飼料及飼料原料中黃曲霉毒素B1的快速篩查 膠體金免疫層析法-江西省地方標(biāo)準(zhǔn)編制說(shuō)明

一、標(biāo)準(zhǔn)制定意義（一）介紹黃曲霉毒素屬于二呋喃氧雜萘鄰?fù)难苌?，其分子結(jié)構(gòu)中含有1個(gè)二呋喃環(huán)和1個(gè)氧雜萘鄰?fù)ㄏ愣顾兀┉h(huán)。黃曲霉毒素難溶于水、己烷、石油醚，易溶于甲醇、乙醇、氯仿、二甲基甲酰胺等有機(jī)溶劑。在中性溶液中較穩(wěn)定，在強(qiáng)酸性溶液中稍有分解，易被堿或強(qiáng)氧化劑破壞，在pH值9~10的強(qiáng)堿溶液中會(huì)迅速分解成無(wú)毒的鹽。純品為無(wú)色結(jié)晶，耐高溫，分解溫度為268℃，紫外線對(duì)低濃度黃曲霉毒素有很強(qiáng)穩(wěn)定作用?，F(xiàn)已分離出AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFB2a、AFG2a、AFM1、AFM2、AFP1等18種之多，其中以AFB1的毒性和致癌性最強(qiáng)。黃曲霉毒素的產(chǎn)毒菌廣泛存在于花生、玉米、麥類、稻谷等糧食作物的籽粒及核桃、杏仁等干果、禽蛋、肉、甘薯、大豆粕、奶及奶制品中。對(duì)動(dòng)物有劇烈急性毒性和明顯慢性毒性，具有很強(qiáng)致突變、致畸和致癌作用。AFB1是迄今為止人類所知的毒性和致癌性最強(qiáng)的物質(zhì)之一，其急性毒性約為三氧化二砷的68倍、氰化鉀的10倍。其損害肝臟，容易引發(fā)肝炎、肝硬化、肝壞死等病癥。亞洲和非洲的疾病研究機(jī)構(gòu)的研究表明，食物中黃曲霉毒素與干細(xì)胞癌變呈正相關(guān)性，長(zhǎng)時(shí)間食用含低濃度黃曲霉毒素的食物被認(rèn)為是導(dǎo)致肝癌、胃癌、腸癌等疾病的主要原因。黃曲霉毒素在體內(nèi)還具有一定的蓄積性，長(zhǎng)期攝入低劑量的黃曲霉毒素能夠大大增加患肝癌的幾率。此外，黃曲霉毒素與其他致病因素（如肝炎病毒等）對(duì)人類疾病的誘發(fā)具有疊加效應(yīng)，其細(xì)胞毒作用可干擾信息RNA和DNA的合成，進(jìn)而干擾細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成，導(dǎo)致動(dòng)物全身性損害。（二）背景據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）統(tǒng)計(jì)，全世界每年谷物產(chǎn)量的25%受到真菌毒素不同程度的污染。隨著飼料工業(yè)的快速發(fā)展，近年來(lái)，中國(guó)的飼料也受到霉菌污染的嚴(yán)重挑戰(zhàn)。自2006年以來(lái)，玉米等飼料原料價(jià)格普遍上漲，致使很多飼料企業(yè)及養(yǎng)殖戶使用低質(zhì)飼料原料，加上近年來(lái)氣候的變化，華北、東北地區(qū)降雨量增加，進(jìn)一步加重了飼料原料中真菌毒素的污染。而由于飼料原料和配合飼料中多種真菌毒素同時(shí)存在，在食用油等產(chǎn)品及牛奶中真菌毒素污染也比較嚴(yán)重。在世界許多地方，目前真菌毒素已構(gòu)成重要的食品安全問(wèn)題。真菌毒素對(duì)人類和動(dòng)物健康可產(chǎn)生嚴(yán)重的影響，這一認(rèn)識(shí)導(dǎo)致了許多國(guó)家在近幾十年來(lái)制定了諸多有關(guān)食品和飼料中真菌毒素的法規(guī)，以保護(hù)人類的健康，并保障生產(chǎn)者和貿(mào)易商的經(jīng)濟(jì)利益。隨著全球經(jīng)濟(jì)一體化的進(jìn)程，類似真菌毒素等涉及安全衛(wèi)生項(xiàng)目的限量標(biāo)準(zhǔn)，越來(lái)越多地被利用為貿(mào)易保護(hù)主義中非關(guān)稅壁壘的重要手段。因此，為了保證食品安全，保障消費(fèi)者的健康，為了打破國(guó)外的技術(shù)壁壘，同時(shí)在合理有利的前提下，更多地樹立我國(guó)的技術(shù)性壁壘，開展飼料中真菌毒素的檢測(cè)并建立標(biāo)準(zhǔn)方法是有效的方法之一。目前國(guó)內(nèi)應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法大多為儀器方法，所需儀器設(shè)備昂貴，不利于進(jìn)行廣泛推廣，并且限制了很多檢測(cè)單位高效、廣泛地開展檢測(cè)工作。建立符合中國(guó)國(guó)情的快速檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)，具有檢測(cè)快速、簡(jiǎn)便、靈敏、成本低等優(yōu)點(diǎn)，為打開市場(chǎng)并占領(lǐng)市場(chǎng)提供了先決條件。（三）限量標(biāo)準(zhǔn)、檢測(cè)方法及研究現(xiàn)狀1、限量標(biāo)準(zhǔn)國(guó)際上，在1966年WHO/FAO率先規(guī)定了世界貿(mào)易流通食品中AFB1的最高允許量，其中明確規(guī)定國(guó)際貿(mào)易的谷類作物中AFB1的含量必須在15μg/kg以下，超過(guò)此標(biāo)準(zhǔn)含量的產(chǎn)品將不能投放于市場(chǎng)進(jìn)行流通和食用。英國(guó)在1933年規(guī)定，供人類消費(fèi)前需加工的進(jìn)口農(nóng)產(chǎn)品中AFB1含量必須低于10μg/kg，供人類消費(fèi)的農(nóng)產(chǎn)品AFB1的含量低于4μg/kg。美國(guó)在1994年重新將黃曲霉毒素的限量進(jìn)行調(diào)整：用于飼養(yǎng)家禽、豬、牛、羊的花生谷物等制品中黃曲霉毒素總量不得超過(guò)100μg/kg，飼養(yǎng)幼年產(chǎn)奶動(dòng)物的飼料中黃曲霉毒素的總量不超過(guò)20μg/kg；兩年后，美國(guó)聯(lián)邦政府再次規(guī)范了黃曲霉毒素食品相關(guān)的安全法律，使其對(duì)食品或動(dòng)物飼料中黃曲霉毒素的含量要求更為嚴(yán)格，它規(guī)定人類消費(fèi)食品和奶牛飼料中的黃曲霉毒素總含量必須低于15μg/kg，人類消費(fèi)的牛奶中AFB1含量要低于0.5μg/kg，其他動(dòng)物飼料中黃曲霉毒素的含量要低于30μg/kg。最為嚴(yán)格的規(guī)定為歐盟國(guó)家，國(guó)家要求人類生活的食品消費(fèi)品中AFB1的含量均不能超過(guò)2μg/kg。我國(guó)目前對(duì)AFB1的限量為特殊性膳食食品中為0.5μg/kg，其他食品和飼料中AFB1的限量依據(jù)不同來(lái)源而有所不同，飼料詳細(xì)標(biāo)準(zhǔn)見表1。表1我國(guó)飼料中的AFB1限量標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品名稱限量/(μg/kg)玉米、花生餅（粕）、棉籽餅（粕）、菜籽餅（粕）≤50豆粕≤30仔豬配合飼料及濃縮飼料≤10生長(zhǎng)肥育豬、種豬配合飼料及濃縮飼料≤20肉用仔雞前期、雛雞配合飼料及濃縮飼料≤10肉用仔雞后期、生長(zhǎng)雞、產(chǎn)蛋雞配合飼料及濃縮飼料≤20肉用仔鴨前期、雛鴨配合飼料及濃縮飼料≤10肉用仔鴨后期、生長(zhǎng)鴨、產(chǎn)蛋鴨配合飼料及濃縮飼料≤15鵪鶉配合飼料及濃縮飼料≤20奶牛精料補(bǔ)充料≤10肉牛精料補(bǔ)充料≤502、檢測(cè)方法及研究現(xiàn)狀真菌毒素的檢測(cè)方法主要有兩種，一是將色譜技術(shù)作為基礎(chǔ)的物理化學(xué)檢測(cè)方法，包括高效液相色譜法（HPLC）和氣相色譜法（GC）等，而薄層層析法（TLC）由于操作過(guò)程太復(fù)雜，國(guó)際上近些年使用這種方法檢測(cè)真菌毒素的情況越來(lái)越少；二是免疫化學(xué)檢測(cè)法，主要指免疫親和柱法（IAC）以及酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）等。