZ'基因中的靠近5'-端的一段多克隆位點（MCS）區(qū)段，外源基因插入后破壞了lacZ’基因的功能。

第一，更小的分子量和更高的拷貝數(shù)。在pBR322基礎(chǔ)上構(gòu)建pUC質(zhì)粒載體時，僅保留下其中的氨芐青霉素抗性基因及復制起點，使其分子縮小了許多，如pUC8為2750bp，pUC18為2686bp。同時，由于rop基因缺失，使pUC8質(zhì)粒的拷貝數(shù)比帶有pMB1或ColE1復制起點的質(zhì)粒載體都要高得多，不經(jīng)氯霉素擴增，平均每個細胞即可達500~700個拷貝。

第二，可用組織化學方法檢測重組體。pUC8質(zhì)粒結(jié)構(gòu)中具有來自大腸桿菌lac操縱子的lacZ'基因，所編碼的α-肽鏈可參與α-互補作用。因此，可用X-gal顯色法實現(xiàn)對重組體轉(zhuǎn)化子的鑒定。

第三，具有多克隆位點MCS區(qū)段，可以把具兩種不同粘性末端（如EcoRI和BamHI）的外源DNA片段直接克隆到pUC18質(zhì)粒載體上。pUC質(zhì)粒載體優(yōu)點：pBluescript是專用的商品名稱，系指由Stratagene公司發(fā)展的一類從pUC載體派生而來的噬菌粒載體，簡稱為pBS（+/-），如今則更多地叫作pBluescriptKS（+/-）或pBluescriptSK（+/-）。

SK表示多克隆位點區(qū)的一種取向，即lacZ基因是按照SacI→KpnI的方向轉(zhuǎn)錄；（+/-）表示單鏈噬菌體f1復制起點的兩種相反的取向。f1（+）起點表示當pBluescript噬菌粒載體和輔助噬菌體共感染寄主細胞時，能夠回收到lacZ基因的有意義鏈DNA；而f1（-）起點則表示當pBluesript噬菌粒載體與輔助噬菌體共感染寄主細胞時，可回收到lacZ基因的無意義鏈DNA。（5）pBluescript噬菌粒載體(i)

在多克隆位點區(qū)（MCS）的兩側(cè)，存在一對T3和T7噬菌體的啟動子，用以定向指導插入在多克隆位點上的外源基因的轉(zhuǎn)錄活動；(ii)

同時具有一個單鏈噬菌體M13或f1的復制起點和一個來自ColE1質(zhì)粒的復制起點，保證pBluescript噬菌粒載體在有或無輔助噬菌體共感染的不同情況下，按照不同的復制形式分別合成出單鏈或雙鏈DNA；(iii)

編碼有一個氨芐青霉素抗性基因，作為轉(zhuǎn)化子克隆的選擇標記；(iv)

含有一個lacZ基因，可以按照X-gal-IPTG組織化學顯色法篩選噬菌粒載體的重組子。1.從生物有機體基因組中，分離出帶有目的基因的DNA片段。2.將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復制的并具有選擇記號的載體分子上，形成重組DNA分子。3.將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當?shù)氖荏w細胞（亦稱寄主細胞）并與之一起增殖。4.從大量的細胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細胞，并篩選出已經(jīng)得到擴增的目的基因。3、重組DNA操作的過程P1725.將目的基因克隆到表達載體上，導入寄主細胞，使之在新的遺傳背景下實現(xiàn)功能表達，研究核酸序列與蛋白質(zhì)功能之間的關(guān)系。DNA基本操作技術(shù)核酸凝膠電泳細菌轉(zhuǎn)化聚合酶鏈式反應技術(shù)實時定量PCRDNA操作技術(shù)1、核酸的凝膠電泳自從瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠被引入核酸研究以來，按分子量大小分離DNA的凝膠電泳技術(shù)，已經(jīng)發(fā)展成為一種分析鑒定重組DNA分子及蛋白質(zhì)與核酸相互作用的重要實驗手段?；驹硪环N分子被放置到電場中，它就會以一定的速度移向適當?shù)碾姌O。我們把這種電泳分子在電場作用下的遷移速度，叫做電泳的遷移率，它與電場強度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比。堿性條件下，核酸分子中的磷酸基團呈離子化狀態(tài)，所以，DNA和RNA又被稱為多聚陰離子，在電場中向正電極的方向遷移。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正電極方向遷移。大分子量的DNA移動的慢小分子量的DNA移動的快電泳緩沖液陽極陰極DNA加樣孔在一定的電場強度下，DNA分子的這種遷移速度，亦即電泳的遷移率，取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型。凝膠電泳裝置瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為0.2~50kb之間。聚丙烯酰胺凝膠的分辨范圍為1到1000個堿基對之間。凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強。分辨力脂糖及聚丙烯酰胺凝膠分辨DNA片段的能力凝膠類型及濃度分離DNA的大小范圍（bp）0.3%瓊脂糖50000~10000.7%瓊脂糖20000~10001.4%瓊脂糖6000~3004.0%聚丙烯酰胺1000~10010.0%聚丙烯酰胺500~2520.0%聚丙烯酰胺50~1在凝膠電泳中，加入溴化乙錠（ethidiumbromide，EB）染料對核酸分子進行染色，然后放置在紫外光下觀察，可靈敏而快捷地檢測出凝膠介質(zhì)中DNA的譜帶部位，即使每條DNA帶中僅含有0.05μg的微量DNA，也可以被清晰地檢測出來。溴化乙錠染料的化學結(jié)構(gòu)及其對DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙錠分子，在紫外光照射下，瓊脂糖凝膠電泳中DNA的條帶便呈現(xiàn)出橘紅色熒光，易于鑒定。稱樣溶解加熱制板倒膠電泳操作基本程序取樣點樣電泳檢測超螺旋DNA線狀雙鏈DNA開環(huán)DNAACB"Supercoiled"

