基因敲除-文檔

基因敲除一、基因敲除技術(shù)簡(jiǎn)介二、基因敲除方法三、基因敲除技術(shù)的應(yīng)用前景一、基因敲除技術(shù)簡(jiǎn)介

基因敲除(geneknockout)又稱(chēng)基因打靶(genetargeting)是通過(guò)外源DNA與染色體DNA之間的同源重組,精細(xì)地定點(diǎn)修飾和改造基因DNA片段的技術(shù)。它是在胚胎干細(xì)胞技術(shù)和同源重組技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的,具有位點(diǎn)專(zhuān)一性強(qiáng)、打靶后目的片段可以與染色體DNA共同穩(wěn)定遺傳的特點(diǎn),目前已成為一種較理想的改造生物遺傳物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)方法。一、基因敲除技術(shù)簡(jiǎn)介:基因敲除是通過(guò)一定的途徑使機(jī)體內(nèi)特定的基因發(fā)生突變或缺失的技術(shù),通過(guò)觀察基因缺失引起的表型變化,進(jìn)而推測(cè)該基因的生物學(xué)功能。早期的基因敲除主要是利用DNA同源重組原理,通過(guò)設(shè)計(jì)同源片段替代靶基因片段,從而達(dá)到基因敲除的目的?；蚯贸硪弧⒒蚯贸夹g(shù)簡(jiǎn)介

研究現(xiàn)狀:至今，科學(xué)家們已經(jīng)分別敲除了一萬(wàn)多種小鼠基因（約占所有基因的一半），搞清了許多基因的功能，并建立起了五百多種動(dòng)物疾病模型。這對(duì)疾病的分子機(jī)理研究和疾病的基因治療來(lái)說(shuō)具有重大意義，也為改造生物、培育新的生物品種提供了可能性。在人類(lèi)基因組序列分析的結(jié)構(gòu)基因組學(xué)的研究完成后,基因敲除將成為在功能基因組學(xué)研究中最直接和最有效的方法之一。二、基因敲除的方法傳統(tǒng)基因敲除方法利用同源重組應(yīng)用隨機(jī)插入突變特點(diǎn):依賴(lài)于細(xì)胞內(nèi)自然發(fā)生的同源染色體的隨機(jī)交換，但在體細(xì)胞內(nèi)，基因同源重組的效率特別低(低于10－6)。增加了實(shí)際操作的工作量，限制了該項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用特點(diǎn):可以分為T(mén)-DNA插入突變和轉(zhuǎn)座子插入突變，兩者是在植物中使用廣泛的基因敲除手段該基因敲除(geneknock－out)技術(shù),是在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中發(fā)生外源打靶基因與核基因組目標(biāo)基因之間的DNA同源重組,能夠使外源基因定點(diǎn)地整合到核基因組的特定位置上,從而達(dá)到改變細(xì)胞遺傳特性的目的。利用隨機(jī)插入突變進(jìn)行基因敲除。大規(guī)模的隨機(jī)插入突變理論上可實(shí)現(xiàn)在基因組范圍內(nèi)敲除任一基因目。二、基因敲除的方法新興的基因敲除技術(shù)：1.利用RNA干擾引起的基因敲除RNA干擾(RNAin-terference，RNAi)是RNA依賴(lài)的基因沉默現(xiàn)象，是雙鏈RNA(doublestrandedRNA，dsRNA)分子在mRNA水平上誘發(fā)的序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)沉默。2.鋅指核酸酶基因打靶技術(shù)該技術(shù)是將特異性識(shí)別模塊和功能模塊融合，形成具有特定功能的蛋白，利用ZFNS（鋅指核酸酶）人為造成特定基因位點(diǎn)的DNA雙鏈切口(Doublestrandsbreaks，DSB),再利用細(xì)胞固有的同源重組或非同源末端連接修復(fù)機(jī)制進(jìn)行切口修復(fù)，從而實(shí)現(xiàn)高效率的基因定點(diǎn)修飾。二、基因敲除的方法