GC可同時(shí)檢測(cè)多種真菌毒素且檢測(cè)限較低，但仍存在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不理想、測(cè)定時(shí)需要進(jìn)行衍生化、上一次進(jìn)樣待測(cè)物品滯留、重復(fù)進(jìn)樣變異系數(shù)大使得重現(xiàn)性較差等一系列問(wèn)題。HPLC法雖可精確進(jìn)行定性定量測(cè)定，但是樣品前處理較為繁瑣、儀器昂貴而成本高，同時(shí)需要專門的技術(shù)操作人員，因而一般用于大型企業(yè)、科研院校和專業(yè)檢測(cè)機(jī)構(gòu)的定量分析。ELISA檢測(cè)黃曲霉毒素，樣品前處理步驟簡(jiǎn)單且可實(shí)現(xiàn)定量化，但這種生物學(xué)方法，受環(huán)境因素影響大，所用抗體和酶特別容易發(fā)生變質(zhì)，如今市場(chǎng)上的同一物質(zhì)試劑盒檢測(cè)結(jié)果差異性較大，穩(wěn)定性還有待提高。相比較而言，膠體金免疫層析法無(wú)需大型儀器、所需輔助試劑少、交叉反應(yīng)率低、試紙條易于保存且可單份測(cè)定，避免了分析步驟繁瑣、成本高等缺點(diǎn)，而且因其檢測(cè)更快速、操作更簡(jiǎn)單，測(cè)試人員無(wú)需進(jìn)行專業(yè)培訓(xùn)，所以更適合食品安全快速檢測(cè)行業(yè)的快速檢驗(yàn)和基層檢測(cè)，尤其是野外和偏遠(yuǎn)地區(qū)人員現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用此項(xiàng)技術(shù)十分方便。（四）制定標(biāo)準(zhǔn)的必要性和意義1、提高農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量的需要黃曲霉毒素B1是由產(chǎn)毒真菌產(chǎn)生的代謝物，廣泛存在于糧油食品和飼料中。這些產(chǎn)毒真菌分布于各級(jí)食物鏈，即使是在現(xiàn)今擁有先進(jìn)的農(nóng)業(yè)技術(shù)和食品加工工藝的條件下，在作物種植、收獲、儲(chǔ)藏和加工過(guò)程中，仍然無(wú)法避免和防止產(chǎn)毒真菌的危害。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展，人民群眾物質(zhì)文化生活水平不斷提高，對(duì)食品安全的關(guān)注進(jìn)一步提高，迫切需要相應(yīng)的檢測(cè)技術(shù)，鑒于傳統(tǒng)檢測(cè)方法的專業(yè)性要求高和成本昂貴的缺點(diǎn)，黃曲霉毒素B1快速檢測(cè)技術(shù)的研究及制訂相應(yīng)的檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)是非常必要的。2、實(shí)現(xiàn)以人為本，保證廣大群眾生命健康的需要黃曲霉毒素B1毒性很高，可通過(guò)污染谷物和那些來(lái)源于被黃曲霉毒素B1污染了的飼料喂飼的動(dòng)物性食物（如牛奶、肉和蛋）而進(jìn)入食物鏈，危害人類健康。其具有致突變、致癌性，還具有免疫毒性，其作用的靶器官主要為肝臟，可引起人類和動(dòng)物的肝臟病變和致癌。為了對(duì)國(guó)家、人民高度負(fù)責(zé)，保障人民生命安全和農(nóng)村社會(huì)穩(wěn)定，研究黃曲霉毒素B1快速檢測(cè)技術(shù)并制訂相應(yīng)的檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)是非常必要的。3、適應(yīng)市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)和加入WTO新形勢(shì)的需要我國(guó)已經(jīng)加入WTO，我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品已面臨國(guó)際和國(guó)內(nèi)兩個(gè)市場(chǎng)，為我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品（勞動(dòng)密集型）進(jìn)入國(guó)際市場(chǎng)提供了很好的機(jī)遇，但國(guó)際上十分重視農(nóng)產(chǎn)品的安全問(wèn)題，而農(nóng)產(chǎn)品易于被真菌污染，可能存在黃曲霉毒素B1等真菌毒素殘留問(wèn)題，這已成為影響出口創(chuàng)匯的最大制約因素。由于毒素殘留超標(biāo)，引起外國(guó)拒收，退貨、扣留、索賠、撤消合同等事件經(jīng)常發(fā)生，給我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)者造成很大損失，并影響了我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品的形象。為了從源頭保證農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量，提高我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品的競(jìng)爭(zhēng)力，研究黃曲霉毒素B1快速檢測(cè)技術(shù)并制訂相應(yīng)的檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)是非常必要的。二、標(biāo)準(zhǔn)制定過(guò)程《飼料原料中黃曲霉毒素B1的快速篩查膠體金免疫層析法》標(biāo)準(zhǔn)由江西省獸藥飼料監(jiān)察所、北京勤邦生物技術(shù)有限公司、雙胞胎（集團(tuán)）股份有限公司、江西正邦科技股份有限公司負(fù)責(zé)起草編寫。根據(jù)國(guó)家有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)制定和修訂工作的要求，標(biāo)準(zhǔn)起草單位在《飼料原料中黃曲霉毒素B1的快速篩查膠體金免疫層析法》的起草編制過(guò)程中，主要工作包括以下幾個(gè)方面：（1）詳細(xì)查閱了國(guó)內(nèi)、國(guó)外有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)專業(yè)期刊上發(fā)表過(guò)的參考文獻(xiàn)等技術(shù)資料，并對(duì)這些資料進(jìn)行了詳細(xì)的對(duì)比，從方法的先進(jìn)性、可靠性和實(shí)用性等幾個(gè)方面考慮，選取了幾個(gè)代表性的參考資料作為標(biāo)準(zhǔn)起草中的主要技術(shù)參考文本。（2）及時(shí)購(gòu)置相關(guān)的實(shí)驗(yàn)試劑、標(biāo)準(zhǔn)品和其他材料；已將AFB1與丙二胺反應(yīng)得到具有氨基官能團(tuán)的半抗原；將AFB1半抗原與牛血清白蛋白和卵清蛋白分別進(jìn)行偶聯(lián)得到免疫原和包被原；已將制備獲得的抗原通過(guò)免疫小鼠獲得AFB1單克隆抗體；建立了膠體金免疫層析法的反應(yīng)體系，摸索不同條件對(duì)方法進(jìn)行最優(yōu)化，最終確定了最佳的檢測(cè)方法。（3）開展多種飼料原料膠體金快速檢測(cè)方法的試驗(yàn)，包括小麥、大米、黃豆、玉米、豆粕、花生粕、DDGS，這是方法的重要步驟和關(guān)鍵環(huán)節(jié)。不同樣品用同一種方法進(jìn)行試驗(yàn)和驗(yàn)證，確保本檢測(cè)方法能夠靈敏、特異、準(zhǔn)確地檢測(cè)出飼料原料中AFB1的含量。