(or

"Covalently

ClosedCircular")

DNA

is

fully

intact

with

both

strands

uncut,

and

with

a

twist

built

in,

resulting

in

a

compact

form,

so

they

move

faster

others."Linear"

DNA

has

free

ends,

it

moves

at

the

speed

similar

to

its

molecular

weight,

compared

to

the

markers."Nicked

Open-Circular"

DNA

has

one

strand

cut,

it

is

not

supercoiled,

and

it

is

not

compact

form,

but

it

is

circular.

Therefore,

it

migrates

slower

than

the

above

2

forms.RelaxedcircleLinearizedformSuper-coiledform對于未進行酶切的質(zhì)粒來說，常會出現(xiàn)多條電泳帶2、細菌轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化：異源DNA分子導入受體細胞的過程感受態(tài)細胞：處于能夠接受外源DNA狀態(tài)的細胞稱為感受態(tài)細胞。受體菌與質(zhì)粒的選擇受體菌：

E.ColiDH5α：無Ap抗性外源質(zhì)粒

Ampr抗性基因編碼一種周質(zhì)酶（β-內(nèi)酰胺酶）可特異地切割Amp的β-內(nèi)酰胺環(huán)，從而使其失去殺菌能力

選擇:

如進行藍白斑篩選時可選用DH5α、JM109、TG1；用T7啟動子進行原核表達時可選用BL21(DE3)；+質(zhì)粒DNA420C熱擊復蘇Amp+細菌處于00C,CaCl2低滲溶液中,菌細胞膨脹成球形,外源DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸鹽混合物黏附于細胞表面。（30min）經(jīng)短時間420C熱擊處理（2min）,促進細胞吸收DNA復合物。迅速冰浴1-2min。將細菌放在非選擇性培養(yǎng)基上保溫一段時間（1h），使抗氨芐青霉素的表型表達后再轉(zhuǎn)到含氨芐青霉素的選擇性培養(yǎng)基上，長出來的菌即為轉(zhuǎn)入了外源基因的菌株。細菌轉(zhuǎn)化（CaCl2法）電擊法：電脈沖可以再細胞膜上造成小凹陷，隨著電壓增大，孔洞變?yōu)橛H水性孔洞。在孔洞開放的時候，外源DNA容易通過孔洞進入細胞質(zhì)。噬菌體法：鑒定轉(zhuǎn)化細胞：抗生素抗性結(jié)合藍白斑篩選法其他轉(zhuǎn)化和鑒定方法1、接單菌落到5mlLB液體培養(yǎng)基中，370C、190rpm振蕩培養(yǎng)過夜2、5%（250ul)菌液接種到含5mlLB的試管中，370C振蕩培養(yǎng)1-2小時，至OD6000.4-0.5（已完成）3、將1.5mL菌液轉(zhuǎn)移到離心管中4、離心5000rpm，40C，5min5、倒出培養(yǎng)液大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備6.用冰預冷的1mL0.1M的CaCl2處理、懸浮細胞，7.冰上20min8.(取1.5mL)5000rpm離心5min，傾去上清9.100uLCaCl2輕輕懸浮，冰浴大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備受體細菌50-100mmol/LCaCl2感受態(tài)細菌--------1ml-----------20min大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備實驗流程以擬擴增的DNA分子為模板，以一對分別與模板互補的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留復制的機理沿著模板鏈延伸直至完成新的DNA合成。通過不斷重復這一過程，可以使目的DNA片段得到擴增。另一方面，新合成的DNA片段也可以作為模板，因而PCR技術(shù)可使DNA的合成量呈指數(shù)型增長。3、聚合酶鏈反應技術(shù)PCR四要素：模板DNA、引物、酶、dNTPPCR的基本工作原理PCR是一種級聯(lián)反復循環(huán)的DNA合成反應過程。PCR技術(shù)的基本反應由三個步驟組成：1.變性(94℃)：通過加熱使模板DNA完全變性成為單鏈，同時引物自身和引物之間存在的局部雙鏈也得以消除；2.退火(55℃)：將溫度下降至適宜溫度，使引物與模板DNA退火結(jié)合；3.延伸(72℃)：將溫度升高，熱穩(wěn)定DNA聚合酶以dNTP為底物催化合成DNA鏈延伸。以上三部為一個循環(huán)，新合成的DNA分子又可以作為下一輪合成的模板，經(jīng)多次循環(huán)后即可達到擴增DNA片段的目的。72℃94℃55℃PCR循環(huán)變性退火延伸模板DNAdNTP