3.利用TALEN切割特定的核苷酸靶序列引起的基因敲除TALE蛋白中的DNA結(jié)合域與FokI核酸內(nèi)切酶的切割域融合，在特異的位點(diǎn)打斷目標(biāo)基因，進(jìn)而在該位點(diǎn)進(jìn)行DNA操作，如敲入(Knock－in)、敲出(Knock－out)或點(diǎn)突變。

4.Cas9基因敲除技術(shù)主要由細(xì)菌和古細(xì)菌通過(guò)一種不斷進(jìn)化適應(yīng)的免疫防御系統(tǒng)改造而成，II型CＲISPＲ/Cas9免疫系統(tǒng)依賴(lài)Cas9內(nèi)切酶家族靶向和剪切外源DNA。二、基因敲除的方法

CRISPER/Cas系統(tǒng)的由來(lái):CRISPR（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats）廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌的基因組中，是細(xì)菌和古細(xì)菌的一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以介導(dǎo)外源DNA的降解，從而抵御病毒等外來(lái)入侵者。1987年日本學(xué)者首次在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)該間隔重復(fù)序列。2002年，Jansen等將其正式命名為CRISPR，基因編碼的蛋白質(zhì)統(tǒng)稱(chēng)為CRISPR附屬蛋白（CRISPR-associationproteins，Cas）。CRISPR/Cas系統(tǒng)的分類(lèi):TypeⅠTypeⅡTypeⅢ三種不同類(lèi)型TypeⅡ系統(tǒng)的主要特征是包含一個(gè)標(biāo)志性的Cas9蛋白(分子質(zhì)量很大的多功能蛋白)參與crRNA的成熟以及降解入侵的噬菌體DNA或是外源質(zhì)粒。CRISPR/Cas的基因座結(jié)構(gòu)3'端為CRISPR基因座,由啟動(dòng)子區(qū)域和眾多的間隔序列(spacers)和重復(fù)序列(directrepeats)順序排列組成5'端為tracrRNA基因中間為一系列Cas蛋白編碼基因,包括Cas9,Cas1,Cas2和Csn2Cas9蛋白包含兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域,一個(gè)在N端,有類(lèi)似于Rucv核酸酶的活性,一個(gè)在中部有類(lèi)似HNH核酸酶的活性。編碼tracrRNA(trans-activatingcrRNA),其指導(dǎo)RNaseⅢ和Cas9完成前體crRNA的成熟隨后tracrRNA還能與成熟的crRNA的重復(fù)序列配對(duì)形成RNA二聚體,進(jìn)而和Cas9蛋白結(jié)合成核糖核蛋白復(fù)合體,發(fā)揮識(shí)別和降解入侵的外源DNA功能CRISPR的高度可變的間隔區(qū)(spacer)獲得視頻:芥末生化堂-CRISPR_標(biāo)清.flvCas9HNH結(jié)構(gòu)域切割互補(bǔ)DNA鏈,而RuvC樣結(jié)構(gòu)域切割非互補(bǔ)DNA鏈CRISPR/Cas系統(tǒng)的影響因素Cas9對(duì)系統(tǒng)的影響

tracrRNA和crRNA在DNA識(shí)別的過(guò)程中是必須的,可能是參與tracrRNA與目標(biāo)DNA定向結(jié)合tracrRNA對(duì)系統(tǒng)的影響tracrRNA保留23-48bp的序列就能夠支持Cas9催化的DNA切割。crRNA5’端截短10個(gè)堿基將會(huì)導(dǎo)致切割失敗,而從3’端截短10個(gè)堿基不影響切割。tracrRNA和crRNA完整性對(duì)系統(tǒng)的影響Protospacer準(zhǔn)確性對(duì)系統(tǒng)的影響Protospaer序列越靠近3’端準(zhǔn)確性越重要PAM對(duì)系統(tǒng)的影響CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用進(jìn)展·位點(diǎn)特異性基因編輯平臺(tái)·利用Cas9系統(tǒng)在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)·對(duì)目標(biāo)RNA序列進(jìn)行操縱·對(duì)基因組功能進(jìn)行篩查·作為DNA特定位點(diǎn)標(biāo)簽·實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的誘導(dǎo)調(diào)控三、基因敲除技術(shù)的應(yīng)