如：方法的靈敏度，按照空白飼料原料樣品及2μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg四種濃度對(duì)飼料原料進(jìn)行添加，確定檢測(cè)限；方法的準(zhǔn)確率，通過(guò)對(duì)經(jīng)驗(yàn)證的陰陽(yáng)性樣品進(jìn)行檢測(cè)，得到本檢測(cè)方法的假陰性率和假陽(yáng)性率，盲樣測(cè)定與儀器方法的結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，確保本方法的檢測(cè)結(jié)果可靠；方法的特異性，運(yùn)用本方法對(duì)飼料原料中常見的其他真菌毒素進(jìn)行檢測(cè)，確保本方法能特異性地檢測(cè)飼料原料中AFB1殘留。（4）在技術(shù)指標(biāo)完成試驗(yàn)工作之后，嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)的格式，起草編寫標(biāo)準(zhǔn)文本內(nèi)容和編制說(shuō)明內(nèi)容。三、標(biāo)準(zhǔn)制定依據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)GB/T1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》、GB/T20001.4-2015《標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)則第4部分：試驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)》的要求而進(jìn)行編寫的。有關(guān)技術(shù)內(nèi)容是在參考國(guó)外有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上經(jīng)研究、改進(jìn)和驗(yàn)證后制定的。四、標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)內(nèi)容和技術(shù)指標(biāo)的論證（一）技術(shù)原理本方法應(yīng)用了競(jìng)爭(zhēng)抑制免疫層析原理。將氯金酸用還原法制成一定直徑的金溶膠顆粒，標(biāo)記抗體。硝酸纖維素膜為載體，利用了微孔膜的毛細(xì)管作用，滴加在膜條一端的液體慢慢向另一端滲移。在移動(dòng)的過(guò)程中，會(huì)發(fā)生相應(yīng)的抗原抗體反應(yīng)，并通過(guò)免疫金的顏色而顯示出來(lái)。樣本中的黃曲霉毒素B1在流動(dòng)的過(guò)程中與膠體金標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合，抑制了抗體和硝酸纖維素（NC）膜檢測(cè)線上黃曲霉毒素B1-BSA偶聯(lián)物的結(jié)合，使檢測(cè)線不顯顏色，結(jié)果為陽(yáng)牲；反之，檢測(cè)線顯紅色，結(jié)果為陰性。（二）膠體金免疫方法主要材料的制備1、半抗原的合成及鑒定AFB1為小分子物質(zhì)，不具備免疫原性，只有反應(yīng)原性，因此需要與大分子共價(jià)結(jié)合后才能使動(dòng)物免疫系統(tǒng)識(shí)別，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，本實(shí)驗(yàn)首先需要合成小分子半抗原與蛋白質(zhì)偶聯(lián)的人工抗原。AFB1小分子半抗原的制備既要保留其基本結(jié)構(gòu)特征，同時(shí)又要很好地與大分子蛋白結(jié)合。本項(xiàng)目通過(guò)AFB1小分子結(jié)構(gòu)改造獲得具有氨基官能團(tuán)的半抗原，與牛血清白蛋白（BSA）偶聯(lián)合成免疫原，與卵清蛋白（OVA）偶聯(lián)合成包被原。將AFB1與丙二胺反應(yīng)得到具有氨基官能團(tuán)的半抗原，合成路線如下：半抗原合成的具體步驟：0.10gAFB1在2mL二甲基亞砜（DMSO）中的混合物，60℃下緩慢滴加入0.1mL1,3-丙二胺和0.1mL吡啶在2mLDMSO的混合液中，滴加完畢后，繼續(xù)反應(yīng)12h，旋蒸除去溶劑和未反應(yīng)的丙二胺，定量得到AFB1的丙二胺單縮合物，即為AFB1半抗原。2、人工抗原的合成及鑒定（1）免疫原的合成將AFB1半抗原與BSA進(jìn)行偶聯(lián)得到免疫原。具體操作如下：取AFB1半抗原20mg用2mL水溶解，得到溶液（Ⅰ），取0.5mL3%的戊二醛逐滴加入到上述溶液（Ⅰ）中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24h得到溶液（Ⅱ）；取50mgBSA用4mL水溶解得到溶液（Ⅲ）；將溶液（Ⅱ）緩慢加入到溶液（Ⅲ）中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過(guò)夜，再向攪拌后的溶液中加入30mgNaBH4進(jìn)行還原反應(yīng)；用0.02mol/L的PBS透析三天，每天更換透析液三次，得到AFB1免疫原。（2）包被原的合成將AFB1半抗原與OVA進(jìn)行偶聯(lián)得到包被原。具體操作如下：取50mgOVA用4mL水溶解，得到溶液（Ⅰ）；取EDC和NHS各50mg用2mL水溶解完全后加入溶液（Ⅰ）中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)30min，得到溶液（Ⅱ），取25mgAFB1半抗原用3mL水溶解，得到溶液（Ⅲ）；將溶液（Ⅱ）緩慢加入到溶液（Ⅲ）中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24h；用0.02mol/L的PBS將攪拌后的溶液透析3天，每天更換透析液3次，得到AFB1包被原。（3）AFB1免疫原與包被原的鑒定一般通過(guò)紫外掃描法鑒定半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)是否為有效偶聯(lián)，因?yàn)榘肟乖c蛋白在紫外下有不同的特征吸收，當(dāng)偶聯(lián)成功時(shí)，偶聯(lián)物的紫外吸收會(huì)有二者的迭加效應(yīng)出現(xiàn)，因此比著單獨(dú)的蛋白特征吸收會(huì)發(fā)生一定的偏移，可用于檢測(cè)偶聯(lián)是否成功。偶聯(lián)比的測(cè)定用pH7.4的PBS溶液稀釋AFB1半抗原、牛血清白蛋白、卵清蛋白和兩種蛋白與AFB1半抗原的結(jié)合物，配制成一定濃度的溶液，然后用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，得到它們的紫外吸收光譜圖。根據(jù)公式K=A/CL分別計(jì)算出AFB1半抗原、牛血清白蛋白、卵清蛋白的摩爾消光系數(shù)。在載體蛋白和AFB1半抗原的最大波長(zhǎng)處檢測(cè)偶聯(lián)物的光吸收值，按公式計(jì)算兩種物質(zhì)在偶聯(lián)物中的摩爾濃度比，即偶聯(lián)比：Ca/Cb=（A偶264×KBSA280-A偶280×KBSA264）/（A偶280×KAFB1264-A偶264×KAFB1280）蛋白含量的測(cè)定將偶聯(lián)物稀釋到適當(dāng)倍數(shù)后，測(cè)定280nm和260nm的分光光度值，按公式計(jì)算蛋白的濃度即偶聯(lián)物的濃度：蛋白質(zhì)（mg/mL）=1.45×OD280-0.74×OD260免疫原和包被原的鑒定結(jié)果通過(guò)紫外掃描法鑒定半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)是有效偶聯(lián)，根據(jù)AFB1半抗原、載體蛋白、偶聯(lián)物在特定波長(zhǎng)的摩爾吸光系數(shù)估算半抗原與載體蛋白的結(jié)合比分別為15:1和18:1，偶聯(lián)效果較好。3、抗體的制備（1）動(dòng)物免疫用無(wú)菌pH7.0的PBS液將合成的免疫原溶解，然后按免疫原（AFB1半抗原-BSA）與弗氏佐劑（FCA）1:3的比例充分乳化制成油乳劑疫苗。