引物Buffer預變性模板DNAdNTP

引物BufferTaqDNA聚合酶循環(huán)儀94oC5min94℃變性55℃退火72℃延伸PCR技術(shù)的特點1）高度的靈敏性30輪循環(huán)擴增量達230個拷貝（109拷貝）PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍2）特異性引物引物引物的序列及其與模板結(jié)合的特異性是決定PCR反應結(jié)果的關(guān)鍵。引物設(shè)計的最大原則是最大限度地提高擴增效率和特異性；同時盡可能減少非特異性擴增。

PCR擴增法,只需要數(shù)小時,就可以用電泳法檢出1μg基因組DNA中僅含數(shù)個拷貝的模板序列。通常的DNA擴增法是分子克隆法,首先要構(gòu)建含有目的的基因的載體,然后將它導入細胞后進行擴增,還要用同位索探針進行篩選;這種方法,要經(jīng)過DNA內(nèi)切、連接、轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)等相關(guān)的過程,操作復雜,一般需要數(shù)周時間。3）操作簡便易行4）用途廣泛生命學科醫(yī)學工程遺傳工程疾病診斷法醫(yī)學考古學4、實時定量PCRReal-timequantitativePCR實時熒光定量PCR就是通過對PCR擴增反應中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測從而實現(xiàn)對起始模板定量及定性的分析。在實時熒光定量PCR反應中，引入了一種熒光化學物質(zhì)，隨著PCR反應的進行，PCR反應產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖。4、實時定量PCR

實時熒光定量PCR中熒光化學，熒光定量pcr所使用的熒光化學可分為兩種：熒光染料和熒光探針在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。（1）SYBR熒光染料熱變性引物退火延伸反應SYBRGreenI染料法——作用機理（2）TaqMan熒光探針

5′端標記有報告基團(Reporter,R)，如FAM、VIC等

3′端標記有熒光淬滅基團(Quencher,Q)

探針完整，R發(fā)射的熒光能量被Q基團吸收，無熒光，R與Q分開，發(fā)熒光

Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針Taqman探針法——工作機理熱變性引物和探針與模板退火延伸反應探針報告基團淬滅基團探針DNA聚合酶引物RRRRCycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強度）BaselineLog－linerphaseLog－linerphaseThreshold熒光定量PCR原理－－熒光域值一般而言，熒光擴增曲線擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段,熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，可以選擇在這個階段進行定量分析。Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強度）Ctvalue熒光定量PCR原理－－Ct值Ct值：每個反應管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。Ct值與起始模板的關(guān)系，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。可利用來計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。CyclenumberCk104Ck102SampleLogofDNAconcentration