首次免疫用弗氏完全佐劑疫苗，對(duì)8~10周齡Balb/c小鼠進(jìn)行免疫，頸背部皮下多點(diǎn)注射，免疫劑量為150μg/只。14天后二免，采用弗氏不完全佐劑（FICA），免疫劑量同上；28天后三免，采用弗氏不完全佐劑，免疫劑量同上；31天后加強(qiáng)免，不加佐劑，直接采用AFB1半抗原-BSA免疫。免疫過(guò)程見表2。表2動(dòng)物免疫過(guò)程免疫過(guò)程免疫原免疫劑量/(μg/只)間隔時(shí)間首免AFB1半抗原-BSA（FCA）150-二免AFB1半抗原-BSA（FICA）15014天三免AFB1半抗原-BSA（FICA）15014天加強(qiáng)免（融合前三天）AFB1半抗原-BSA1003天（2）單克隆抗體的制備飼養(yǎng)細(xì)胞制備：斷頸處死8~10周齡Balb/c小鼠，浸泡在75%酒精中5min，隨即放入超凈工作臺(tái)內(nèi)，腹部朝上放于平皿內(nèi)或固定于解剖板上。用眼科鑷子夾起小鼠腹部皮膚，用剪刀剪一小口，注意切勿剪破腹膜，以免腹腔液外流和污染。然后用剪刀向上下兩側(cè)做鈍性分離，充分暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器吸取5mLRPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，注入小鼠腹腔，輕輕抽回注射器，晃動(dòng)小鼠腿部和尾部幾次。用原注射器抽回腹腔內(nèi)液體，注入離心管。如此反復(fù)操作3~4次。1000r/min離心10min，棄上清。用20~50mL完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，100μL/孔滴加到培養(yǎng)板，置培養(yǎng)箱備用。脾細(xì)胞制備：加強(qiáng)免疫后3天，取免疫Balb/c小鼠一只，眼眶采血后脫臼處死，在75%酒精中消毒后取脾臟，去除結(jié)締組織，制備脾細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，加RPMI1640至30mL，1500~2000r/min離心5min，棄上清，加RPMI1640至30mL，計(jì)數(shù)待用。骨髓瘤細(xì)胞制備：取3瓶生長(zhǎng)狀態(tài)良好的（活細(xì)胞數(shù)>95%）骨髓瘤細(xì)胞，將之完全吹下，轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，加RPMI1640至30mL，1500~2000r/min離心5min，棄上清，加RPMI1640至30mL，計(jì)數(shù)待用。細(xì)胞混合：脾細(xì)胞:骨髓瘤細(xì)胞=8:1，混合，1500~2000r/min離心5min。細(xì)胞融合：將混合好的細(xì)胞離心，倒干上清，把沉淀細(xì)胞塊彈成糊狀，置37℃水浴，在1min內(nèi)加入1mL融合劑，融合劑為聚乙二醇（PEG）4000，作用2min，并輕輕攪拌細(xì)胞，在隨后4min內(nèi)加入20mL無(wú)血清的PEG營(yíng)養(yǎng)液，1000r/min離心10min，棄上清。用20~50mL完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，鋪種于含飼養(yǎng)細(xì)胞96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100μL，置培養(yǎng)箱中。上清檢測(cè)：待細(xì)胞長(zhǎng)至孔底的1/2~1/3時(shí)，采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定細(xì)胞上清液，篩選陽(yáng)性孔。將陽(yáng)性細(xì)胞在檢測(cè)后2天內(nèi)采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆。10~14天后，再取細(xì)胞上清檢測(cè)，最終得到了穩(wěn)定分泌AFB1的單克隆雜交瘤細(xì)胞株，將此細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和傳代。老鼠致敏：液體石蠟致敏Balb/c小鼠，6~8周，注射體積500μL/只。10天后可制備腹水。注射細(xì)胞：收集雜交瘤細(xì)胞并用1640洗細(xì)胞兩遍，取100到150萬(wàn)細(xì)胞注射于老鼠腹腔，一周后可見老鼠狀態(tài)不活躍并且老鼠的腹腔腫大。腹水采集：注射細(xì)胞一周后對(duì)腹腔腫大的老鼠用無(wú)菌注射器于老鼠腹腔采集腹水，每隔一到兩天采集一次，這樣多次反復(fù)采集直到老鼠自然死亡。單抗純化：采集到的腹水，用辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行純化，純化后的腹水放入-20℃環(huán)境保存，腹水在使用前經(jīng)過(guò)0.01mol/LNaCl于4℃環(huán)境下透析48h，中間每隔6~8h換液一次。4、膠體金的制備（1）玻璃器皿的準(zhǔn)備用于實(shí)驗(yàn)的所有玻璃器皿在實(shí)驗(yàn)之前需要徹底清潔：將玻璃器皿先用自來(lái)水沖洗去除玻璃器皿表面的灰塵，用酸液浸泡36h后，取出，用自來(lái)水洗凈酸液，再用蒸餾水洗3~4次，再用去離子水把每個(gè)玻璃器皿洗三次，烤箱烘干后備用。專用的玻璃器皿用第一次生成的膠體金穩(wěn)定其表面，棄去后以雙蒸水洗凈，可以減少金顆粒的吸附，玻璃器皿的表面污染會(huì)干擾金顆粒的生成。（2）檸檬酸三鈉還原法取0.01%氯金酸水溶液100mL置于錐形瓶中，用恒溫電磁攪拌器加熱至沸騰，在持續(xù)高溫、持續(xù)攪拌的情況下加入1%檸檬酸三鈉水溶液2mL，繼續(xù)勻速攪拌加熱15min，溶液呈透亮的紅色。室溫冷卻，用去離子水恢復(fù)到原體積，4℃保存。（3）膠體金的質(zhì)量鑒定肉眼觀察：用肉眼觀察制備的膠體金，其顏色為酒紅色、均勻度較好無(wú)雜質(zhì)、透明度較高，說(shuō)明膠體金質(zhì)量較好，結(jié)果見圖1。圖1肉眼觀察膠體金顏色紫外掃描鑒定：取冷卻后的膠體金溶液進(jìn)行400~600nm紫外掃描，確定最大吸收峰波長(zhǎng)，觀察最大吸收峰的峰形、峰寬，結(jié)果見圖2。其圖譜中最大吸收峰的峰寬較小，說(shuō)明膠體金顆粒分布比較均勻，最大吸收峰波長(zhǎng)為523nm。圖2膠體金的紫外/可見分光光度計(jì)掃描圖透射電鏡鑒定：透射電鏡下觀察膠體金顆粒的大小是否均勻一致，有無(wú)橢圓形及多角形。拍片放大后測(cè)量膠體金顆粒直徑大小，取多個(gè)點(diǎn)計(jì)算膠體金顆粒的平均直徑。膠體金顆粒的透射電鏡掃描圖片見圖3。由圖3可知，在透射電鏡下觀察到膠體金顆粒的大小基本一致，沒有橢圓形、多角形的金顆粒。將照片掃描后轉(zhuǎn)換成電子版圖片，放大后測(cè)量膠體金顆粒直徑大小。隨機(jī)挑選10個(gè)膠體金顆粒通過(guò)計(jì)算得到金顆粒平均直徑為(20±0.5)nm。圖3膠體金電鏡掃描圖片（4）膠體金溶液的準(zhǔn)備用0.1mol/LK2CO3調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH值為7.2。由于金顆粒容易吸附于電極上使之堵塞，故不能用pH計(jì)測(cè)定膠體金溶液的pH值，一般使用精密pH試紙。5、膠體金標(biāo)記抗體的制備（1）穩(wěn)定膠體金最適抗體用量的選擇以目測(cè)法確定穩(wěn)定膠體金的最適抗體用量。用0.1mol/LK2CO3調(diào)節(jié)膠體金溶液pH為7.2，分裝9管，每管1mL。待標(biāo)記的抗體溶液用0.01mol/L，pH7.6的磷酸鹽緩沖液作系列稀釋為50~400μg/mL，分別取0.1mL加入2~8管的膠體金溶液中。