模板DNA量越多，熒光達到域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小。

Log模板起始濃度與Ct值呈線性關(guān)系。熒光定量PCR原理－－Ct值與模板起始量的關(guān)系

定性分析研究：雜合或純合子鑒定，（SNPs）分析等

絕對定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷貝數(shù)定量檢測等

相對定量研究：mRNA表達量分析，siRNA效果確認，基因芯片結(jié)果驗證，差異顯示結(jié)果驗證等熒光定量PCR技術(shù)的應用理論上目的基因表達量分析條件SampleBSampleA目的基因擴增效率相同RNA提取效率相同細胞起始數(shù)相同實際目的基因表達量分析相對定量的必要性以上條件不可能同時得到滿足，必須用內(nèi)對照基因（管家基因）進行校正，進行相對表達量分析。管家基因

維持細胞基本代謝活動所必須的基因,如：GAPDH、Actin、18SrRNA等篩選方法

根據(jù)文獻提供通過具體實驗篩選相對定量分析——管家基因篩選0123456Sample1Sample2Sample3Sample4實驗組實驗值β-ActinGAPDHβ-2-microglobulinHPRTP

P

P

O

通過標準曲線對對照樣品、待測樣品的目的基因及管家基因進行定量，然后根據(jù)計算公式求得相對值即為相對表達量。

相對值=校正值=目的基因定量結(jié)果管家基因定量結(jié)果待測樣品的校正值對照樣品的校正值相對定量分析——雙標準曲線法公式：5、重亞硫酸鹽測序技術(shù)（1）表觀遺傳學表觀遺傳學是指基于非基因序列改變所致基因表達水平變化，如DNA甲基化和染色質(zhì)構(gòu)象變化等。（2）DNA甲基化在DNA復制后，經(jīng)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DMT）催化，將S-腺苷酰-L-甲硫氨酸(SAM)上的甲基基團連接到DNA分子腺嘌呤堿基或胞嘧啶堿基上，進行DNA修飾的過程。CpG島CpG島主要位于基因的啟動子和第一外顯子區(qū)域，約有60%以上基因的啟動子含有CpG島。GC含量大于50%,長度超過200bp。在啟動子或“起始”區(qū)域周圍，甲基化經(jīng)常被抑制。這些區(qū)域包含濃度相對較高的CpG對，與此段區(qū)域?qū)娜旧w區(qū)段一起被稱作CpG島。CpG島與56%的基因編碼有關(guān)。正常細胞的CpG島由于被保護而處于非甲基化狀態(tài)。全基因組低甲基化，維持甲基化模式酶的調(diào)節(jié)失控和正常非甲基化CpG島的高甲基化是人類腫瘤中普遍存在的現(xiàn)象。CpG島以往的研究證明啟動子區(qū)的高甲基化導致抑癌基因失活是人類腫瘤所具有的共同特征之一，而且這種高甲基化是導致抑癌基因失活的又一個機制。重亞硫酸鹽使DNA中未發(fā)生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉(zhuǎn)變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變，行PCR擴增(引物設(shè)計時盡量避免有CpG，以免受甲基化因素的影響)所需片段，則尿嘧啶全部轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶。最后，對PCR產(chǎn)物進行測序，并且與未經(jīng)處理的序列比較，判斷是否CpG位點發(fā)生甲基化。（3）重亞硫酸鹽測序技術(shù)原理6、基因組DNA文庫的構(gòu)建基因組DNA文庫的定義

具有代表性的基因文庫應該在最大限度上覆蓋所有的原始序列。含有某種生物全部遺傳信息的重組DNA分子的克隆總和。文庫大小以最大可能可獲得某一特定序列的基因文庫所必須包含的重組體數(shù)的計算方式如下

N＝ln(1-p)/ln(1-f)

N—基因組文庫克隆總數(shù)