第1管加0.1mL三蒸水，混勻。靜置5min后，在上述1~8管中加入0.1mL10%NaCl溶液，第9管加0.1mL三蒸水，混勻后靜置2h，觀察結(jié)果。稀釋后抗體和其他試劑操作步驟見表3，結(jié)果見表4和圖4。表3最適蛋白用量操作步驟試劑管數(shù)123456789抗體加樣量（mL）0.10.10.10.10.10.10.10.10.1抗體濃度（μg/mL）050100150200250300350400膠體金（mL）1.01.01.01.01.01.01.01.01.0搖勻，靜置5min10%NaCl（mL）0.10.10.10.10.10.10.10.10搖勻，靜置2h后，觀察結(jié)果備注：第1管為沒有加入抗體的對(duì)照管，其內(nèi)加入0.1mL三蒸水，第9管為沒有加入氯化鈉的對(duì)照管，其內(nèi)加入0.1mL三蒸水。表4目測(cè)法確定穩(wěn)定膠體金最適蛋白用量管號(hào)123456789蛋白添加量（μg）0510152025303540終顏色藍(lán)灰藍(lán)灰藍(lán)灰紅藍(lán)紅紅紅紅紅圖4膠體金與抗體比例試驗(yàn)結(jié)果由表4和圖4可知，未加抗體蛋白（1管）和加入抗體蛋白的量不足以穩(wěn)定膠體金的2~4管，呈現(xiàn)由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象；未加入氯化鈉的9管顏色不發(fā)生變化；而加入抗體蛋白量達(dá)到或超過(guò)穩(wěn)定膠體金的最小蛋白用量的5~8管保持紅色不變。其中含抗體蛋白量最低的5號(hào)試管即含穩(wěn)定1mL膠體金所需的最小蛋白用量。在此基礎(chǔ)上再增加20%即為待標(biāo)記抗體蛋白的實(shí)際用量，即穩(wěn)定膠體金的實(shí)際蛋白用量為每1mL膠體金溶液中添加24μg抗體蛋白。（2）膠體金標(biāo)記抗體程序在磁力攪拌下，用0.1mol/LK2CO3調(diào)節(jié)膠體金的pH至7.2，按每毫升膠體金溶液中加入抗體24μg的標(biāo)準(zhǔn)向膠體金溶液中加入AFB1單克隆抗體，攪拌混勻10min，加入10%BSA使其在膠體金溶液中的終濃度為1%，靜置10min。12000r/min，4℃離心40min，棄上清液，沉淀物用體積為初始膠體金體積1/10的金標(biāo)抗體稀釋液（含0.5%的牛血清白蛋白、0.3%的表面活性劑、10%的蔗糖，pH7.2的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液）重懸，置4℃環(huán)境中備用。（3）膠體金標(biāo)記抗體的鑒定將羊抗鼠二抗點(diǎn)樣于NC膜上，直接與金標(biāo)抗體作用，可見有明顯的粉紅色斑點(diǎn)，表明金標(biāo)抗體有活性。（三）膠體金免疫方法的建立1、固相載體的選擇（1）吸水墊的選擇取厚度為2.59nm，質(zhì)地均勻的Cottonlinters300作為吸水墊組裝試紙條，滴加樣品后5min觀察吸水墊的情況，樣品吸收速度較快，故選擇Cottonlinters300作為吸水墊。（2）硝酸纖維素膜的選擇將抗原適當(dāng)稀釋后通過(guò)點(diǎn)樣方式分別包被在milipore135、UnisartCN140和mdi70三種NC膜上，經(jīng)干燥、組裝試紙條后，置于陰性樣品中測(cè)試觀察樣品層析速度和檢測(cè)線顯色情況，結(jié)果見表5。表5NC膜點(diǎn)樣顯色結(jié)果NC膜型號(hào)millipore135UnisartCN140mdi70顯色情況＋＋＋＋＋＋＋注：＋＋＋，表示著色很深，與背景反差很大；＋＋，表示著色較深或著色很深但與背景反差較小；＋，表示著色淡或著色較深但與背景反差很?。唬?，表示沒有著色，或與背景色沒有反差，表6-表22同此注釋。由表5可知，不同孔徑及廠家的NC膜點(diǎn)樣后，均能顯色，但顯色程度略有不同，UnisartCN140顯色最深，milipore135和mdi70差別不大。不同NC膜組裝的試紙條加樣后樣品展開速度和加樣5min后的檢測(cè)線顯色結(jié)果見表6。表6NC膜層析顯色結(jié)果NC膜型號(hào)millipore135UnisartCN140mdi70試劑展開速度較快慢快5min后檢測(cè)線顯色情況＋＋＋＋＋＋＋由表6可知，UnisartCN140加入樣品后層析速度較慢，5min內(nèi)檢測(cè)線顯色最深，milipore135試劑展開速度較UnisartCN140快，但不及mdi70。milipore135與mdi70上檢測(cè)線顯色情況相差不多，但mdi70背景顏色較淺。所以，綜合層析速度與顯色情況，三種NC膜中，mdi70更符合試紙條設(shè)計(jì)要求。（3）樣品墊的選擇分別取BX-SB06、WFB、QXLM三種不同材質(zhì)材料作為樣品墊組裝試紙條，在金標(biāo)墊處滴加2μL10%的金標(biāo)抗體，滴加100μL的陰性豆粕樣品，觀察樣品墊對(duì)樣品的過(guò)濾、吸收，以及樣品在NC膜上的層析和檢測(cè)線顯色情況，結(jié)果見表7。表7樣品墊選擇結(jié)果1樣品墊型號(hào)BX-SB06WFBQXLM樣品吸收情況吸收不完全吸收不完全吸收完全檢測(cè)線顯色情況－－＋由表7可知，BX-SB06、WFB對(duì)豆粕中各組分吸收能力非常差，使用這兩種材料作為樣品墊檢測(cè)豆粕時(shí)檢測(cè)線沒有顯色。QXLM雖然可以較大程度地吸收、過(guò)濾豆粕的蛋白等物質(zhì)，但對(duì)于豆粕的層析速度的提高還是有較大局限性，層析速度較慢，且顯色較淺。以上實(shí)驗(yàn)說(shuō)明采用卡殼形式測(cè)定豆粕等飼料原料時(shí)，使用以上三種樣品墊對(duì)于飼料原料中復(fù)雜組分的吸收過(guò)濾效果均不顯著，除非采取稀釋的方法，否則很難得到滿意的效果。但將樣品稀釋后再進(jìn)行檢測(cè)，不但會(huì)降低產(chǎn)品本身的靈敏度，而且增加了操作步驟，使試紙條便捷快速的優(yōu)勢(shì)大打折扣。所以，考慮其他反應(yīng)模式對(duì)飼料原料進(jìn)行檢測(cè)。向潔凈的酶標(biāo)板孔中加入10μL10%的金標(biāo)抗體，再將陰性豆粕樣品200μL加入其中，與孔內(nèi)金標(biāo)抗體混合均勻，分別取BX-SB06、WFB、QXLM三種材質(zhì)材料作為樣品墊組裝試紙條后，手持吸水紙?zhí)?，將樣品墊端插入盛有樣品-金標(biāo)抗體混合液中豎直放置，靜置5min后觀察結(jié)果。表8樣品墊選擇結(jié)果2樣品墊型號(hào)BX-SB06WFBQXLM樣品吸收情況吸收不完全吸收不完全吸收完全檢測(cè)線顯色情況＋＋＋＋＋由表8可知，采用插條方式進(jìn)行檢測(cè)時(shí)BX-SB06、WFB對(duì)豆粕中各組分吸收效果依然較差，雖然檢測(cè)線稍有顯色，但顯色很淺。QXLM作為樣品墊在插條模式中顯示出了極大的優(yōu)勢(shì)，不但對(duì)樣品過(guò)濾效果較好，而且層析速度相對(duì)快速，檢測(cè)線顯色明顯。這種直接向酶標(biāo)板孔中滴加樣品的模式，操作簡(jiǎn)便。所以，選擇QXLM作為樣品墊，并采用插條模式進(jìn)行檢測(cè)。2、層析條件的選擇（1）包被稀釋液和包被條件的篩選分別用A、B、C、D四種不同配方的稀釋液將包被原AFB1半抗原-OVA做一定梯度稀釋，在NC膜上點(diǎn)樣后烘干，組裝試紙條檢測(cè)陰性豆粕樣品，觀察顯色情況，結(jié)果見表9。表9包被稀釋液篩選結(jié)果包被原濃度（mg/mL）包被液ABCD0.025－－－＋0.5＋＋＋＋＋1＋＋＋＋＋＋＋＋＋2＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋由表9可知，使用不同的包被稀釋液，試紙條顯色結(jié)果有一定差異，其中包被稀釋液D在稀釋至0.025mg/mL時(shí)，NC膜上點(diǎn)樣著色照樣很深，而其他包被稀釋液在稀釋至0.025mg/mL時(shí)，顏色很淡或不顯色，故選擇包被稀釋液D作為實(shí)際用包被稀釋液。用包被稀釋液D將包被原稀釋至1mg/mL，在NC膜上點(diǎn)樣后分別置于37℃烘干和室溫（18~25℃）下自然干燥，時(shí)間設(shè)置為30min、1h、2h、8h、12h，組裝試紙條檢測(cè)陰性豆粕樣品，觀察顯色情況，結(jié)果見表10。表10包被條件篩選結(jié)果包被條件包被時(shí)間30min1h2h8h12h37℃＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋室溫（18~25℃）＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋由表10可知，點(diǎn)樣后，包被稀釋液在37℃烘干和室溫（18~25℃）自然干燥的不同包被時(shí)間差異不顯著。為減少外界因素對(duì)試驗(yàn)的影響，包被條件選擇37℃干燥8h。（2）封閉液和封閉條件的選擇為減少NC膜對(duì)反應(yīng)的非特異性影響，采用封閉液對(duì)NC膜進(jìn)行封閉，分別用A、B、C、D四種封閉液封閉，37℃溫育30min后，用PBST洗液清洗2次，自然干燥后組裝試紙條檢測(cè)陰性豆粕樣品，觀測(cè)膠體金在NC膜上的層析情況及檢測(cè)線的顯色情況，結(jié)果見表11。表11封閉液篩選結(jié)果封閉液ABCD顯色情況＋＋＋＋＋＋＋由表11可知，封閉液A封閉后得到的斑點(diǎn)顏色很深，作為背景的NC膜呈白色，同斑點(diǎn)顏色反差非常大，說(shuō)明封閉液A封閉效果很好，將NC膜上的一些結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了封閉，使金標(biāo)抗體不在NC膜上結(jié)合停留，除抗原點(diǎn)樣處為紅色外，NC膜其他位置都為白色。封閉液C封閉后得到的斑點(diǎn)顏色也很深，但NC膜上呈深淺不一的粉紅色，降低了斑點(diǎn)同背景的反差。封閉液B、D封閉后得到的斑點(diǎn)顏色較淺。說(shuō)明封閉液A的封閉效果比其他三種封閉液封閉效果好。包被抗原點(diǎn)樣后，用封閉液A以不同的封閉時(shí)間30min、1h、2h、8h、12h分別在室溫（18~25℃）、37℃條件下進(jìn)行封閉，組裝試紙條檢測(cè)陰性豆粕樣品，觀察膠體金在NC膜上的層析情況及檢測(cè)線的顯色情況，結(jié)果見表12。表12封閉條件篩選結(jié)果封閉時(shí)間30min1h2h8h12h37℃＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋室溫（18~25℃）＋＋＋＋＋＋＋＋＋由表12可知，抗原點(diǎn)樣后，37℃封閉2~12h和室溫條件下封閉12h均能得到著色較深、背景較淺的斑點(diǎn)。為縮短試驗(yàn)時(shí)間、減少外界因素對(duì)試驗(yàn)的影響，選擇的封閉條件為37℃封閉2h。（3）金標(biāo)抗體稀釋液和干燥條件的篩選分別用A、B、C、D、E五種不同配方的稀釋液將金標(biāo)抗體做1:1、1:2、1:3、1:4稀釋后，組裝試紙條檢測(cè)陰性豆粕樣品，觀察顯色情況，結(jié)果見表13。表13金標(biāo)抗體稀釋液篩選結(jié)果稀釋倍數(shù)金標(biāo)抗體稀釋液ABCDE1:1＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋1:2＋＋＋＋＋＋＋＋＋1:3－＋＋＋＋－1:4－－＋－－由表13可知，五種金標(biāo)抗體稀釋液顯色結(jié)果差異顯著，分析結(jié)果顯示經(jīng)稀釋液C稀釋1:4的金標(biāo)抗體滴加到NC膜上時(shí)仍能顯色，而同樣情況下，其他稀釋液不顯色，故選擇金標(biāo)抗體稀釋液C作為實(shí)際用金標(biāo)抗體稀釋液。用稀釋液C將金標(biāo)抗體稀釋到1:2，加入酶標(biāo)板孔中，選擇表14中的5種凍干條件進(jìn)行凍干機(jī)程序方案篩選。對(duì)比5種凍干方式所得結(jié)果如表15所示。表14金標(biāo)抗體干燥條件篩選程序凍干條件程序編號(hào)12345預(yù)凍程序-4℃30min0030min0-20℃1h1h01h0-50℃3h3h3h3h3h干燥程序-20℃3h3h3h3h3h10℃00010h10h25℃12h12h12h2h2h表15金標(biāo)抗體干燥條件篩選結(jié)果程序編號(hào)12345顯色情況＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋凍干狀態(tài)×○○×○注：○，代表凍干狀態(tài)良好，形狀規(guī)則，干燥完全；×，代表凍干狀態(tài)不能滿足生產(chǎn)需求，形狀不規(guī)則，干燥不完全。由表15可知，凍干程序4、5顯色均較好，3次之，1、2顯色較淺。凍干狀態(tài)2、3、5較好，呈規(guī)則形狀，干燥完全，1、4凍干不完全，成“蜂窩”狀，容易吸潮而影響顯色。綜合顯色與凍干狀態(tài)，選擇5號(hào)程序作為金標(biāo)抗體干燥條件，與金標(biāo)抗體稀釋液C配合使用。（4）樣品墊展開劑的篩選配制A、B、C、D、E五種不同展開劑作為樣品墊處理液，并將液體處理到QXLM上，組裝試紙條后配合已凍干的金標(biāo)抗體使用，對(duì)比五種展開劑對(duì)膠體金層析速度、樣品流動(dòng)性的作用及顯色情況。結(jié)果見表16。表16樣品墊展開劑篩選結(jié)果展開劑種類ABCDE顯色情況＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋層析速度（樣本到達(dá)吸水墊的時(shí)間/s）180165150175176由表16可知，不同展開劑對(duì)樣品的流動(dòng)速度及顯色差異較大。大體規(guī)律為層析速度越快，金標(biāo)抗體與C、T線有越充足的時(shí)間結(jié)合則顯色越深，不過(guò)展開劑D的層析速度較A快，但顯色比A淺，這可能是由于D中加入的表面活性劑影響了AFB1抗原抗體的結(jié)合。綜合考慮層析速度與顯色情況，選擇展開劑C作為樣品墊處理液適宜。（5）C、T線包被濃度及線寬的確定利用已確定的包被稀釋液將抗原與二抗分別進(jìn)行不同倍數(shù)稀釋，并制備成試紙條檢測(cè)，測(cè)試結(jié)果顯示：二抗或抗原濃度太低時(shí)，試紙條上的C、T線顏色偏淺，不利于觀察；抗原濃度太高則試紙條上T線太深，與C線對(duì)比反差明顯，且對(duì)檢測(cè)靈敏度有顯著影響。通過(guò)不斷對(duì)比試驗(yàn)，綜合考慮陰性顯色程度與陽(yáng)性樣品添加測(cè)試，確定在層析材料上的抗原濃度為0.12mg/mL，線寬為0.95μL/cm，二抗?jié)舛葹?.18mg/mL，線寬為1.0μL/cm。（四）試紙條的組裝試紙條的結(jié)構(gòu)如下所示：加樣后的樣品流動(dòng)方向圖5膠體金試紙條結(jié)構(gòu)示意圖圖6膠體金試紙條剖面結(jié)構(gòu)示意圖注：1為樣品墊、2為NC膜、3為吸水墊、4為檢測(cè)線、5為質(zhì)控線、6為PVC底板、7為保護(hù)膜樣品墊、NC膜和吸水墊依次按順序黏貼在PVC底板上，樣品墊的末端與NC膜的始端相連，NC膜的末端與吸水墊的始端相連，樣品墊的始端與底板的始端對(duì)齊，吸水墊的末端與底板的末端對(duì)齊；試紙黏貼有保護(hù)膜，保護(hù)膜覆蓋在樣品墊上，為檢測(cè)端，上面印有MAX字樣。（五）試紙條檢測(cè)過(guò)程的優(yōu)化1、樣品提取方法的研究在研制本方法的過(guò)程中，盡量簡(jiǎn)化樣品前處理的步驟，力求方法更加簡(jiǎn)單、快速。對(duì)于飼料原料樣品，一般需要簡(jiǎn)單的過(guò)篩、粉碎過(guò)程。試驗(yàn)摸索中發(fā)現(xiàn)，粉碎后的飼料原料樣品，需加入提取液進(jìn)行提取，將提取后的上清液加入到磷酸鹽緩沖液中，混勻后，點(diǎn)樣。