P—給定的概率，f—插入片段大小占總基因組大小的比例

如果給定概率為0.99，插入片段為20kb的情況下，對人類基因組（3Χ109bp）來說，所需重組體的數(shù)目為6.9Χ105；而對于大腸桿菌而言，僅需要1100個重組體?；蚪MDNA文庫的構(gòu)建流程提取切割整合轉(zhuǎn)化特點及應用：包含所有遺傳信息構(gòu)建難度大（單拷貝基因、長片段基因）篩選難度大用于研究基因在基因組中的情況基因組DNA文庫基因組DNA文庫限制性內(nèi)切酶基因組DNA基因重組轉(zhuǎn)化細菌體外包裝篩選目的基因（核酸探針法、免疫結(jié)合法）基因文庫的篩選是指通過某種特殊方法從基因文庫中鑒定出含有所需重組DNA分子的特定克隆的過程。篩選方法有很多種，常用的有：核酸雜交法PCR篩選法免疫篩選法基因文庫的篩選P189裂解變性顯影從基因組文庫中篩選目的基因probe放射性核素轉(zhuǎn)印管家基因Vs奢侈基因又稱持家基因（house-keepinggenes），是指所有細胞中均要表達的一類基因，其產(chǎn)物是對維持細胞基本生命活動所必需的。如微管蛋白基因、糖酵解酶系基因與核糖體蛋白基因等。管家基因表達水平受環(huán)境因素影響比較小，而是在個體各個生長階段的大多數(shù)、或幾乎全部組織中持續(xù)表達，或變化很小。管家基因奢侈基因奢侈基因(luxurygene)即組織特異性表達的基因。這類基因與各類細胞的特殊性有直接的關(guān)系,是在各種組織中進行不同的選擇性表達的基因。管家基因Vs奢侈基因第三節(jié)RNA操作技術(shù)1.總RNA的提取RNA易遭降解，實驗要求較嚴格。總RNA提取的方法有多種，主要有LiCl法、CTAB法、異硫氰酸胍法（TriZol）。異硫氰酸胍法（TriZol）原理：TRIZOL試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚，其中異硫氰酸胍可裂解細胞，促使核蛋白體的解離，使RNA與蛋白質(zhì)分離，并將RNA釋放到溶液中。當加入氯仿時，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA進入水相，離心后可形成水相層和有機層，這樣RNA與仍留在有機相中的蛋白質(zhì)和DNA分離開。水相層（無色）主要為RNA，有機層（紅色）主要為DNA和蛋白質(zhì)。收集上面的的水樣層后，RNA可以通過異丙醇沉淀來還原。RNA的評價與鑒定OD260/OD280=1.8~2.0mRNA的分離方法較多，其中以寡聚（dT）-纖維素柱層析法最為有效，已成為常規(guī)方法。利用mRNA的PolyA結(jié)構(gòu)，試劑盒提供一種生物素化寡聚dT引物，與PolyA雜交，形成生物素化寡聚dT-mRNA的雜交體，然后利用生物素與抗生物素蛋白的結(jié)合作用以連抗生物素-順磁顆粒（SA-PMPs）結(jié)合雜交體，形成生物素化寡聚dT-mRNA-SA-PMPs復合物，再利用磁性吸附作用以磁性條吸附復合物中的SA-PMPs顆粒，最后利用高鹽溶液中分子雜交體磁性減弱，雜交體中生物素化寡聚dT引物與mRNA分離，從而純化得到mRNA。2.mRNA的純化PolyATtractmRNA的分離純化過程簡圖3.cDNA的合成cDNA的合成包括第一鏈和第二鏈cDNA的合成。第一鏈cDNA的合成是以mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，由反轉(zhuǎn)錄酶催化，該酶合成DNA時需要引物引導，常用引物是oligo

dT。第二鏈合成是以第一鏈為模板，由DNA聚合酶催化。單鏈cDNA的3'端能夠形成發(fā)夾狀的結(jié)構(gòu)作為引物,在大腸桿菌聚合酶IKlenow或反轉(zhuǎn)錄酶的作用下,合成cDNA的第二鏈.煮沸NaOHAAAAAAAAAAAAAA5‘ppp’5GGAAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’TTTTTTTTTTTTTTp

5’TTTTTTTTTTTTTTp

5’AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTOH

3’KlenowdNTPs核酸酶S1cDNA第二鏈的自身引導合成法cDNA第二鏈的置換合成法RNA酶H在雜交體中的mRNA鏈上造成切口或缺口，EcoliDNA聚合酶I以RNA片段為引物，合成DNA鏈，取代模板上的mRNA；這些DNA片段經(jīng)T4噬菌體DNA連接酶連接，形成完整的cDNA第二鏈。4.cDNA文庫的構(gòu)建cDNA

文庫是指某生物某發(fā)育時期所轉(zhuǎn)錄的全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA

片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。經(jīng)典cDNA

文庫構(gòu)建的基本原理是用Oligo(dT)作逆轉(zhuǎn)錄引物，或者用隨機引物，給所合成的cDNA

加上適當?shù)倪B接接頭，連接到適當?shù)妮d體中獲得文庫。步驟：在獲得高質(zhì)量的mRNA后，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，合成接頭的加入、將雙鏈DNA克隆到載體中去、分析cDNA

插入片斷，擴增cDNA

文庫、對建立的cDNA

文庫進行鑒定。這里強調(diào)的是對載體的選擇，常規(guī)用的是λ噬菌體，這是因為λDNA兩端具有由12個核苷酸的粘性末端，可用來構(gòu)建柯斯質(zhì)粒，這種質(zhì)粒能容納大片段的外源DNA。cDNA文庫cDNA與模板mRNA序列嚴格互補，而不含內(nèi)含子。以組織細胞中的mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA，各cDNA分子分別插入載體形成重組子，再導入宿主細胞克隆擴增。這些在重組體內(nèi)的cDNA的集合即cDNA文庫。cDNA文庫的組建cDNA文庫僅包含正在表達的基因不同物種、不同組織的cDNA文庫不相同基因總量少，易篩選cDNA文庫的組建：第四節(jié)基因克隆技術(shù)在多細胞的高等生物個體水平上，人們用克?。╟lone）表示由具有相同基因型的同一物種的兩個或數(shù)個個體組成的群體。從同一受精卵分裂而來的單卵雙生子便是屬于同一克隆。在細胞水平上，克隆一詞是指由同一個祖細胞分裂而來的一群遺傳上同一的子細胞群體。在分子生物學上，人們把將外源DNA插入具有復制能力的載體DNA中，使之得以永久保存和復制這種過程稱為克隆?？寺〉亩x用于從已知cDNA片段擴增全長基因的方法，它根據(jù)已知序列設(shè)計基因片段內(nèi)部特異引物，由該片段向外側(cè)進行PCR擴增得到目的序列。用于擴增5’端的方法稱為5’RACE，用于擴增3’端的稱為3’RACE。1.RACE技術(shù)（rapid-amplificationof

cDNAends）cDNA末端快速擴增技術(shù)RACE是通過PCR進行cDNA末端快速克隆的技術(shù)。cDNA完整序列的獲得對基因結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)表達、基因功能的研究至關(guān)重要。完整的cDNA

序列可以通過文庫的篩選和末端克隆技術(shù)獲得。在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以已知基因片段內(nèi)部。特異性引物啟始cDNA第一條鏈的合成

RNase混合物降解模板mRNA，純化cDNA第一條鏈。

用末端轉(zhuǎn)移酶在cDNA鏈3‘端加入連續(xù)的dCTP

以連有oligo(dG)

的錨定引物和基因片段內(nèi)部特異的nested引物進行PCR擴增，以期得到目的片段，并可用nestPCR進行檢測。（1）5’RACE是在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以連有可以和polyA配對的oligo(dT)的錨定引物啟始cDNA第一條鏈的合成。用RNaseH

降解模板mRNA。用通用錨定引物和基因片段內(nèi)部特異引物進行PCR擴增得到目的3‘片段，并可用nestPCR的方法繼續(xù)進行檢測和擴增。（2）3’RACE2.應用cDNA差示法分析克隆基因cDNA差示分析法充分發(fā)揮了PCR能以指數(shù)形式擴增雙鏈DNA模板，僅以線形形式擴增單鏈模板的特性，通過降低cDNA群體復雜性和更換cDNA兩端接頭等方法，特異性擴增目的基因片斷。3.Gateway大規(guī)?？寺〖夹g(shù)Gateway克隆技術(shù)包括TOPO反應和LR反應。Gateway基因大規(guī)?？寺》ɡ胠噬菌體進行位點特異性DNA片段重組，實現(xiàn)了不需要傳統(tǒng)的酶切連接過程的基因快速克隆和載體間平行轉(zhuǎn)移，為大規(guī)模克隆基因組注釋的開放讀碼框提供了保障。TOPO反應：將目的基因PCR產(chǎn)物連入Entry載體，載體上的CCCTT被拓撲異構(gòu)酶識別切割，酶通過其Tyr274與切口處的磷酸基共價相連。加入PCR產(chǎn)物后，形成的3’突出端GTGG，攻擊PCR產(chǎn)物的互補性末端并與接頭序列CACC退火，切去GTGG后使PCR產(chǎn)物連入Entry載體。TOPO反應LR反應用于將目的片段從Entry載體中重組入表達載體。Entry載體上基因兩端具有attL1和a