具體試驗(yàn)過(guò)程如下：（1）樣品提取液的選擇取陰性豆粕樣品，及AFB1添加濃度分別為2μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg的陽(yáng)性豆粕樣品，經(jīng)過(guò)篩和粉碎后，各稱取(5.00±0.01)g到50mL離心管中，分別加入15mL濃度為80%的甲醇、氯仿、乙醇，渦動(dòng)3min，室溫3000r/min以上離心5min；取100μL上清液加入200μL0.01mol/L、pH7.2的磷酸鹽緩沖液混勻后，取200mL進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表17。表17樣品提取液的選擇添加濃度提取液甲醇氯仿乙醇0μg/kg＋＋＋—＋2μg/kg＋＋—＋5μg/kg＋——10μg/kg———20μg/kg———由表17可知，氯仿作為提取液時(shí)，干擾T線顯色機(jī)制而導(dǎo)致T線不顯色；乙醇作為提取液時(shí)，T線顯色淺；采用甲醇提取液，T線顯色深淺適中且梯度明顯，為最優(yōu)方案。（2）樣品提取液體積的選擇取陰性豆粕樣品，及AFB1添加濃度分別為2μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg的陽(yáng)性豆粕樣品，經(jīng)過(guò)篩和粉碎后，各稱取(5.00±0.01)g到50mL離心管中，分別加入5mL、10mL、15mL、20mL80%甲醇，渦動(dòng)3min，室溫3000r/min以上離心5min；取100μL上清液加入200μL0.01mol/L、pH7.2的磷酸鹽緩沖液混勻后，取200mL進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表18。表18樣品提取液體積的選擇添加濃度樣品提取液體積5mL10mL15mL20mL0μg/kg＋＋＋＋＋＋＋＋＋2μg/kg＋＋＋＋＋＋＋5μg/kg＋＋＋＋10μg/kg＋＋——20μg/kg—＋——由表18可知，樣品提取液體積為5mL、10mL時(shí)，提取不充分，使AFB1無(wú)法充分游離出來(lái)，導(dǎo)致T線顯色淺且梯度不明顯；樣品提取液體積為15mL、20mL時(shí)，T線顯色無(wú)明顯差異，考慮到實(shí)驗(yàn)的經(jīng)濟(jì)性，選擇樣品提取液體積為15mL，T線顯色深淺適中且梯度明顯，為最優(yōu)方案。（3）樣本稀釋液的選擇取陰性豆粕樣品，及AFB1添加濃度分別為2μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg的陽(yáng)性豆粕樣品，經(jīng)過(guò)篩和粉碎后，各稱取(5.00±0.01)g到50mL離心管中，加入15mL80%甲醇，渦動(dòng)3min，室溫3000r/min以上離心5min；取100μL上清液加入200μL樣本稀釋液（A：0.01mol/L、pH7.2的磷酸鹽緩沖液；B：0.02mol/L、pH7.2的磷酸鹽緩沖液；C：0.05mol/L、pH7.2的磷酸鹽緩沖液；D：0.1mol/L、pH7.2的磷酸鹽緩沖液）混勻后，取200mL進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表19。表19樣本稀釋液的選擇添加濃度樣本稀釋液ABCD0μg/kg＋＋＋＋＋＋2μg/kg＋＋＋＋＋5μg/kg＋＋＋＋10μg/kg—＋＋＋20μg/kg————由表19可知，采用B、C、D樣本稀釋液濃度過(guò)高，T線顯色淺，且不同濃度梯度下T線顯色無(wú)明顯梯度；采用A樣本稀釋液時(shí)，T線顯色深淺適中且梯度明顯，為最優(yōu)方案。（4）樣本稀釋液體積的選擇取陰性豆粕樣品，及AFB1添加濃度分別為2μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg的陽(yáng)性豆粕樣品，經(jīng)過(guò)篩和粉碎后，各稱取(5.00±0.01)g到50mL離心管中，加入15mL80%甲醇，渦動(dòng)3min，室溫3000r/min以上離心5min；取100μL上清液分別加入50μL、100μL、200μL、300μL0.01mol/L、pH7.2的磷酸鹽緩沖液混勻后，取200mL進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表20。表20樣本稀釋液體積的選擇添加濃度樣本稀釋液體積50μL100μL200μL300μL0μg/kg＋＋＋＋＋＋＋＋＋2μg/kg＋＋＋＋＋＋＋5μg/kg＋＋＋＋10μg/kg＋＋—＋20μg/kg—＋——由表20可知，樣本稀釋液體積為50μL時(shí)，T線顯色淺且梯度不明顯；樣本稀釋液體積為100μL時(shí)，顯色稍加深但梯度不明顯；當(dāng)樣本稀釋液體積為300μL時(shí)，檢測(cè)限濃度T線不消線；當(dāng)樣本稀釋液體積為200μL時(shí)，T線顯色深淺適中且梯度明顯，為最優(yōu)方案。由此可見，飼料原料樣品前處理方法為：試樣經(jīng)過(guò)篩、粉碎后，稱取(5.00±0.01)g至50mL離心管中，加入15mL80%甲醇，渦動(dòng)3min，室溫3000r/min以上離心5min，取100μL上清液加入200μL0.01mol/L、pH7.2的磷酸鹽緩沖液，混勻，待檢。2、孵育時(shí)間的研究把金標(biāo)抗體凍干在微孔中，組裝試紙條，檢測(cè)樣品。檢測(cè)前需要使用200μL經(jīng)上述1處理的待測(cè)樣品液加入微孔中充分溶解金標(biāo)抗體，分別孵育1min、2min、3min、5min、8min，之后插入試紙條，液體流動(dòng)時(shí)開始計(jì)時(shí)，反應(yīng)5min后觀察結(jié)果。取陰性豆粕樣品，及AFB1添加濃度分別為2μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg的陽(yáng)性豆粕樣品，用試紙條進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表21。表21孵育時(shí)間研究結(jié)果添加濃度孵育時(shí)間（min）123580μg/kg＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋2μg/kg＋＋＋＋＋＋＋＋5μg/kg＋＋＋＋＋10μg/kg＋＋＋—＋20μg/kg—————由表21可知，孵育時(shí)間為1min、2min、3min時(shí)，金標(biāo)抗體與樣品反應(yīng)不充分，T線顯色淺，顯色梯度不明顯；樣品處理時(shí)間為5min、8min時(shí)，T線顯色無(wú)明顯差異，考慮到金標(biāo)抗體與樣品反應(yīng)的充分性以及實(shí)驗(yàn)的快速性，選擇孵育時(shí)間為5min，T線顯色深淺適中且梯度明顯，為最優(yōu)方案。3、顯色時(shí)間的研究把金標(biāo)抗體凍干在微孔中，組裝試紙條，檢測(cè)樣品。檢測(cè)前需要使用200μL經(jīng)上述1處理的待測(cè)樣品液加入微孔中充分溶解金標(biāo)抗體，孵育5min，之后插入試紙條，液體流動(dòng)時(shí)開始計(jì)時(shí)，分別反應(yīng)3min、5min、8min、10min、15min后觀察結(jié)果。取陰性豆粕樣品，及AFB1添加濃度分別為2μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg的陽(yáng)性豆粕樣品，用試紙條進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表22。表22顯色時(shí)間研究結(jié)果添加濃度顯色時(shí)間（min）35810150μg/kg＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋2μg/kg＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋5μg/kg＋＋＋＋＋＋10μg/kg＋————20μg/kg－————由表22可知，顯色時(shí)間為3min時(shí)，NC膜上試劑展開不充分，T線顯色淺，顯色梯度不明顯；顯色時(shí)間為5min、8min、10min、15min時(shí)，T線顯色無(wú)明顯差異，考慮到試劑展開的充分性以及實(shí)驗(yàn)的快速性，選擇顯色時(shí)間為5min，T線顯色深淺適中且梯度明顯，為最優(yōu)方案。由此可見，飼料原料樣品檢測(cè)過(guò)程為：把金標(biāo)抗體凍干在微孔中，組裝試紙條，檢測(cè)前需要使用200μL經(jīng)處理的待測(cè)樣品液加入微孔中充分溶解金標(biāo)抗體，孵育5min，之后插入試紙條，液體流動(dòng)時(shí)開始計(jì)時(shí)，反應(yīng)5min后觀察結(jié)果。（六）檢測(cè)方法技術(shù)參數(shù)的確定1、檢測(cè)限取空白小麥、大米、黃豆、玉米、豆粕、花生粕、DDGS樣品各100份，按表23添加至工作濃度，經(jīng)樣品前處理后進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表24。表23添加樣品準(zhǔn)備添加濃度（μg/kg）小麥大米黃豆玉米豆粕花生粕DDGS020份20份20份20份20份20份20份220份20份20份20份20份20份20份520份20份20份20份20份20份20份1020份20份20份20份20份20份20份2020份20份20份20份20份20份20份合計(jì)100份100份100份100份100份100份100份表24檢測(cè)限確定樣品添加濃度（μg/kg）測(cè)定結(jié)果小麥0－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－2－－－－－－－－－－－－－－－－－＋－－5－－－＋－－－－－－－－－－－－－－－－10＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋20＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋大米0－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－2－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－5－－－－－－－－－－－－－－－－＋－－－10＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋20＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋黃豆0－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－2－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－5－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－10＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋20＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋玉米0－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－2－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－5－－－－－－－－－－＋－－－－－－－－－10＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋20＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋豆粕0－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－2－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－5－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－10＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋20＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋花生粕0－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－2－－－－－－－－－－－－－＋－－－－－－5－－－－－－－－－－－－－－－－－＋－－10＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋20＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋DDGS0－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－2－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－5－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－10＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋20＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋注：＋表示陽(yáng)性，－表示陰性。表25-表27同此注釋。結(jié)果表明：7種飼料原料樣品添加濃度為10μg/kg時(shí)，本檢測(cè)方法的測(cè)定結(jié)果均為陽(yáng)性，因此可以確定該方法檢測(cè)限為10μg/kg。2、假陽(yáng)性率取空白小麥、大米、黃豆、玉米、豆粕、花生粕、DDGS樣品各10份，5μg/kgAFB1添加的小麥、大米、黃豆、玉米、豆粕、花生粕、DDGS樣品各40份，經(jīng)樣品前處理后進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表25。統(tǒng)計(jì)假陽(yáng)性數(shù)，按照下列公式計(jì)算假陽(yáng)性率：假陽(yáng)性率（%）＝假陽(yáng)性數(shù)×100%50表25假陽(yáng)性率測(cè)定結(jié)果檢測(cè)樣品測(cè)定結(jié)果空白小麥－－－－－－－－－－5μg/kg－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－空白大米－－－－－－－－－－5μg/kg－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－空白黃豆－－－－－－－－－－5μg/kg－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－空白玉米－－－－－－－－－－5μg/kg－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－空白豆粕－－－－－－－－－－5μg/kg－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－空白花生粕－－－－－－－－－－5μg/kg－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－空白DDGS－－－－－－－－－－5μg/kg－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－檢測(cè)50份陰性樣品（10份空白和40份5μg/kgAFB1添加樣品），結(jié)果顯示：本檢測(cè)